Name: تصنيع مستقبلات مستضد تشياريك (CAR) خلايا T للعلاج المناعي بالتبني (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-17T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 51 s
Description: اكتشف طريقة تصنيع خلايا T مستقبلات مستضد تشياريك (CAR) للعلاج المناعي بالتبني مع الحفاظ على كفاءتها الوظيفية. تساعد هذه التقنية الباحثين في تحسين فعالية العلاج ضد الأورام الصلبة.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

وقد تم دعم هذا العمل جزئيا من خلال التمويل الذي قدمته شركه نوفارتس للادويه من خلال تحالف بحثي مع جامعه بنسلفانيا (مايكل c. Milone) ، فضلا عن جائزه العالم لمؤسسه سانت بالدريك (سابا غاسيمي).

تمت الموافقة علي جميع الدراسات الحيوانية من قبل لجنه الرعاية الحيوانية المؤسسية والاستخدام من جامعه بنسلفانيا.
1. T تنشيط الخلية ، والتوصيل ، والتوسع
<ol><li>تنشيط الخلايا الاساسيه البشرية الاوليه الطازجة أو بالتبريد عن طريق خلط مع الخرز المغناطيسي المضادة CD3/CD28 (علي سبيل المثال ، الأذان) بنسبه 3 حبات لكل خليه T في 6-حسنا الثقافة الخلية الاطباق. الخلايا T الثقافة في X-فيفو 15 المتوسطة تستكمل مع 5 ٪ الإنسان العادي AB المصل ، 2 مم L-الجلوتامين ، 20 مم HEPES ، و IL2 (100 وحده/مل). الحفاظ علي خلايا T في تركيز 106 خلايا t/مل خلال التوسع. الخلايا T الثقافة في 37 درجه مئوية ، 20 ٪ O2، و 95 ٪ الرطوبة مع 5 ٪ CO2.</li>
	<li>بعد التحفيز بين عشيه وضحيها ، أضافه لينتيفيرال ماده طافي لتنشيط الخلايا T. يحسب الحجم من [سوبرننت] ضرورية ان يحقق تعدد التلوث ([موي]) من 3 − 5. ملاحظه: CD19 bbζ لينتيفيروس البلازميد يتكون من المفصلي CD8, 4-1bb مجال كوستيمولاتوري, و CD3ζ يشير المجال21. CD19-bbζ لينتيفيرال تم إنشاء ماده طافي كما هو موضح سابقا21.</li>
	<li>في اليوم 3 ، وجمع الأعذار ممثل من الخلايا للحجز بالتبريد. قبل الحجز بالتبريد ، قم بازاله الخرز المغناطيسي بواسطة التغليف اللطيف والفصل المغناطيسي. اعداد تجميد المتوسطة التي تحتوي علي الفوسفات-مخزنه المالحة (التلفزيونية) مع 0.5 ٪ ثنائي ميثيل سولفوكسيد (DMSO) وتخزينها في 4 درجه مئوية حتى الاستخدام.<ol>
<li>الخلايا الطاردة المركزية T في 300 x g لمده 5 دقائق تجاهل ماده طافي وأضافه 5 مل من تلفزيوني. خلايا الطرد المركزي في 300 x g لمده 5 دقائق وتجاهل تلفزيوني.</li>
		<li>أعاده تعليق بيليه الخلية في 1 مل من المتوسطة الباردة التبريد. تجميد الخلايا T في حاويه تجميد المبردة وتخزين في-80 درجه مئوية ل 48 h. نقل الخلايا المجمدة إلى النيتروجين السائل.</li>
	</ol>
</li>
	<li>غسل بقية الخلايا T مره واحده في 5 مل من تلفزيوني للقضاء علي ناقلات المتبقية. جهاز الطرد المركزي في 300 x g لمده 5 دقيقه. DECANT التلفزيونية وأعاده تعليق بيليه الخلية في المتوسطة خليه T الثقافة في تركيز 0.5 x 106 خلايا/مل.</li>
	<li>تقسيم الخلايا T إلى ثقافتين ، المخصصة لليوم 5 واليوم 9. العد الخلايا T عن طريق تدفق الخلوية باستخدام الخرز العد (جدول المواد) والأجسام المضادة الاحاديه إلى الإنسان CD8 ، وكذلك صبغالقدرة علي البقاء (جدول المواد).<ol>
<li>لقياس تركيز الخلية T ، واعداد مزيج رئيسي يحتوي علي 500 μL من تلفزيوني ، 5 μL من الخرز العد ، 10 μL من 7-امينو-اكتيميمايسين د حل الخلية البقاء علي قيد الوجود ، 4 μL من CD8 و 4 μL من الناقلات المدرعة. أضافه 40 μL من الخلايا T إلى المزيج الرئيسي وقياس تركيز الخلية عن طريق تدفق الخلوية علي أساس عدد من الخلايا الحية T/حبه التهم. أعاده تغذيه للحفاظ علي الثقافات بتركيز 0.5 × 106 خلايا/مل كل يوم.</li>
	</ol>
</li>
	<li>في اليوم 5 ، والعد والبرد اليوم 5 الثقافات كما هو موضح في الخطوات 1.3 و 1.5.</li>
	<li>في اليوم 7, غسل 0.5 x 106 خلايا T في التلفزيونية وأعاده التعليق في 100 μl من مضان الخلية تنشيط الفرز (facs) المخزن المؤقت. الكشف عن التعبير البروتين سطح السيارة عن طريق المناعة مع فلوريسسينتلي-مترافق المضادة لCAR19 النمط الخلوي التدفق.</li>
	<li>في اليوم 9 ، عد اليوم 9 الثقافات والتبريد كما هو موضح في الخطوة 1.3.</li>
</ol>2-تقييم التنميط الظاهري لتمايز الخلايا التائية
<ol><li>اعداد مزيج رئيسي يحتوي علي الأجسام المضادة قبل معايره لمكافحه CD3-BV605 (استنساخ OKT3) ، المضادة لCD14-المحيط الهادئ الأزرق (PB) (استنساخ HCD14) ، المضادة لCD19-PB (استنساخ HIB19) ، المضادة لل-الBV510 (استنساخ OKT4) ، المضادة لCD8-H7APC (استنساخ SK1 150503) المضادة لCD45RO-PE (استنساخ UCHL1) ، المضادة لCD27-PE-Cy7 (استنساخ 1A4CD27) ، ومكافحه الCD95-PerCP-Cy 5.5 (استنساخ DX2) ، ومكافحه الCAR19-APC.</li>
	<li>اعداد مضان الفردية ناقص واحد (FMO) الضوابط لمكافحه CD45RO-PE ، المضادة لCCR7-FITC ، المضادة لCD27-PE-Cy7 ومكافحه الCD95-PerCP-Cy 5.5 للتمييز بين الخلايا الملونة إيجابيا من الخلفية.</li>
	<li>اعداد حل تلطيخ الخلية الميتة عن طريق تمييع الحية/الميتة كاشف الأسهم (جدول المواد) 1:10000 في الاذاعه التلفزيونية.</li>
	<li>ذوبان اليوم 3 ، اليوم 5 ، واليوم 9 خلايا T التي كانت في السابق بالتبريد. أجهزه الطرد المركزي 1 × 106 خلايا T من كل مجموعه في 300 x g لمده 3 دقائق. تجاهل سوبرناتانت. اغسل الخلايا مره واحده مع تلفزيوني. الطرد المركزي في 300 x g لمده 3 دقائق وتجاهل تلفزيوني.</li>
	<li>مزيج الخلايا التائية مع حل تلطيخ الميت لمده 15 دقيقه في درجه حرارة الغرفة (RT) ، محمية من الضوء.</li>
	<li>أضافه 1 مل من العازلة FACS لإخماد صبغ الخلية الميتة تلطيخ. جهاز الطرد المركزي في 300 x g لمده 3 دقائق ، وتجاهل ماده طافي وأعاده تعليق بيليه الخلية في 100 μl من العازلة facs التي تحتوي علي كوكتيل الأجسام المضادة الموصوفة في الخطوة 2.1 و 2.2. احتضان لمده 1 ساعة في 4 درجه مئوية.</li>
	<li>أضافه 1 مل من العازلة FACS وأجهزه الطرد المركزي في 300 x g ل 3 دقيقه لغسل قباله الأجسام المضادة غير منضم. كرر ثلاث مرات مع المخزن المؤقت FACS.</li>
	<li>أعاده التوقف المرحلي الخلايا في 1 ٪ بارافورمالدهيد (PFA) وتخزين في 4 درجه مئوية.</li>
	<li>كما يقلل التعبير CD45RO بعد التثبيت ، وتحليل العينات من خلال تدفق الخلوي بعد المناعي. لتقييم التمايز ، بوابه بالترتيب التالي: singlets (FSC-H مقابل FSC-A) ، يعيشCD3 + T الخلايا (تفريغ [الحية الميتة البنفسج ، CD14 الرصاص و CD19 الرصاص مقابل CD3 BV605] ، الBV510 vs CD8-APC-H7). فيCD8 + والفرعية ، بوابه علي CD45RO vs CCR7-fitc لتعريف الخلايا الساذجة مثل T (CD45RO-CCR7 +) ، الطب العام الفرعي (CD45RO +CCR7 +) ، تيم (CD45RO +CCR7-) ، و Tte(CD45RO-CCR7-). لتحديد Tscm ، بوابه عليCD27 + t الخلايا في الخلايا الساذجة مثل t السكان. في هذه المقصورة ، Tscm هيCD95 + و TN هي CD95-.</li>
</ol>3. التحليل الوظيفي في المختبر
<ol><li>انتشار الخلايا التائية وإفراز السايسيسين
	<ol>
<li>تحقق من التعبير السيارة وكذلك سلامه الخلية كما هو موضح في الخطوات 1.5 و 1.7 ، من خلال تدفق الخلوية.</li>
		<li>غسل 5 × 106 خلايا T من كل مجموعه (اليوم 3 ، اليوم 5 واليوم 9) مع تلفزيوني وأعاده التعليق في محلول 1 μM من كاربوكسيفلوريسسين دياسيتات النجاح استر (cfse) في الاذاعه التلفزيونية لمده 3.5 دقيقه في RT.</li>
		<li>فورا أضافه 10 مل من التلفزيونية التي تحتوي علي 10 ٪ الجنين البقري المصل (الدم) لإرواء رد الفعل.</li>
		<li>الطرد المركزي الحل في 300 x g لمده 3 دقائق تجاهل ماده طافي وكرر هذه الخطوة يغسل ثلاث مرات. عد الخلايا في ختام التلطيخ CFSE باستخدام عداد كولتر (جدول المواد).</li>
		<li>حصاد الخلايا الملونة CFSE (غير محفز) ، أعاده التعليق في 1 ٪ PFA وتخزين في 4 درجه مئوية للتحليل عن طريق تدفق الخلوي.</li>
		<li>احتضان العدد المطلوب من خلايا السيارات الملونة CFSE مع المشع K562-CD19 (الهدف) وكذلك K562 البرية نوع (السيطرة) الخلايا بنسبه 1:1 ل 120 h في الثقافة الحرة السايسيسين المتوسطة والظروف الثقافية كما هو موضح في الخطوة 1.1.</li>
		<li>بعد 24 ساعة ، الطرد المركزي السفينة الثقافة في 300 x g لمده 5 دقائق جمع 120 μl من supernatant الخلوية. تقييم إنتاج تعتمد علي التنشيط من IL2 ، IFNγ ، TNFα ، GM-السائل الدماغي الشوكي ، وغيرها من الخلوية التهابيه (IL1β ، IL4 ، IL5 ، IL6 ، IL8 ، و IL10) من قبل تحليلات لومينكس وفقا لتوصيات الشركة المصنعة.</li>
		<li>استبدل حجم السوبر الذي تم جمعه في الخطوة 3.1.7 بحجم مكافئ (120 μL) من الوسط الطازج.</li>
		<li>في اليوم 3 (اي ، بعد 96 h) ، عد وأعاده تغذيه في تركيز 0.5 x 106 خلايا/مل باستخدام حبه المستندة إلى تدفق الخلوية كما كان سابقا في الخطوة 1.5.</li>
		<li>في اليوم 5 ، عد الخلايا الحيةCD3 + وحساب التغيير اضعاف الخلايا t الحية نسبه إلى عدد الخلايا t الحية في اليوم 0.</li>
		<li>اجراء تحليل شامل لتخفيف CFSE في تقسيم خلايا السيارات T باستخدام برنامج FlowJo لتسليط الضوء علي الجولات المتعاقبة من انقسام الخلايا. ملاحظه: يتم وصفها بشكل جيد اختبارات الانتشار في دليل FlowJo.</li>
	</ol></li>
	<li>فحص السمية الخلوية ملاحظه: يتم تقييم قدره الخلايا CART19 لقتل الخلايا المستهدفة التعبير عن CD19 باستخدام 51Cr الإفراج عن الفحص.<ol>
<li>تسميه الخلايا المستهدفة عن طريق خلط 5 × 105 K562-CD19 ، خلايا التحكم في النوع K562 البرية ، أو خلايا سرطان الدم NALM6 مع 50 Μl من Na251CRO4 و 0.5 mL من rpmi تستكمل مع 10 ٪ سلاح ل90 دقيقه في حاضنه في 37 درجه مئوية.</li>
		<li>خلايا الطرد المركزي في 300 x g ل 2.5 دقيقه. تجاهل ماده طافي المشعة في سلال التخلص المناسبة وغسل الخلايا المستهدفة في 5 مل من تلفزيوني. كرر خطوات الغسيل مرتين.</li>
		<li>أعاده تعليق الخلايا المستهدفة في وسط الفينول الخالي من اللون الأحمر الذي يحتوي علي 5%. استخدم هذه الوسيلة لبقية الاجراء لتقليل الخلفية.</li>
		<li>بعد تقييم التعبير السيارة والقدرة علي البقاء الخلية عن طريق التدفق الخلوي (كما هو موضح في القسم 5.1) ، مزيج الخلايا السيارات T مع الخلايا المستهدفة المسمية في المستجيب: نسب الهدف (E:T) من 10:1 ، 3:1 و 1:1 ، في ثلاث نسخ. نقل إلى لوحه أسفل U 96.</li>
		<li>بالتوازي ، وتشمل الخلايا المستهدفة وحدها ، والخلايا المستهدفة مع 1 ٪ كبريتات الصوديوم دوديسيل (SDS) ، لتحديد عفويه (S) والحد الأقصى (M) 51Cr الإفراج ، علي التوالي.</li>
		<li>خلايا الطرد المركزي في 300 x g لمده 5 دقائق واحتضان لمده 4 ساعات أو 20 ح في 37 درجه مئوية حاضنه مع 5 ٪ CO2.</li>
		<li>بعد الوقت المحدد ، الطرد المركزي السفينة الثقافة في 300 x g لمده 5 دقائق جمع 35 μl من ماده طافي الخلوية ونقل إلى لوحه القارئ. تجنب فقاعات. دع الصفيحة تجف بين عشيه وضحيها.</li>
		<li>ختم لوحه مع ختم لوحه القياسية والعد مع عداد التلالؤ السائل. وفره الكروم في ماده طافي يوفر وكيلا للقتل الخلية المستهدفة. احسب النسبة المئوية لتحلل المحددة علي النحو التالي: 100 x (عدد الإصدارات التجريبية للدقيقة الواحدة-إصدار S لكل دقيقه)/(إصدار لكل الف ظهور – إصدار النسخة الشهرية).</li>
	</ol></li>
</ol>4. في فيفو التحليل الوظيفي
<ol><li>الحصول علي الفئران التي تبلغ من العمر 6 −10 أسابيع ، والتي تفتقر إلى نظام المناعة التكيفيه ، وتعيينها لمجموعه العلاج/ التحكم بشكل عشوائي.</li>
	<li>حقن الحيوانية عن طريق الوريد الذيل مع 1 × 106 خلايا NALM6 في 0.1 mL العقيمة تلفزيوني.</li>
	<li>بعد 5 − 7 أيام ، تاكد من الأورام بواسطة التصوير الضوئي الإحيائي (BLI). حقن 150 مغ/كغ من D-luciferin إلى الفئران التي تم تخديرها مع ايزوفلونان (حجم يعتمد علي كتله الجسم).</li>
	<li>قياس قيم التلالؤ البيولوجي باستخدام نظام التصوير. قياس التدفق الإجمالي باستخدام البرامج المناظرة عن طريق رسم مستطيلات من منطقه مماثله حول الفئران ، والوصول من الراس إلى 50 ٪ من طول الذيل. اطرح الخلفية لكل صوره علي حده.</li>
	<li>بعد إنشاء ابيضاض الدم ، حقن 3 × 106 يوم 9 CART19 الخلايا ، 0.5 x 106 يوم 3 سيارة تي الخلايا ، أو المقابلة غير محوله (ntd) الإنسان الخلايا t عبر الوريد الذيل في حجم 100 μl من العقيمة تلفزيوني/Ca2 +. ملاحظه: وبما ان النشاط الحيوي للخلايا التي يتم حصادها علي فترات مختلفه اثناء عمليه الاستزراع مختلف ، فان التركيز المختار للخلايا اليومية الثالثة اقل من اليوم التاسع.</li>
	<li>لتحديد تطور المرض ، قياس القيم البيولوجية مرتين في الأسبوع كما هو موضح أعلاه في الخطوة 4.3.</li>
	<li>لتحديد الخلية السيارة T الطلاء ، وجمع 75 μL الدم عن طريق النزيف المداري الرجعية في أنبوب المغلفة أدتا. نقل 50 μL من الدم إلى أنابيب العد المطلق.</li>
	<li>وصمه عار الدم مع الأجسام المضادة ضد CD45 ، CD8 و CAR لمده 30 دقيقه في RT. أضافه 400 μL من 1x FACS ليسينج حل للأنابيب ودوامه جيدا. بعد تلطيخ ، وتحليل التعبير علامة السطح عن طريق تدفق الخلوي. ملاحظه: ويمكن استخدام علامات السطح الأخرى لتقييم حاله التمايز والإرهاق للخلايا التائية في الدم.</li>
	<li>لقياس مستويات السايتوكينات في الدم ، والدم الطارد المركزي في 1,200 x g لمده 30 دقيقه في 4 درجه مئوية لفصل المصل من الطبقة العليا من الدم.</li>
	<li>جمع المصل وقياس السايتوكينات مع لوحه القارئ المعين وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.</li>
</ol>

<ol><li>Brentjens, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD19-targeted+T+cells+rapidly+induce+molecular+remissions+in+adults+with+chemotherapy-refractory+acute+lymphoblastic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">CD19-targeted T cells rapidly induce molecular remissions in adults with chemotherapy-refractory acute lymphoblastic leukemia.</a> Science Translational Medicine. 5 (177), 177ra138(2013).</li>
<li>Grupp, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor-modified+T+cells+for+acute+lymphoid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor-modified T cells for acute lymphoid leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 368 (16), 1509-1518 (2013).</li>
<li>Kalos, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+Cells+with+Chimeric+Antigen+Receptors+Have+Potent+Antitumor+Effects+and+Can+Establish+Memory+in+Patients+with+Advanced+Leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">T Cells with Chimeric Antigen Receptors Have Potent Antitumor Effects and Can Establish Memory in Patients with Advanced Leukemia.</a> Science Translational Medicine. 3 (95), 95ra73(2011).</li>
<li>Kochenderfer, J. N., Rosenberg, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treating+B-cell+cancer+with+T+cells+expressing+anti-CD19+chimeric+antigen+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Treating B-cell cancer with T cells expressing anti-CD19 chimeric antigen receptors.</a> Nature Reviews. Clinical Oncology. 10 (5), 267-276 (2013).</li>
<li>Maude, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor+T+cells+for+sustained+remissions+in+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor T cells for sustained remissions in leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 371 (16), 1507-1517 (2014).</li>
<li>Porter, D. L., Levine, B. L., Kalos, M., Bagg, A., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor-modified+T+cells+in+chronic+lymphoid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor-modified T cells in chronic lymphoid leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 365 (8), 725-733 (2011).</li>
<li>Porter, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor+T+cells+persist+and+induce+sustained+remissions+in+relapsed+refractory+chronic+lymphocytic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor T cells persist and induce sustained remissions in relapsed refractory chronic lymphocytic leukemia.</a> Science Translational Medicine. 7 (303), 303ra139(2015).</li>
<li>Maude, S. L., Teachey, D. T., Porter, D. L., Grupp, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD19-targeted+chimeric+antigen+receptor+T-cell+therapy+for+acute+lymphoblastic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">CD19-targeted chimeric antigen receptor T-cell therapy for acute lymphoblastic leukemia.</a> Blood. 125 (26), 4017-4023 (2015).</li>
<li>Kochenderfer, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphoma+Remissions+Caused+by+Anti-CD19+Chimeric+Antigen+Receptor+T+Cells+Are+Associated+With+High+Serum+Interleukin-15+Levels%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Lymphoma Remissions Caused by Anti-CD19 Chimeric Antigen Receptor T Cells Are Associated With High Serum Interleukin-15 Levels.</a> Journal of Clinical Oncology. 35 (16), 1803-1813 (2017).</li>
<li>Bollard, C. M., Rooney, C. M., Heslop, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-cell+therapy+in+the+treatment+of+post-transplant+lymphoproliferative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">T-cell therapy in the treatment of post-transplant lymphoproliferative disease.</a> Nature Reviews. Clinical Oncology. 9 (9), 510-519 (2012).</li>
<li>Brestrich, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adoptive+T-cell+therapy+of+a+lung+transplanted+patient+with+severe+CMV+disease+and+resistance+to+antiviral+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Adoptive T-cell therapy of a lung transplanted patient with severe CMV disease and resistance to antiviral therapy.</a> American Journal of Transplantation. 9 (7), 1679-1684 (2009).</li>
<li>Savoldo, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+solid+organ+transplant+recipients+with+autologous+Epstein+Barr+virus-specific+cytotoxic+T+lymphocytes+%28CTLs%29%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Treatment of solid organ transplant recipients with autologous Epstein Barr virus-specific cytotoxic T lymphocytes (CTLs).</a> Blood. 108 (9), 2942-2949 (2006).</li>
<li>Berger, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adoptive+transfer+of+effector+CD8%2B+T+cells+derived+from+central+memory+cells+establishes+persistent+T+cell+memory+in+primates%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Adoptive transfer of effector CD8+ T cells derived from central memory cells establishes persistent T cell memory in primates.</a> The Journal of Clinical Investigation. 118 (1), 294-305 (2008).</li>
<li>Gattinoni, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+human+memory+T+cell+subset+with+stem+cell-like+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A human memory T cell subset with stem cell-like properties.</a> Nature Methods. 17 (10), 1290-1297 (2011).</li>
<li>Hinrichs, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adoptively+transferred+effector+cells+derived+from+naive+rather+than+central+memory+CD8%2B+T+cells+mediate+superior+antitumor+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Adoptively transferred effector cells derived from naive rather than central memory CD8+ T cells mediate superior antitumor immunity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (41), 17469-17474 (2009).</li>
<li>Klebanoff, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+memory+self%2Ftumor-reactive+CD8%2B+T+cells+confer+superior+antitumor+immunity+compared+with+effector+memory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Central memory self/tumor-reactive CD8+ T cells confer superior antitumor immunity compared with effector memory T cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (27), 9571-9576 (2005).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engraftment+of+human+central+memory-derived+effector+CD8%2B+T+cells+in+immunodeficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Engraftment of human central memory-derived effector CD8+ T cells in immunodeficient mice.</a> Blood. 117 (6), 1888-1898 (2011).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+naive+and+central+memory+derived+CD8%2B+effector+cell+engraftment+fitness+and+function+following+adoptive+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncoimmunology%22%5BJournal%5D)">Comparison of naive and central memory derived CD8+ effector cell engraftment fitness and function following adoptive transfer.</a> Oncoimmunology. 5 (1), e1072671(2016).</li>
<li>Fraietta, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determinants+of+response+and+resistance+to+CD19+chimeric+antigen+receptor+%28CAR%29+T+cell+therapy+of+chronic+lymphocytic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Determinants of response and resistance to CD19 chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy of chronic lymphocytic leukemia.</a> Nature Medicine. 24 (5), 563-571 (2018).</li>
<li>Ghassemi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reducing+Ex+Vivo+Culture+Improves+the+Antileukemic+Activity+of+Chimeric+Antigen+Receptor+%28CAR%29+T+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunology+Research%22%5BJournal%5D)">Reducing Ex Vivo Culture Improves the Antileukemic Activity of Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells.</a> Cancer Immunology Research. 6 (9), 1100-1109 (2018).</li>
<li>Milone, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+receptors+containing+CD137+signal+transduction+domains+mediate+enhanced+survival+of+T+cells+and+increased+antileukemic+efficacy+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+therapy+%3A+the+journal+of+the+American+Society+of+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Chimeric receptors containing CD137 signal transduction domains mediate enhanced survival of T cells and increased antileukemic efficacy in vivo.</a> Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 17 (8), 1453-1464 (2009).</li>
<li>Cieri, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-7+and+IL-15+instruct+the+generation+of+human+memory+stem+T+cells+from+naive+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">IL-7 and IL-15 instruct the generation of human memory stem T cells from naive precursors.</a> Blood. 121 (4), 573-584 (2013).</li>
<li>Cui, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-7-Induced+Glycerol+Transport+and+TAG+Synthesis+Promotes+Memory+CD8+T+Cell+Longevity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">IL-7-Induced Glycerol Transport and TAG Synthesis Promotes Memory CD8 T Cell Longevity.</a> Cell. 161 (4), 750-761 (2015).</li>
<li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Closely+related+T-memory+stem+cells+correlate+with+in+vivo+expansion+of+CAR.CD19-T+cells+and+are+preserved+by+IL-7+and+IL-15%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Closely related T-memory stem cells correlate with in vivo expansion of CAR.CD19-T cells and are preserved by IL-7 and IL-15.</a> Blood. 123 (24), 3750-3759 (2014).</li>
<li>Singh, N., Perazzelli, J., Grupp, S. A., Barrett, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+memory+phenotypes+drive+T+cell+proliferation+in+patients+with+pediatric+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Early memory phenotypes drive T cell proliferation in patients with pediatric malignancies.</a> Science Translational Medicine. 8 (320), 320ra323(2016).</li>
</ol>

وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.

هنا ونحن وصف النهج لقياس وظيفة وفعالية الخلايا السيارات T تحصد علي فترات متفاوتة في جميع انحاء الثقافة المجرية السابقة. توفر أساليبنا رؤية شامله في الاختبارات المصممة لتقييم القدرة التكاثرية وكذلك وظيفة المستجيب في المختبر. ونحن وصف كيفيه قياس النشاط الخلية T السيارات بعد التحفيز من خلال السيارة ونماذج التفاصيل الطعم من ابيضاض الدم باستخدام خلايا السيارات T تحصد في اليوم 3 مقابل اليوم 9 من مرحله التوسع اللوغاريتمي.
هناك تحديات متاصله في مقارنه فعاليه الخلايا السيارات T حصادها في نقاط زمنيه مخت...

مستقبلات مستضد تشيريك (السيارات) توفير نهج واعده لأعاده توجيه الخلايا T ضد مستضدات الأورام متميزة. السيارات هي المستقبلات الاصطناعية التي تربط هدف مستضد. وفي حين ان تكوينها الدقيق متغير ، فان السيارات تحتوي عموما علي 3 مجالات متميزة. المجال خارج الخلية يوجه ملزمه لمستضد الهدف ويتكون عاده من قطعه واحده الجسم المضاد سلسله مرتبطة بالسيارة عن طريق المفصلي خارج الخلية. المجال الثاني ، المستمدة عاده من سلسله CD3ζ من مستقبلات الخلية T (TCR) المعقدة ، ويعزز التنشيط الخلية T بعد مشاركه السيارة. يتم تضمين مجال كوستيمولاتوري الثالث لتعزيز وظيفة الخلية T, التجهيز, الأيض, والمثابرة. نجاح العلاج بالخلايا T السيارة في مختلف الأورام الخبيثة التي تكون الدم بما في ذلك خلايا الدم الليمفاوية الحاده (ALL) ، سرطان الدم اللمفاوي المزمن (cll) والورم النخاعي المتعدد يسلط الضوء علي وعد العلاجية لهذا النهج1،2،3،4،5،6. الاخيره أداره الاغذيه والعقاقير (FDA) الموافقات لاثنين من العلاجات الخلوية CD19 الخاصة بالسيارة t, تيساجنليكلوسيل للأطفال والشباب البالغين ALL و axicabtagene ciloleucel لانتشار الأورام اللمفاوية ب الخلية الكبيرة, يعزز الجدارة الانتقالية من العلاج بالخلايا
وتشمل النهج المستندة إلى T السيارات عزل الخلايا T من الدم المحيطي ، والتنشيط ، والتعديل الجيني ، والتوسع الجسم السابق. التمايز هو معلمه هامه تنظم فعاليه الخلية تي السيارة. وفقا لذلك ، وتقييد التمايز الخلية T خلال الثقافة السابقة فيفو يعزز قدره المنتج غرست لكسب الطعم ، وتوسيع ، وتستمر ، وتوفير المناعة علي المدى الطويل بعد نقل التبني2،7،8،9. تتكون الخلايا t من عده مجموعات فرعيه متميزة بما في ذلك: الخلايا الساذجة T (Tn) ، والذاكرة المركزية (الطب الأساسي) ، والذاكرة المستجيب (تيم) ، والمنحرف متمايزة (Tte) وذاكره الخلايا الجذعية (Tscm). المستجيب المتمايزة الخلايا T لديها قدره لحل قويه. ومع ذلك ، فهي قصيرة الأمد والطعم سيئه10،11،12. وعلي النقيض من ذلك ، t الخلايا مع النمط الظاهري اقل تمايزا بما في ذلك الخلايا الساذجة t والطب العام معرض متفوقة التجهيز والقدرات التكاثري بعد نقل الخلية بالتبني13،14،15،16،17،18. تكوين الخلايا T التي تم جمعها في المنتجات المصنعة مسبقا يمكن ان تختلف عبر المرضي ويرتبط مع الإمكانات العلاجية للخلايا السيارات T. ترتبط نسبه الخلايا التائية ذات الτ الشبيهة بالسذاجة في منتج البدايات الاوليه بالاستجابة السريرية والعلاجية19.
مده الثقافة هي معلمه هامه تؤثر علي التمايز في خلايا السيارات T المعدة لنقل التبني. وضعنا مؤخرا نهجا لتوليد اعلي جوده الخلايا السيارات T باستخدام نموذج الثقافة مختصر20. وباستخدام نهجنا ، أظهرنا ان الثقافة المحدودة تؤدي إلى ظهور خلايا السيارات T مع وظيفة المستجيب المتفوقة والمثابرة بعد نقل التبني في نماذج الكسب غير المزروع من ابيضاض الدم. هنا ، نقدم النهج لتوليد موثوق بها خلايا CART19 (الخلايا الذاتية T هندستها للتعبير عن المضادة لCD19 scFv تعلق علي CD3ζ والمجالات الإشارات 4-1BB) وتشمل وصفا مفصلا لمقايسات التي توفر نظره ثاقبه في النشاط الحيوي للسيارة وفعالية قبل نقل التبني.

<table><tbody><tr><td>مضاد CD3 / CD28 dynabeads</td><td>Thermo Fisher</td><td>40203D</td><td></td></tr><tr><td>APC ماوس مضاد للإنسان CD8</td><td>BD Biosciences</td><td>555369</td><td>RRID: AB_398595</td></tr><tr><td>APC-H7 ماوس مضاد للإنسان CD8 الأجسام المضادة</td><td>BD Biosciences</td><td>560179</td><td>RRID: AB_1645481</td></tr><tr><td>BD FACS Lysing Solution 10X مركز</td><td>BD Biosciences</td><td>349202</td><td></td></tr><tr><td>BD Trucount أنابيب العد المطلق</td><td>BD Biosciences</td><td>340334</td><td></td></tr><tr><td>Brilliant Violet 510 الأجسام المضادة CD4 المضادة للإنسان</td><td>BioLegend</td><td>317444</td><td>RRID: AB_2561866</td></tr><tr><td>Brilliant Violet 605 الأجسام المضادة CD3 المضادة للإنسان</td><td>BioLegend</td><td>317322</td><td>RRID: AB_2561911</td></tr><tr><td>CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit</td><td>Life Technolohgies</td><td>C34554</td><td></td></tr><tr><td>CountBright Absolute Counting Roses ،</td> <td>Invitrogen</td><td>C36950</td><td></td></tr><tr><td>FITC المضادة للإنسان CD197 (CCR7) الأجسام المضادة</td><td>BD Pharmingen</td><td>561271</td><td>RRID: AB_10561679</td></tr><tr><td>FITC Mouse Anti-Human CD4</td><td>BD Biosciences</td><td>555346</td><td>RRID: AB_395751</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>Human AB</td><td>Serum Valley Biomedical</td><td>HP1022</td><td></td></tr><tr><td>Human IL-2 IS ، درجة</td><td>ممتازة Miltenyi</td><td>130-097-744</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Gibco</td><td>28030-081</td><td></td></tr><tr><td>عداد التلألؤ السائل ، MicroBeta trilux</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LIVE / DEAD</td><td>Fixable Violet Molecular</td><td>Probes L34964</td><td></td></tr><tr><td>Multisizer Coulter</td><td>Counter Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Na251CrO4</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEZ030S001MC</td><td></td></tr><tr><td>Pacific الأزرق المضاد للإنسان CD14 الأجسام المضادة</td><td>BioLegend</td><td>325616</td><td>RRID: AB_830689</td></tr><tr><td>المحيط الهادئ الأزرق المضاد للإنسان CD19 الأجسام المضادة</td><td>BioLegend</td><td>302223</td><td></td></tr><tr><td>PE المضاد للإنسان CD45RO الأجسام المضادة</td><td>BD Biosciences</td><td>555493</td><td>RRID: AB_395884</td></tr><tr><td>PE / Cy5 المضاد للإنسان CD95 (Fas) الأجسام المضادة</td><td>BioLegend</td><td>305610</td><td>RRID: AB_493652</td></tr><tr><td>PE / Cy7 المضاد للإنسان CD27 الأجسام المضادة</td><td>بيكمان Coulter</td><td>A54823</td><td></td></tr><tr><td>Phenol متوسط خال من الأحمر</td><td>Gibco</td><td>10373-017</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure SDS Solution ، 10٪</td> <td>Invitrogen</td><td>15553027</td><td></td></tr><tr><td>Via Probe</td><td>BD Biosciences</td><td>555815</td><td></td></tr><tr><td>X-VIVO 15</td><td>Gibco</td><td>04-418Q</td><td></td></tr><tr><td>XenoLight D-Luciferin - K + Salt</td><td>Perkin Elmer</td><td>122799</td><td></td></tr></tbody></table>

تصنيع مستقبلات مستضد تشياريك (car) خلايا t للعلاج المناعي بالتبني

Manufacturing Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells for Adoptive Immunotherapy

العلاج المناعي بالتبني يبشر بمعالجه السرطان والامراض المعدية. نحن وصف نهج بسيط لنقل الخلايا الاساسيه الإنسان T مع مستقبلات مستضد تشيريك (CAR) وتوسيع ذريه السابقين الجسم البشري. ونحن تشمل المقايسات لقياس التعبير سيارة ، فضلا عن التمايز ، والقدرة التكاثري والنشاط لحل. ونحن وصف الاختبارات لقياس إنتاج السايسيسين المستجيب وإفراز خلوية التهابيه في خلايا السيارات T. نهجنا يوفر طريقه موثوقه وشامله للثقافة الخلايا السيارات T للنماذج السريرية للعلاج المناعي بالتبني.

باستخدام الطرق الموصوفة أعلاه ، قمنا بتحفيز وتوسيع خلايا T لمده 3 أو 9 أيام (الشكل 1ا ، ب). وحللنا أيضا ملامح التمايز الخاصة بهم ، علي النحو المبين في استراتيجية النابض المبينة في الشكل 1جيم، عن طريق قياس وفره البروتينات السكرية المميزة التي أعرب عنها علي سطح الخلية. ونحن نظهر تحولا تدريجيا نحو التمايز المنحرف مع مرور الوقت خلال الثقافة المجرية السابقة (الشكل 1د). قمنا بتقييم وظيفة ...

نحن وصف نهج لتوليد موثوق مستقبلات مستضد الشمبانزي (CAR) T الخلايا واختبار تمايزها ووظيفتها في المختبر والجسم الخارجي.

تصنيع مستقبلات مستضد تشياريك (CAR) خلايا T للعلاج المناعي بالتبني

Adoptive immunotherapy holds promise for the treatment of cancer and infectious disease. We describe a simple approach to transduce primary human T cells ...

De-lib-er-ating منتج CELL CAR T Cell مع الكفاءة الوظيفية التي تُنْشَف وتتكاثر، ولها نشاط cit-el-uric بعد التسريب هو مكون أساسي للعلاج المناعي بالتبني الفعال. على سبيل المثال، في الأورام الصلبة، والخلايا T CAR أنها يمكن أن تخترق الأورام الصلبة وأنها تتلقى التحفيز المستضد الأمثل؛ ومع ذلك، يتم إعاقة بهم عموما engraftment وانتشار في الناس. وتتمثل الفائدة الرئيسية لهذا النهج في أنه يمكن أن تحتفظ بنوعية الخلايا T CAR أو حالة التمايز من الخلايا T CAR دون توليد خلايا تائية متمايزة أو منهكة، والتي من شأنها أن تكون قد تضاءلت القدرة التكاثرية أو ضعف وظيفة فعالة بعد التسريب.يمكن أن تكون هذه التقنية صعبة لأن الخلايا التائية حساسة للغاية لتركيز الخلايا أو المساحة السطحية للسفن التي ازرع فيها. وكذلك احتياجاتهم الأيضية. في الأساس تحتاج الخلايا التائية إلى أن تبقى سعيدة طوال العملية ، وإلا فإنها لن تنمو.لبدء هذا الإجراء، وضعت الأطباق ثقافة 6-جيدا. قم بتنشيط الخلايا التائية البشرية الأولية الطازجة أو المحفوظة بالتبريد عن طريق خلطها مع الخرز المغناطيسي CD3 المضاد لـ CD3، بنسبة ثلاثة حبات لكل خلية T في آبار أطباق الثقافة. ثقافة الخلايا التائية في X-Vivo 15 المتوسطة تكمل مع مصل AB الإنسان العادي, L-الجلوتامين, انه يتبول وIL2.تنشيط الخلايا التائية بتركيز مليون خلية T لكل ملليلتر أثناء التوسع. وتربية لهم في 37 درجة مئوية مع 20٪ من الأوكسجين، 5٪ ثاني أكسيد الكربون والرطوبة 95٪. بعد التحفيز بين عشية وضحاها، إضافة عظمى العدسي إلى الخلايا التائية المنشطة.حساب حجم المابير اللازمة لتحقيق تعدد العدوى بين ثلاثة وخمسة. مواصلة زراعة الخلايا باستخدام نفس الشروط. في اليوم الثالث، جمع aliquot ممثل من خلايا الحفاظ على التبريد.قبل الحفاظ على التبريد، وإزالة الخرز المغناطيسي عن طريق الأنابيب بلطف وفصل المغناطيسي. إعداد الوسيلة تجميد، الذي يحتوي على برنامج تلفزيوني مع 0.5٪ DMSO. وتخزينها عند أربع درجات مئوية حتى تصبح جاهزة للاستخدام.بعد ذلك، الطرد المركزي الخلايا T في 300 مرة G لمدة خمس دقائق. تجاهل المابير الزائد وإضافة خمسة ملليلتر من برنامج تلفزيوني. الطرد المركزي الخلايا مرة أخرى في 300 مرة G لمدة خمس دقائق والتخلص من برنامج تلفزيوني.نعلق بيلانت في ملليلتر واحد من الباردة الحفاظ على المتوسط. تجميد الخلايا T في وعاء تجميد مبردة. وتخزينها عند 80 درجة مئوية ناقص لمدة 48 ساعة.بعد ذلك، نقل الخلايا المجمدة إلى النيتروجين السائل. اغسل بقية الخلايا التائية مرة واحدة في خمسة ملليلترات من برنامج تلفزيوني للقضاء على أي ناقل المتبقية. جهاز طرد مركزي في 300 مرة G لمدة خمس دقائق.ثم، decant برنامج تلفزيوني وإعادة تعليق بيلانت الخلية في خلية T ثقافة المتوسطة بتركيز 500،000 خلية لكل ملليلتر. تقسيم الخلايا التائية إلى ثقافتين مصممة 45 و 9. عد الخلايا T بواسطة تدفق cytometry باستخدام عد الخرز والأجسام المضادة أحادية النسيلة إلى CD4 الإنسان وD8.فضلا عن صبغة قابلة للحياة. إعادة تغذية الثقافات كل يوم للحفاظ عليها بتركيز 500،000 خلية لكل ملليلتر. في اليوم الخامس، عد والتبريد الحفاظ على الثقافات اليوم الخامس كما وصف سابقا.في اليوم السابع، اغسل 500 ألف خلية في برنامج تلفزيوني. وإعادة تعليقها في 100 ميكرولترات من الفلوريسنس تنشيط خلية فرز العازلة. ثم، والكشف عن التعبير عن بروتين سطح CAR عن طريق تلطيخ المناعة مع الفلوري المقترنة المضادة CAR 19 idio-نوع بواسطة تدفق cytometry.في اليوم تسعة عد وكفاء الحفاظ على الثقافات اليوم تسعة كما وصف سابقا. في هذه الدراسة يتم قياس وظيفة وفعالية الخلايا T CAR التي يتم حصادها على فترات متفاوتة في جميع أنحاء ثقافة X-Vivo. باستخدام الطرق الموضحة في هذا الفيديو، يتم تحفيز الخلايا التائية وتوسيعها لمدة ثلاثة أو تسعة أيام.يتم تحليل ملف تعريف التمايز الخلايا كما هو مبين من قبل استراتيجية الغاتة هو موضح هنا، من خلال قياس وفرة من بروتينات الجليكوبروتين واضح أعرب عن سطح الخلية. وينظر إلى تحول تدريجي نحو التمايز effector على مر الزمن خلال ثقافة X-Vivo. ثم يتم تقييم وظيفة المفعول والقدرة التكاثرية لخلايا CAR T استجابةً للمستضد.الخلايا التي يتم توسيعها أقل وظيفيا متفوقة على تلك مثقف على نطاق واسع على مدى فترة أطول. في نموذج الماوس xenograft الإنسان من جميع قوة الخلايا T CAR حصادها في فترات زمنية مختلفة مقارنة. تظهر الخلايا التي تستغرق تسعة أيام استجابة مضادة للولوكس تعتمد على الجرعة مع استجابة كاملة تبلغ قيمتها جرعة عالية قدرها ثلاثة ملايين؛ وفقدان الفعالية للجرعة المنخفضة من 500،000.ومع ذلك، أظهرت الخلايا الثلاث اليوم استمرار السيطرة على الورم في كل من الجرعات العالية والمنخفضة. ويرتبط هذا الرد مع العدد المطلق من CAR-T 19 في الدم المحيطي من الفئران. وعموما، توفر هذه النتائج أدلة على أن خلايا CAR T التي تم حصادها في وقت سابق، تفوق تلك التي تم حصادها في وقت لاحق.بعد هذا الإجراء، يمكن إجراء مقايسات إضافية وظيفة مثل مُجرّاة فرس البحر لقياس خصائصها الأيضية مثل استهلاك الأكسجين أو قدرة السبير-it-ed. ويمكن أيضا أن يتم تنفيذ عدة جولات من إعادة التحفيز لتوفير نظرة ثاقبة في تمايزها واستمرار الخلايا CAR T. باستخدام هذا العمل كأساس ونحن والباحثين الآخرين منخرطون في دراسات لاختصار عملية الثقافة.ويمكن أيضا أن تمتد في تصميم النهج الأساسية لمستضدات السرطان الأخرى. يجب أن تؤخذ الرعاية دائما عند العمل مع فيروس العدس. ولكن حتى عندما يتم تصميم فيروس العدس ليكون غير كفء للتكرار.

manufacturing-chimeric-antigen-receptor-car-t-cells-for-adoptive

Research

JoVE Journal

Cancer Research

أبحاث السرطان

يوضح هذا الفيديو تقنية لتصنيع الخلايا التائية لمستقبلات المستضد الخيمري (CAR) خارج الجسم الحي. يتم تحضين الخلايا التائية البشرية بخرز مغناطيسي مغلف بأجسام مضادة مضادة ل CD3 و CD28 ، جنبا إلى جنب مع وسيط مكمل بإنترلوكين -2 (IL-2) ، مما يؤدي إلى تنشيط الخلايا التائية وانتشارها. يتم إدخال نواقل الفيروسات المعدلة وراثيا ، مما يسمح للحمض النووي الريبي المعدل وراثيا بالاندماج في جينوم المضيف والتعبير عن الجينات المعدلة وراثيا. ينتج عن هذا الخلايا التائية المنقولة التي تعبر عن مستقبلات المستضد الخيمري...

تقنية Ex Vivo لتصنيع الخلايا التائية لمستقبلات المستضد الخيمري

يوضح هذا الفيديو تقنية لتوليد خارج الجسم الحي للخلايا التائية لمستقبلات المستضد الخيمري الخاصة بمستضد الورم (CAR). يتم خلط نواقل الفيروسات القهقرية التي تحمل الحمض النووي الريبي المعدل وراثيا مع خلايا الطحال في وسط مكمل بالإنترلوكين -2 لتعزيز بقاء الخلايا التائية وانتشارها. ثم يتم نقل الخليط إلى صفيحة مغلفة بشظايا فيبرونيكتين بشرية مؤتلفة ويتم طردها مركزيا لتسهيل اندماج الفيروس مع الخلية ، مما يسمح للحمض النووي الريبي بالاندماج في الجينوم المضيف وإنتاج CARs مرتبطة بالسطح تستهدف مستضد الورم.

تقنية ex vivo لتوليد خلايا تائية لمستقبلات المستضد الخيمري الخاصة بالورم

ونحن وصف الكمية في الوقت الحقيقي في المختبر نظام فحص التحلل الخلوي لتقييم فاعليه الخلايا التائية مستقبلات مستضد تشياريك استهداف الخلايا السرطانية السائلة والصلبة. يمكن توسيع هذا البروتوكول لتقييم الخلايا الأخرى لجهاز المناعة ، فضلا عن العلاجات المركبة.

فحص فاعليه في الوقت الحقيقي للخلايا التائية لمستقبلات مستضد تشياريك التي تستهدف الخلايا السرطانية الصلبة والدموية

هنا، نقدم بروتوكولا لتحرير الجينات في الخلايا التائية البشرية الأولية باستخدام تقنية CRISPR Cas لتعديل خلايا CAR-T.

إنتاج خلايا CAR-T البشرية التي تم تصميمها من قبل CRISPR

توضح هذه المقالة بالتفصيل عملية تصنيع الخلايا التائية لمستقبلات المستضد الخيمري للاستخدام السريري ، وتحديدا باستخدام معالج خلوي آلي قادر على إجراء نقل فيروسي وزراعة الخلايا التائية. نحن نقدم توصيات ونصف المزالق التي يجب مراعاتها أثناء تطوير العملية وتنفيذ تجربة سريرية في مرحلة مبكرة.

تصنيع الخلايا التائية لمستقبلات المستضد الخيمري على معالج خلوي آلي

يبسط هذا البروتوكول إنتاج النواقل الفيروسية القهقرية ونقل الخلايا التائية للفأر ، مما يسهل التوليد الفعال للخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الوهمية للفئران.

التوليد الفعال لمستقبلات مستضد الفئران الخيمري (CAR) - الخلايا التائية

يوفر هذا البروتوكول سير عمل مبسطا لإنشاء واختبار الخلايا التائية التنظيمية لمستقبلات المستضد الخيمري البشري (CAR Tregs).

توليد الخلايا التائية التنظيمية لمستقبلات المستضد الخيمري البشري

يحدد هذا البروتوكول إجراء مفصلا لتوليد الخلايا التائية لمستقبلات المستضد الخيمري العابرة (CAR) باستخدام mRNA غير المتكامل للعلاج المناعي للسرطان ويوفر طرقا موثوقة لتقييم خلايا مستقبلات المستضد الخيمري (CAR-T وظيفتها السامة للخلايا).

نهج غير فيروسي لتوليد خلايا تائية عابرة لمستقبلات المستضد الخيمري باستخدام mRNA للعلاج المناعي للسرطان

هنا ، نصف طريقة لإنشاء قطرات مستحلب مزدوجة تغلف خلية تائية واحدة وخلية مستهدفة سرطانية لفحص قتل الخلايا على مستوى الخلية الواحدة. تسمح هذه الطريقة بالقياس الكمي المزدوج لكل من الجزيئات السامة للخلايا وموت الخلايا المبرمج للخلايا المستهدفة داخل عدد كبير من الخلايا التائية.

مقايسة السمية الخلوية القائمة على القطرات لتقييم الخلايا التائية لمستقبلات المستضد الخيمري على مستوى الخلية المفردة

يصف هذا البروتوكول الخطوات الأساسية لزراعة الخلايا التائية الأولية، بما في ذلك عزلها، وتفعيلها، وتمددها، ونقلها المؤقت بواسطة النسيج الكهربائي لل mRNA. بالإضافة إلى ذلك، يقترح وجود سير عمل ولوحة للأجسام المضادة لتحليل تدفق الخلايا للنمط الظاهري، وعلامات التفعيل، وقابلية البقاء، وتعبير مستقبلات المستضد الكيميرية (CAR).

عزل وزراعة ونقل مؤقت لخلايا تائية بشرية أولية لتوليد خلايا تائية مستقبلات مستضدات كيميرية (CAR)

اكتشف طريقة تصنيع خلايا T مستقبلات مستضد تشياريك (CAR) للعلاج المناعي بالتبني مع الحفاظ على كفاءتها الوظيفية. تساعد هذه التقنية الباحثين في تحسين فعالية العلاج ضد الأورام الصلبة.

تصنيع مستقبلات مستضد تشياريك (CAR) خلايا T للعلاج المناعي بالتبني

استكشف المزيد من الفيديوهات