Name: طرق البحث في بلاستيدات الخضراء: استكشاف استهداف وتحديد مواقع وتفاعلات بروتينات البلاستيدات الخضراء (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-15T14:30:00.000+00:00
Duration: 2 min 45 s
Description: استكشف طرق استيراد وتحديد مواقع البروتينات في البلاستيدات الخضراء باستخدام Arabidopsis thaliana. تشمل التقنيات الفصل تحت الخلوي والتنقية بالتقارن والهجرة الكهربائية الأصلية لدراسة التفاعلات البروتينية.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol><li>Jarvis, P., López-Juez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biogenesis+and+homeostasis+of+chloroplasts+and+other+plastids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Biogenesis and homeostasis of chloroplasts and other plastids.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (12), 787-802 (2013).</li>
<li>Ling, Q., Jarvis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+protein+import+into+chloroplasts+isolated+from+stressed+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Analysis of protein import into chloroplasts isolated from stressed plants.</a> Journal of Visualized Experiments. (117), (2016).</li>
<li>Aronsson, H., Jarvis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+isolating+import-competent+Arabidopsis+chloroplasts%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">A simple method for isolating import-competent Arabidopsis chloroplasts.</a> FEBS Letters. 529 (2-3), 215-220 (2002).</li>
<li>Fitzpatrick, L. M., Keegstra, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+isolating+a+high+yield+of+Arabidopsis+chloroplasts+capable+of+efficient+import+of+precursor+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">A method for isolating a high yield of Arabidopsis chloroplasts capable of efficient import of precursor proteins.</a> Plant Journal. 27 (1), 59-65 (2001).</li>
<li>Ling, Q., Jarvis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+chloroplast+protein+import+by+the+ubiquitin+E3+ligase+SP1+is+important+for+stress+tolerance+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Regulation of chloroplast protein import by the ubiquitin E3 ligase SP1 is important for stress tolerance in plants.</a> Current Biology. 25 (19), 2527-2534 (2015).</li>
<li>Lee, J., Kang, H., Hwang, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+protein+import+into+chloroplasts+using+protoplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Studying protein import into chloroplasts using protoplasts.</a> Journal of Visualized Experiments. (142), (2018).</li>
<li>Asher, A., Ganesan, I., Klasek, L., Theg, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+physiologically+active+thylakoids+and+their+use+in+energy-dependent+protein+transport+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation of physiologically active thylakoids and their use in energy-dependent protein transport assays.</a> Journal of Visualized Experiments. (139), (2018).</li>
<li>Bouchnak, I., Moyet, L., Salvi, D., Kuntz, M., Rolland, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+chloroplast+sub-compartments+from+Arabidopsis+for+the+analysis+of+protein+Localization+by+immunoblotting+or+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Preparation of chloroplast sub-compartments from Arabidopsis for the analysis of protein Localization by immunoblotting or proteomics.</a> Journal of Visualized Experiments. (140), (2018).</li>
<li>Salvi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AT_CHLORO%3A+the+first+step+when+looking+for+information+about+subplastidial+localization+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">AT_CHLORO: the first step when looking for information about subplastidial localization of proteins.</a> Methods in Molecular Biology. 1829, 395-406 (2018).</li>
<li>Shanmugabalaji, V., Douet, V., Agne, B., Kessler, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Affinity+purification+of+chloroplast+translocon+protein+complexes+using+the+TAP+tag%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Affinity purification of chloroplast translocon protein complexes using the TAP tag.</a> Journal of Visualized Experiments. (141), (2018).</li>
<li>Kikuchi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Ycf2-FtsHi+heteromeric+AAA-ATPase+complex+is+required+for+chloroplast+protein+import%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">A Ycf2-FtsHi heteromeric AAA-ATPase complex is required for chloroplast protein import.</a> Plant Cell. 30 (11), 2677-2703 (2018).</li>
<li>Rantala, M., Paakkarinen, V., Aro, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+thylakoid+membrane+protein+complexes+by+blue+native+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Analysis of thylakoid membrane protein complexes by blue native gel electrophoresis.</a> Journal of Visualized Experiments. (139), (2018).</li>
<li>Kikuchi, S., Hirohashi, T., Nakai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+preprotein+translocon+at+the+outer+envelope+membrane+of+chloroplasts+by+blue+native+PAGE%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+and+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Characterization of the preprotein translocon at the outer envelope membrane of chloroplasts by blue native PAGE.</a> Plant and Cell Physiology. 47 (3), 363-371 (2006).</li>
<li>Chen, L. J., Li, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+megadalton+TOC-TIC+supercomplexes+as+major+mediators+of+protein+import+into+chloroplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Stable megadalton TOC-TIC supercomplexes as major mediators of protein import into chloroplasts.</a> Plant Journal. 92 (2), 178-188 (2017).</li>
<li>Jarvis, R. P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJarvis%2C+RP+%22Methods+in+Molecular+Biology%22">Methods in Molecular Biology</a>. JM, W. alker 775, Humana Press. New York City. 432(2011).</li>
<li>Jarvis, R. P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJarvis%2C+RP+%22Methods+in+Molecular+Biology%22">Methods in Molecular Biology</a>. JM, W. alker 774, Humana Press. New York City. 374(2011).</li>
</ol>

طرق البحث في بلاستيدات الخضراء: استكشاف استهداف وتحديد مواقع وتفاعلات بروتينات البلاستيدات الخضراء

Chloroplast Research Methods: Probing The Targeting, Localization And Interactions Of Chloroplast Proteins

Chloroplasts are the organelles that define plants1. Along with many other metabolic, developmental and signaling functions, chloroplasts are responsible ...

مرحبا بكم في مجموعات طرق JoVE حول طرق أبحاث البلاستيدات الخضراء التي أشرف عليها محررنا الضيف، بول جارفيس. تغطي هذه المجموعة مجموعة واسعة من تقنيات المختبر والتقنيات في الجسم الحي التي تميز تفاعلات البروتين داخل البلاستيدات الخضراء. يصف باحثون في جامعة أكسفورد طريقة في المختبر باستخدام بلاستيدات خضراء معزولة، يتم حضانها ببروتينات موسومة بالإشعاع لمراقبة امتصاصها.هذه الطريقة هي تطوير لأساليب سابقة استخدمت لدراسة استيراد البروتينات الخضراء في المختبر. بعد ذلك، بطريقة مكملة، يتم فحص استيراد بروتين البلاستيدات الخضراء في الجسم الحي. تستخدم هذه الطريقة التعبير العابر للبروتينات الكيميرية والبروتوبلاستات لفحص تغيرات حجم البروتين وتحديد الموقع عبر القطع المناعية والمجهر الفلوري.في هذا الفيديو المنهجي، فحص المؤلفون نظام الغشاء الثيلاكويدي الموجود في البلاستيدات الخضراء. عن طريق عزل الأغشية، يتم توضيح مسارات انتقال البروتين في البلاستيدات الخضراء بواسطة SDS-PAGE والتصوير الفسفوري. يستخدم الباحثون في فرنسا طرقا مختلفة للطرد المركزي لعزل الأقسام الفرعية الموجودة في البلاستيدات الخضراء.ثم يتم تحليل هذه الأجزاء الخلوية المعزولة بواسطة الضربات المناعية والبروتيوميات لتوفير معلومات حول التموقع تحت العضي لبروتينات البلاستيدات الخضراء. بعد ذلك، استخدم الباحثون السويسريون تنقية الألفة لمجمعات البلاستيدات الخضراء متعددة البروتين لفحص الآليات الجزيئية المشاركة في استيراد البروتين. تحديدا مركبات التحدث والبروتينات متعددة القراد المدمجة في أغشية المغلف.في نهج مكمل، يقوم العلماء بتوصيف مركب بروتين الثيلاكويد النباتي في الأرابيدوبسيس باستخدام بلو نيتيف PAGE، أو BN-PAGE، الذي يسمح بفصل مركبات البروتين في شكلها الأصلي والوظيفي. يتم تحليل المجمعات بشكل إضافي عبر صفحات SDS ثنائية الأبعاد. لقد لمحت للتو الطرق المختلفة المستخدمة لدراسة بروتينات البلاستيدات الخضراء في مجموعتنا لطرق JoVE.يمكنك مشاهدة المقالات بالتفصيل في صفحة مجموعة طرق أبحاث البلاستيدات الخضراء المعروضة على الرابط الموجود على الشاشة.

chloroplast-research-methods-probing-targeting-localization

Research

JoVE Journal

Biochemistry

الكيمياء الحيوية

ويهدف النهج وصفها النسبية، كمية البروتين في الحصول على نظرة ثاقبة لتكوين المجمعات multiprotein في ظل ظروف مختلفة، ويتجلى من خلال مقارنة سلالات مختلفة وراثيا. للتحليل الكمي يتم خلط كميات متساوية من كسور مختلفة من التدرج كثافة السكروز وتحليلها بواسطة مطياف الكتلة.

نهج جديد لتحليل مقارن لMultiprotein مجمعات بناء على<sup&gt; 15</sup&gt; N الأيض وصفها والكمية الطيف الكتلي

تشكيل مجمعات البروتين في الجسم الحي يمكن تصور من قبل ثنائي الجزيء تكامل مضان. وتنصهر شركاء التفاعل إلى أجزاء مكملة من العلامات الفلورية وأعرب عابر في أوراق التبغ، مما أدى إلى إعادة تشكيل إشارة الفلورسنت على مقربة من البروتينات اثنين.

البروتين البروتين التفاعلات تصور من قبل ثنائي الجزيء الإسفار التكملة في Protoplasts التبغ وأوراق

نحن هنا وصف طريقة جديدة لدراسة استيراد البروتين في البلاستيدات الخضراء المعزولة تحت الضغط. فإن هذه الطريقة سريعة ومباشرة، ويمكن تطبيقها على دراسة النتائج المترتبة على ظروف الإجهاد مختلفة لاستيراد البروتين بلاستيدات الخضراء، والآليات التنظيمية ذات الصلة.

تحليل استيراد البروتين في البلاستيدات الخضراء المعزولة من النباتات وشدد

هنا، نقدم بروتوكول الالتقاط إنتيراكتوم تطبيقها على أرابيدوبسيس ثاليانا أوراق ميسوفيل ورقة بروتوبلاستس. هذه الطريقة تعتمد بشكل حاسم على في الجسم الحي الأشعة فوق البنفسجية يشابك ويسمح لعزل وتحديد البروتينات مرنا مرتبط النبات من بيئة فسيولوجية.

مرنا إنتيراكتوم التقاط من بروتوبلاستس النبات

نقدم بروتوكولات هنا لعزل عالية الغلة من ثيلاكويدس النشطة فسيولوجيا وفحوصات البروتين النقل بلاستيدات الخضراء التوأم ارجينين إزفاء (كتات)، الافرازية (cpSec1)، وإشارة التعرف على مسارات الجسيمات (كبسرب).

عزل ثيلاكويدس النشطة فسيولوجيا واستخدامها في فحوصات البروتين الطاقة تعتمد على النقل

هنا يصف لنا وضع بروتوكول للتعبير عن البروتينات في بروتوبلاستس باستخدام أسلوب التحويل شماعة بوساطة. يوفر الأسلوب التعبير سهلة للبروتينات للفائدة، وتحقيق كفاءة الترجمة البروتين وعملية الاستيراد لمختلف الظروف التجريبية المجراة في.

دراسة البروتين استيراد المعايشة باستخدام بروتوبلاستس

ونقدم هنا بروتوكول المجربة والمختبرة لتنقية بلاستيدات الخضراء البروتين استيراد المجمعات (مجمع عرة TOC) باستخدام علامة الحنفية. البروتوكول والعزل تقارب خطوة واحدة يحتمل أن يمكن تطبيقها على أي البروتين ويستخدمها الكتلي التعرف على شركاء جدد من التفاعل.

انجذاب تطهير المجمعات البروتين ترانسلوكون بلاستيدات الخضراء باستخدام علامة الحنفية

هنا، يمكننا وصف أسلوب لتنقية المعايشة سليمة من أوراق نبات وعلى المقصورات الفرعية الرئيسية الثلاثة (المغلف، سدى، وثيلاكويدس)، باستخدام مزيج من سينتريفوجيشنز التفاضلية، التدرجات بركل المستمر، و تدرجات السكروز متقطع. الأسلوب قيمة بالنسبة سوببلاستيديال والترجمة سوبسيلولار للبروتينات إيمونوبلوتينج والبروتينات.

إعداد الأقسام الفرعية بلاستيدات الخضراء من نبات لتحليل البروتين التعريب Immunoblotting أو البروتيوميات

تقوم العديد من الأنواع النباتية بتغيير موضع البلاستيدات الخضراء لتحسين امتصاص الضوء. يصف هذا البروتوكول كيفية استخدام أداة مباشرة مبنية في المنزل للتحقيق في حركة البلاستيدات الخضراء في أوراق أرابيدوبسيس ثاليانا باستخدام التغيرات في انتقال الضوء عبر ورقة كوكيل.

استخدام التغيرات في انتقال الأوراق للتحقيق في حركة البلاستيدات الخضراء في أرابيدوبسيس ثاليانا

نمت الحاجة إلى مناهج جديدة لدراسة مواقع الاتصال الغشائية (MCSs) بسبب الاهتمام المتزايد بدراسة هذه الهياكل الخلوية ومكوناتها. هنا ، نقدم بروتوكولا يدمج تقنيات الفحص المجهري المتاحة سابقا لتحديد وقياس مجمعات البروتين داخل العضيات وبين العضيات الموجودة في MCSs.

التصور والقياس الكمي لتفاعلات البروتين داخل العضيات الداخلية في مواقع الاتصال ER-Mitochondria عن طريق مقايسات ربط القرب

استكشف طرق استيراد وتحديد مواقع البروتينات في البلاستيدات الخضراء باستخدام Arabidopsis thaliana. تشمل التقنيات الفصل تحت الخلوي والتنقية بالتقارن والهجرة الكهربائية الأصلية لدراسة التفاعلات البروتينية.

طرق البحث في بلاستيدات الخضراء: استكشاف استهداف وتحديد مواقع وتفاعلات بروتينات البلاستيدات الخضراء

استكشف المزيد من الفيديوهات