تصنيع مستقبلات مستضد تشياريك (CAR) خلايا T للعلاج المناعي بالتبني

De-lib-er-ating منتج CELL CAR T Cell مع الكفاءة الوظيفية التي تُنْشَف وتتكاثر، ولها نشاط cit-el-uric بعد التسريب هو مكون أساسي للعلاج المناعي بالتبني الفعال. على سبيل المثال، في الأورام الصلبة، والخلايا T CAR أنها يمكن أن تخترق الأورام الصلبة وأنها تتلقى التحفيز المستضد الأمثل؛ ومع ذلك، يتم إعاقة بهم عموما engraftment وانتشار في الناس. وتتمثل الفائدة الرئيسية لهذا النهج في أنه يمكن أن تحتفظ بنوعية الخلايا T CAR أو حالة التمايز من الخلايا T CAR دون توليد خلايا تائية متمايزة أو منهكة، والتي من شأنها أن تكون قد تضاءلت القدرة التكاثرية أو ضعف وظيفة فعالة بعد التسريب.

يمكن أن تكون هذه التقنية صعبة لأن الخلايا التائية حساسة للغاية لتركيز الخلايا أو المساحة السطحية للسفن التي ازرع فيها. وكذلك احتياجاتهم الأيضية. في الأساس تحتاج الخلايا التائية إلى أن تبقى سعيدة طوال العملية ، وإلا فإنها لن تنمو.

لبدء هذا الإجراء، وضعت الأطباق ثقافة 6-جيدا. قم بتنشيط الخلايا التائية البشرية الأولية الطازجة أو المحفوظة بالتبريد عن طريق خلطها مع الخرز المغناطيسي CD3 المضاد لـ CD3، بنسبة ثلاثة حبات لكل خلية T في آبار أطباق الثقافة. ثقافة الخلايا التائية في X-Vivo 15 المتوسطة تكمل مع مصل AB الإنسان العادي, L-الجلوتامين, انه يتبول وIL2.

تنشيط الخلايا التائية بتركيز مليون خلية T لكل ملليلتر أثناء التوسع. وتربية لهم في 37 درجة مئوية مع 20٪ من الأوكسجين، 5٪ ثاني أكسيد الكربون والرطوبة 95٪. بعد التحفيز بين عشية وضحاها، إضافة عظمى العدسي إلى الخلايا التائية المنشطة.

حساب حجم المابير اللازمة لتحقيق تعدد العدوى بين ثلاثة وخمسة. مواصلة زراعة الخلايا باستخدام نفس الشروط. في اليوم الثالث، جمع aliquot ممثل من خلايا الحفاظ على التبريد.

قبل الحفاظ على التبريد، وإزالة الخرز المغناطيسي عن طريق الأنابيب بلطف وفصل المغناطيسي. إعداد الوسيلة تجميد، الذي يحتوي على برنامج تلفزيوني مع 0.5٪ DMSO. وتخزينها عند أربع درجات مئوية حتى تصبح جاهزة للاستخدام.

بعد ذلك، الطرد المركزي الخلايا T في 300 مرة G لمدة خمس دقائق. تجاهل المابير الزائد وإضافة خمسة ملليلتر من برنامج تلفزيوني. الطرد المركزي الخلايا مرة أخرى في 300 مرة G لمدة خمس دقائق والتخلص من برنامج تلفزيوني.

نعلق بيلانت في ملليلتر واحد من الباردة الحفاظ على المتوسط. تجميد الخلايا T في وعاء تجميد مبردة. وتخزينها عند 80 درجة مئوية ناقص لمدة 48 ساعة.

بعد ذلك، نقل الخلايا المجمدة إلى النيتروجين السائل. اغسل بقية الخلايا التائية مرة واحدة في خمسة ملليلترات من برنامج تلفزيوني للقضاء على أي ناقل المتبقية. جهاز طرد مركزي في 300 مرة G لمدة خمس دقائق.

ثم، decant برنامج تلفزيوني وإعادة تعليق بيلانت الخلية في خلية T ثقافة المتوسطة بتركيز 500،000 خلية لكل ملليلتر. تقسيم الخلايا التائية إلى ثقافتين مصممة 45 و 9. عد الخلايا T بواسطة تدفق cytometry باستخدام عد الخرز والأجسام المضادة أحادية النسيلة إلى CD4 الإنسان وD8.

فضلا عن صبغة قابلة للحياة. إعادة تغذية الثقافات كل يوم للحفاظ عليها بتركيز 500،000 خلية لكل ملليلتر. في اليوم الخامس، عد والتبريد الحفاظ على الثقافات اليوم الخامس كما وصف سابقا.

في اليوم السابع، اغسل 500 ألف خلية في برنامج تلفزيوني. وإعادة تعليقها في 100 ميكرولترات من الفلوريسنس تنشيط خلية فرز العازلة. ثم، والكشف عن التعبير عن بروتين سطح CAR عن طريق تلطيخ المناعة مع الفلوري المقترنة المضادة CAR 19 idio-نوع بواسطة تدفق cytometry.

في اليوم تسعة عد وكفاء الحفاظ على الثقافات اليوم تسعة كما وصف سابقا. في هذه الدراسة يتم قياس وظيفة وفعالية الخلايا T CAR التي يتم حصادها على فترات متفاوتة في جميع أنحاء ثقافة X-Vivo. باستخدام الطرق الموضحة في هذا الفيديو، يتم تحفيز الخلايا التائية وتوسيعها لمدة ثلاثة أو تسعة أيام.

يتم تحليل ملف تعريف التمايز الخلايا كما هو مبين من قبل استراتيجية الغاتة هو موضح هنا، من خلال قياس وفرة من بروتينات الجليكوبروتين واضح أعرب عن سطح الخلية. وينظر إلى تحول تدريجي نحو التمايز effector على مر الزمن خلال ثقافة X-Vivo. ثم يتم تقييم وظيفة المفعول والقدرة التكاثرية لخلايا CAR T استجابةً للمستضد.

الخلايا التي يتم توسيعها أقل وظيفيا متفوقة على تلك مثقف على نطاق واسع على مدى فترة أطول. في نموذج الماوس xenograft الإنسان من جميع قوة الخلايا T CAR حصادها في فترات زمنية مختلفة مقارنة. تظهر الخلايا التي تستغرق تسعة أيام استجابة مضادة للولوكس تعتمد على الجرعة مع استجابة كاملة تبلغ قيمتها جرعة عالية قدرها ثلاثة ملايين؛ وفقدان الفعالية للجرعة المنخفضة من 500،000.

ومع ذلك، أظهرت الخلايا الثلاث اليوم استمرار السيطرة على الورم في كل من الجرعات العالية والمنخفضة. ويرتبط هذا الرد مع العدد المطلق من CAR-T 19 في الدم المحيطي من الفئران. وعموما، توفر هذه النتائج أدلة على أن خلايا CAR T التي تم حصادها في وقت سابق، تفوق تلك التي تم حصادها في وقت لاحق.

بعد هذا الإجراء، يمكن إجراء مقايسات إضافية وظيفة مثل مُجرّاة فرس البحر لقياس خصائصها الأيضية مثل استهلاك الأكسجين أو قدرة السبير-it-ed. ويمكن أيضا أن يتم تنفيذ عدة جولات من إعادة التحفيز لتوفير نظرة ثاقبة في تمايزها واستمرار الخلايا CAR T. باستخدام هذا العمل كأساس ونحن والباحثين الآخرين منخرطون في دراسات لاختصار عملية الثقافة.

ويمكن أيضا أن تمتد في تصميم النهج الأساسية لمستضدات السرطان الأخرى. يجب أن تؤخذ الرعاية دائما عند العمل مع فيروس العدس. ولكن حتى عندما يتم تصميم فيروس العدس ليكون غير كفء للتكرار.