Name: سريع للغاية ومحددة وضع العلامات الأيضية من الحمض النووي الريبي في فيفو مع 4-ثيوراسيل (Ers4tU) (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-22T14:30:00.000+00:00
Duration: 11 s
Description: تعلم تقنية تسمية الحمض النووي الريبي باستخدام اليوراسيل الكبريتي لتحليل سريع ودقيق في خميرة Saccharomyces cerevisiae. تتيح هذه الطريقة إجراء تجارب النبض والمطاردة بفترات زمنية قصيرة جداً مع خلفية منخفضة.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ساندت هذا عمل كان ب [ولّكم] تمويل إلى [جب] [104648]. ويدعم العمل في مركز ويلكوم لبيولوجيا الخلايا من قبل ويلكوم التمويل الأساسي [092076]. يعترف المؤلفون بأعضاء المختبر لمساعدتهم: بيلا مودلين، إيمانويلا ساني، سوزانا دي لوكاس- أرياس وشيني جورج. كما يود المؤلفون أن يشكروا باتريك كرامر على البلازميد YEpEBI31111.

<ol><li>Duffy, E. E., Schofield, J. A., Simon, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gaining+insight+into+transcriptome-wide+RNA+population+dynamics+through+the+chemistry+of+4-thiouridine%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdisciplinary+Reviews%3A+RNA%22%5BJournal%5D)">Gaining insight into transcriptome-wide RNA population dynamics through the chemistry of 4-thiouridine.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 10 (1), e1513(2018).</li>
<li>Windhager, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrashort+and+progressive+4sU-tagging+reveals+key+characteristics+of+RNA+processing+at+nucleotide+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Ultrashort and progressive 4sU-tagging reveals key characteristics of RNA processing at nucleotide resolution.</a> Genome Research. 22, 2031-2042 (2012).</li>
<li>Baptista, T., Devys, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Saccharomyces+cerevisiae+Metabolic+Labeling+with+4-thiouracil+and+the+Quantification+of+Newly+Synthesized+mRNA+As+a+Proxy+for+RNA+Polymerase+II+Activity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity.</a> Journal of Visualized Experiments. (140), e57982(2018).</li>
<li>Barrass, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome-wide+RNA+processing+kinetics+revealed+using+extremely+short+4tU+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Transcriptome-wide RNA processing kinetics revealed using extremely short 4tU labeling.</a> Genome Biology. 16, 282(2015).</li>
<li>Burger, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((4-thiouridine+inhibits+rRNA+synthesis+and+causes+a+nucleolar+stress+response%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biology%22%5BJournal%5D)">4-thiouridine inhibits rRNA synthesis and causes a nucleolar stress response.</a> RNA Biology. 10, 1623-1630 (2013).</li>
<li>Mendoza-Ochoa, G. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fast+and+tuneable+auxin-inducible+degron+for+depletion+of+target+proteins+in+budding+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast+%28Chichester+England%29%22%5BJournal%5D)">A fast and tuneable auxin-inducible degron for depletion of target proteins in budding yeast.</a> Yeast (Chichester England). 36 (1), 75-81 (2018).</li>
<li>Barrass, J. D., Mendoza-Ochoa, G. I., Maudlin, I. E., Sani, E., Beggs, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuning+degradation+to+achieve+specific+and+efficient+protein+depletion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Tuning degradation to achieve specific and efficient protein depletion.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2019).</li>
<li>Hobro, A. J., Smith, N. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+evaluation+of+fixation+methods%3A+Spatial+and+compositional+cellular+changes+observed+by+Raman+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Vibrational+Spectroscopy%22%5BJournal%5D)">An evaluation of fixation methods: Spatial and compositional cellular changes observed by Raman imaging.</a> Vibrational Spectroscopy. 91, 31-45 (2017).</li>
<li>Gustilo, E. M., Vendeix, F. A. P., Agris, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((tRNA%27s+Modifications+Bring+Order+to+Gene+Expression%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">tRNA's Modifications Bring Order to Gene Expression.</a> Current Opinion in Microbiology. 11, 134-140 (2008).</li>
<li>Dolken, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+gene+expression+profiling+for+simultaneous+kinetic+parameter+analysis+of+RNA+synthesis+and+decay%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">High-resolution gene expression profiling for simultaneous kinetic parameter analysis of RNA synthesis and decay.</a> RNA. 14, 1959-1972 (2008).</li>
<li>Miller, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+transcriptome+analysis+measures+rates+of+mRNA+synthesis+and+decay+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Systems+Biology%22%5BJournal%5D)">Dynamic transcriptome analysis measures rates of mRNA synthesis and decay in yeast.</a> Molecular Systems Biology. 7, 458(2011).</li>
<li>Schmitt, M. E., Brown, T. A., Trumpower, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+simple+method+for+preparation+of+RNA+from+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">A rapid and simple method for preparation of RNA from Saccharomyces cerevisiae.</a> Nucleic Acids Research. 18, 3091-3092 (1990).</li>
<li>Rädle, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+Labeling+of+Newly+Transcribed+RNA+for+High+Resolution+Gene+Expression+Profiling+of+RNA+Synthesis%2C+Processing+and+Decay+in+Cell+Culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Metabolic Labeling of Newly Transcribed RNA for High Resolution Gene Expression Profiling of RNA Synthesis, Processing and Decay in Cell Culture.</a> Journal of Visualized Experiments. (78), e50195(2013).</li>
<li>Herzog, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thiol-linked+alkylation+of+RNA+to+assess+expression+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Thiol-linked alkylation of RNA to assess expression dynamics.</a> Nature Methods. 14, 1198-1204 (2017).</li>
<li>Ohrt, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+dissection+of+step+2+catalysis+of+yeast+pre-mRNA+splicing+investigated+in+a+purified+system%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Molecular dissection of step 2 catalysis of yeast pre-mRNA splicing investigated in a purified system.</a> RNA. 19, 902-915 (2013).</li>
<li>Alexander, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RiboSys%2C+a+high-resolution%2C+quantitative+approach+to+measure+the+in+vivo+kinetics+of+pre-mRNA+splicing+and+3%E2%80%B2-end+processing+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">RiboSys, a high-resolution, quantitative approach to measure the in vivo kinetics of pre-mRNA splicing and 3′-end processing in Saccharomyces cerevisiae.</a> RNA. 16, 2570-2580 (2010).</li>
<li>Wallace, E. W. J., Beggs, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extremely+fast+and+incredibly+close%3A+cotranscriptional+splicing+in+budding+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Extremely fast and incredibly close: cotranscriptional splicing in budding yeast.</a> RNA. 23, 601-610 (2017).</li>
<li>Adelman, K., Lis, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promoter-proximal+pausing+of+RNA+polymerase+II%3A+emerging+roles+in+metazoans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Promoter-proximal pausing of RNA polymerase II: emerging roles in metazoans.</a> Nature Reviews Genetics. 13, 720-731 (2012).</li>
<li>Preker, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+Exosome+Depletion+Reveals+Transcription+Upstream+of+Active+Human+Promoters%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RNA Exosome Depletion Reveals Transcription Upstream of Active Human Promoters.</a> Science. 322, 1851-1854 (2008).</li>
<li>Aslanzadeh, V., Huang, Y., Sanguinetti, G., Beggs, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+rate+strongly+affects+splicing+fidelity+and+cotranscriptionality+in+budding+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Transcription rate strongly affects splicing fidelity and cotranscriptionality in budding yeast.</a> Genome Research. 28, 203-213 (2018).</li>
<li>Schofield, J. A., Duffy, E. E., Kiefer, L., Sullivan, M. C., Simon, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TimeLapse-seq%3A+adding+a+temporal+dimension+to+RNA+sequencing+through+nucleoside+recoding%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">TimeLapse-seq: adding a temporal dimension to RNA sequencing through nucleoside recoding.</a> Nature Methods. 15, 221-225 (2018).</li>
</ol>

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

تقدم هذه المقالة بروتوكولًا لوضع العلامات بسرعة فائقة ومحددة من وحدة التخزين الأونوع، من أجل استعادة الحمض النووي الريبي الوليد، الذي تم تصنيعه حديثًا من S. cerevisiae بعد أقل من 15 ق من وضع العلامات، مع تلوث منخفض جدًا بواسطة RNA غير المسمى.
يجب على المستخدم دائما الحرص على الحفاظ على سلامة الحمض النووي الريبي باستخدام درجات الحرارة الباردة والكواشف المعالجة DEPC. Streptavidin حبة تنقية موثوق بها عموما. ومع ذلك، من الصعب التعامل مع المخزن المؤقت حبة; يجب أن يتم ذلك حديثا، مع مكوناته المضافة في الترتيب الصحيح، وليس المبردة أو autoclaved. وتشمل أوجه القصور الشائعة الحمض النووي الريبي يجري حلها بشكل غير كامل بعد خطوات هطول الأمطار، وذلك إما كونها لا biotinylated أو فقدت خلاف ذلك خلال خطوات المعالجة. هناك تعليمات استكشاف الأخطاء وإصلاحها واسعة النطاق في المواد التكميلية.
هناك بعض القيود التي يجب أن تكون على بينة من في ers4tU. واحد سبق ذكره هو أن 4tU يبطئ نمو الخميرة (الشكل1a). وبصرف النظر عن RNAs ثيولاتيد الذاتية9، يمكن تنقية فقط RNAs التي تم تدوينها خلال فترة وضع العلامات عن طريق هذه الطريقة. البوليمرات التي توقفت على الجينات طوال وقت الثيوليشن لن تنتج النصوص الثيولاتية التي يمكن تنقيتها، على الرغم من أن النصوص التي تحمل جزئيا بسبب دخول البوليمرات أو ترك حالة توقف أثناء الثيوليشن يمكن استردادها. السلالات التي تنسخ بشكل سيء، إما بسبب ظروف الطفرة أو النمو، تنتج nsRNA قليلاً، على الرغم من أن التقنيات المستخدمة هنا سوف تحسن مع ذلك انتعاش nsRNA بالمقارنة مع أساليب أخرى. قد تكون أوقات أطول وزيادة أحجام الثقافة ضرورية في هذه السلالات والظروف. لاحظ أن uracil هو مصدر جيد للنيتروجين وبالتالي ينبغي أن يحاكم هذا الأسلوب قبل استخدامها للدراسات التي تنطوي على تجويع النيتروجين.
ويفيد بروتوكول ers4tU بشكل خاص في تحليل التقييمات RNS قصيرة الأجل، وكثير منها متدهور بسرعة بحيث لا يمكن تحديدها دون شل آلية التدهور. ومن الأمثلة على ذلك النصوص غير المستقرة الغامضة (CUTs)4، والنصوص القصيرة التي تنتجها الإنهاء المبكر أو المروج التوقف القريب18 والنسخ المضادة للتحسس "المنبع" من المروج (PROMPTs)19. الوسطاء المنتجة أثناء معالجة أنواع الحمض النووي الريبي مستقرة هي أيضا عابرة ولكن يمكن إثراؤها باستخدام النسخ ers4tU4. وبالتالي فإن بروتوكول ers4tU استثنائي في السماح بتحليل أنواع الحمض النووي الريبي العابرة للغاية والتقاطها في ظل ظروف فسيولوجية قريبة، وهو ميزة كبيرة على الطرق الأخرى. وقد استخدمت هذه التقنية لدراسة النسخ وحركة معالجة الحمض النووي الريبي المصب في متحولات بوليميراز RNA أن elongate أسرع أو أبطأ من العادي20.
الثيوليشن هو أيضا متوافق مع RNA-seq وSLAM-seq21،مما يسمح لجميع RNA المنتجة في غضون فترة زمنية قصيرة جدا أن تتميز بتفاصيل رائعة.

الحمض النووي الريبي له طبيعة ديناميكية; قريبا بعد هو أنتجت كثير [رنا] سريعا عالجت ويحطّم. حاليا، معظم الدراسات من التمثيل الغذائي الحمض النووي الريبي تحليل الحمض النووي الريبي الخلوية الإجمالية، والتي تتم معالجتها في الغالب بشكل كامل وعلى مستوى الدولة ثابت. ويعتمد هذا المستوى على التوازن بين معدلات النسخ والنضج والتدهور بعد النسخ. يتطلب تحليل العمليات التي تؤدي إلى توازن الدولة الثابت تقنيات متخصصة لالتقاط أنواع الحمض النووي الريبي قصيرة العمر.
إن وضع العلامات الأيضية للرنا مع نظائرها النيوكليوتيدات مثل 4-ثيوراسيل (4tU) أو 4-ثيويريدين (4sU) (انظر Duffy et al.1 للحصول على مراجعة ممتازة)، يوفر القدرة على عزل RNAs الوليدة التي تحمل علامات ثيو ووسيطات تجهيزها. ومع ذلك، تتضمن البروتوكولات المنشورة أوقات وضع العلامات من عدة دقائق2،3، وهو بطيء بالنسبة لمعدل إنتاج العديد من النصوص. يستغرق الأمر في ترتيب دقيقة واحدة لتدوين جين الخميرة المتوسط، لذلك وضع العلامات الخميرة RNA لأقل من دقيقة واحدة يمكن اعتبارقصيرة للغاية. بروتوكول 4 ثيراسيل سريعة للغاية ومحددة (ers4tU) يزيد من نسبة الإشارة إلى الضوضاء عن طريق تعظيم التأسيس 4tU والتقليل من استرداد RNA غير المسمى، الموجودة من قبل مما يجعل أوقات وضع العلامات قصيرة جدا ممكن4.
يجب استيراد قاعدة ثيو المعدلة في الخلايا بسرعة وبكميات كافية لتسمية بكفاءة RNA توليفها حديثا (nsRNA). ولتعزيز ذلك، تزرع الخلايا في وسط خال ٍ من الأوراسيل، كما أن التعبير عن التميّز المناسب يساعد على زيادة التناول بـ 4tU أو 4sU (انظر الجدول 1 للاطلاع على قائمة ببلازميدات تحمل جينات بيرميس مناسبة والشكل التكميلي1). الذوبان 4tU في هيدروكسيد الصوديوم يتجنب الحاجة إلى المذيبات العضوية السامة المطلوبة من قبل نظائرها النيوكليوتيدات الأخرى. لسوء الحظ، لوحظ أن الثقافات المتنامية لفترات طويلة مع النيوكليوسيدات المعدلة ثيوفي تركيزات أكبر من 50 درجة مئوية لتعطيل ريبوسوسوم5 . ومع ذلك، فإن التركيز (10 درجة مئوية) المستخدمة هنا، وأوقات وضع العلامات القصيرة للغاية، تقلل من الآثار الضارة5 (الشكل1أ)،في حين لا تزال تسفر عن الحمض النووي الريبي الكافي للتحليل.
ويمكن الجمع بين هذه التقنية مع استنفاد سريع ومحدد بوساطة أوكسين من البروتين المستهدف6،7 ( الشكل2) ، ويشار إليه باسم بروتوكول "β-est AID 4U" ، الذي ينظم فيه بيتا استراديول التعبير عن أوكسين يتم الجمع بين نظام degron اللاتبر (AID) مع وضع العلامات 4tU. مع نهج بيتا-إست AID 4U، يمكن استنفاد البروتين المستهدف والتأثير علىاستقلاب الحمض النووي الريبي رصدها عن كثب (الشكل 2). والتوقيت حاسم؛ من المستحسن عرض الفيديو المصاحب وإيلاء اهتمام وثيق للشكل 2 وشكله المتحرك (انظر الشكل التكميلي2).
يجب إيقاف معالجة وتدهور الحمض النووي الريبي بسرعة فائقة من أجل دقة دقة الوقت. ويتحقق ذلك باستخدام الميثانول في درجة حرارة منخفضة، والذي يصلح محتويات الخلية بسرعة كبيرةويحط من غشاء الخلية مع الحفاظ على محتوى الحمض النووي 8. يجب أن يكون استخراج الحمض النووي الريبي فعالة وليس تلف الحمض النووي الريبي. اللثي الميكانيكي فعال في غياب وكلاء تشاوتروبيك (غالبا ما تحتوي هذه على مجموعات ثيو، لذلك ينبغي تجنبها). ويفضل هطول الأمطار كلوريد الليثيوم من الحمض النووي الريبي، كما يتم تسريع tRNAs أقل كفاءة. يتم نسخ tRNAs بسرعة وثيولاتيد بشكل طبيعي9،لذلك إزالة tRNAs يقلل من المنافسة على الكاشف biotinylation. إذا كانت RNAs الصغيرة والمنظمة للغاية ذات أهمية، يوصى بأساليب هطول الأمطار الحمض النووي الريبي المستندة إلى الكحول.
لاستعادة الحمض النووي الريبي الثيولاتي، يتم إرفاق البيوتين بشكل مشترك عن طريق مجموعات ثيو المدمجة في الحمض النووي الريبي مع 4tU. ويوصى باستخدام البيوتين المعدل، الذي يعلق عن طريق رابطة ثنائي كبريتيد قابلة للتصلب (على سبيل المثال، HPDP-البيوتين (N-6-(Biotinamido)hexyl]-3€ -(2€pyridyldithio)propionamide، أو MTS-البيوتين (ميثان ثيوسولفونات)) بما أنّ هو يسمح إطلاق من ال [رنا] بإضافة من يقلّل عاملة. الحمض النووي الريبي biotinylated هو تقارب تنقية على streptavidin إلى جانب الخرز المغناطيسي. هذا البروتوكول مشابه للجهات الأخرى المذكورة سابقاً10 ولكن تم تحسين بشكل مكثف لتقليل الخلفية.
وهناك نوعان من تجارب وضع العلامات على الثيول يمكن القيام بها، وهما وضع العلامات المستمر والمستمر. ولكل منها مزاياها الخاصة. في وضع العلامات المستمرة يتم إضافة 4tU إلى الثقافة والعينات التي تؤخذ على فترات منتظمة. يوضح هذا النوع من التجارب كيفية معالجة الحمض النووي الريبي وكيفية تغير المستويات مع مرور الوقت. ومن الأمثلة على ذلك مقارنة المتحولين بتجارب من النوع البري وتجربة مطاردة النبض. والتجارب المبينة في الشكل 3ب(ج) من هذا النوع. ل [سمّينغ] مستمرّة يحثّ تغير داخل النظامة وال [رنا] يراقب. وبمجرد أن يتم إدخال التغيير يجب تقسيم الثقافة إلى عدة ثقافات فرعية، وفي أوقات محددة، يتم وضع علامة على كل منها لفترة قصيرة. ومن الأمثلة على ذلك برنامج المساعدة 4U الذي يظهر في الشكل 27. هذا النوع من التجارب مفيد بشكل خاص لرصد تأثير التغيير الأيضي على معالجة الحمض النووي الريبي (انظر الشكل 3d).
وترد في الشكل 4 والشكل 5تمثيل بياني لتجربة وضع العلامات على الثيو، كما يتوفر جدول بيانات يبسط إلى حد كبير أداء البروتوكول (انظر قالب التجربة 4tU.xlsx). بالإضافة إلى هذا يحتوي "المعلومات التكميلية" على دليل استكشاف الأخطاء وإصلاحها واسعة النطاق. وللاطلاع على بروتوكول المعونة 4U الذي يدمج وضع العلامات على وحدة التخزين 4 tU مع بروتوكول استنفاد الأوكسين، انظر الشكل 2 والشكل التكميلي2. انظر Barrass et al.7 للاطلاع على البروتوكول المفصل لاستنفاد المعونة.

<table><tbody><tr><td>&بيتا ؛ ميركابتو إيثانول (&بيتا ؛ أنا)</td> <td>سيجما ألدريتش</td><td>M3148</td><td>تحذير سام. حلول المخزون هي تقريبا 14 م ، تصنع عند 1 / 20 التخفيف للاستخدام</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>25668</td><td>تحذير ثنائي</td></tr><tr><td>إيثيل بيروكربونات سامة (DEPC)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>D5758</td><td>إضافة 1 / 1000 الحجم إلى محلول ، اتركه في درجة حرارة الغرفة لمدة 24 ساعة ، ثم الأوتوكلاف</td></tr><tr><td>DMF (N,N-dimethylformamide)</td><td>&nbsp; سيجما ألدريتش</td><td>227056</td><td>الحذر EDTA</td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3609</td><td>اصنع 0.5 م ودرجة الحموضة إلى 8.0 مع هيدروكسيد الصوديوم</td></tr><tr><td>الإيثانول</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>29221</td><td></td></tr><tr><td>EZ-link HPDP Biotin</td><td>Thermo Scientific</td><td>21341</td><td>مخزن محمي من الضوء. قم بإذابة جميع محتويات القارورة في 22.7 مل DMF (لعمل محلول مخزون 4 ملم). يحفظ بعيدا عن الماء في الظلام و عند -20 درجة مئوية ، تحقق من المحلول قبل الاستخدام ، حيث تترسب بعض دفعات HPDP في التخزين ؛ الحرارة عند 42 درجة ؛ C لتعليق.</td></tr><tr><td>جلوكوز</td><td>فيشر العلمية&nbsp;</td><td>G / 0500/60</td><td></td></tr><tr><td>جليكوجين [20 مجم / مل]</td> <td>سيجما ألدريتش</td><td>10901393001</td><td>يخزن عند -20 درجة ؛ C</td></tr><tr><td>الجمل الثابت TCEP ثاني كبريتيد</td> تقليل <td>الجل Thermo Scientific</td><td>77712</td><td>اختياري</td></tr><tr><td>LiCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>793620</td><td>10 M. تنبيه: يصبح هذا حارا جدا كما يذوب ويمكن أن يغلي عند أكثر من 100 oC ، أضف بلورات LiCl إلى الماء ببطء.</td></tr><tr><td>كلوريد المغنيسيوم (MgCl 2) محلول</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>63033</td><td>1 M. تنبيه: يصبح هذا حارا جدا كما يذوب ويمكن أن يغلي عند أكثر من 100 oC ، أضف بلورات MgCl2 إلى الماء ببطء.</td></tr><tr><td>الميثانول</td><td>فيشر العلمي</td><td>M / 4000 / PC17</td><td>تحذير NaH </tr><tr><td>>2PO 4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3139</td><td>اصنع 1 م من كل منها واخلطها بكمية متساوية للحصول على محلول من الأس الهيدروجيني</td></tr><tr><td>المناسب Na 2HPO4</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>S3264</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>محلول S9888-M</td><td>5 M</td></tr><tr><td>الفينول ، درجة الحموضة المنخفضة &nbsp ؛ &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4682</td><td>يحفظ في الظلام عند 4 درجات مئوية تحذير</td></tr><tr><td>الفينول كلوروفورم السام 5: 1 (125:24: 1) درجة حموضة منخفضة.</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1944</td><td>يخزن في الظلام عند 4 درجات مئوية تنبيه</td></tr><tr><td>أعمدة بيرس تدور</td><td>السمية Thermo Scientific</td><td>69702</td><td>اختياري</td></tr><tr><td>SCSM تسرب واحد &ndash ؛ ura</td><td>Formedium&nbsp;</td><td>DSCS101</td><td></td></tr><tr><td>أسيتات الصوديوم</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>32318-M</td><td>اصنع محلولا 3 م ودرجة الحموضة إلى 5.3 مع حمض الخليك</td></tr><tr><td>هيدروكسيد الصوديوم</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>795429</td><td>تحذير</td></tr><tr><td>تآكل SDS (كبريتات دوديسيل الصوديوم)</td> <td>سيجما ألدريتش</td><td>436143</td><td>مهيج ، لا تستنشق</td></tr><tr><td>حبات الستربتافيدين المغناطيسية</td><td>NEB</td><td>1420S</td><td>مخزن في 4 درجة ؛ ج&nbsp;</td></tr><tr><td>SUPERase-In, مثبط RNase</td><td>تقنيات الحياة&nbsp;</td><td>AM2696</td><td>مخزن في -20 درجة ؛ C</td></tr><tr><td>ثيولد Schizosaccharomyces pombe للارتفاع</td><td></td><td></td><td>انظر القسم 1.7 من البروتوكول</td></tr><tr><td>4-thiouracil (4tU) &nbsp;</td><td>359930010 ACROS ORGANICS</td><td></td><td>يخزن في الظلام. اصنع مخزون 100 ملي في 1M هيدروكسيد الصوديوم ، وتخزين الحلول عند -20 درجة مئوية ؛</td></tr>حلول <tr><td>قاعدة</td><td>تريس سيجما ألدريتش</td><td>93362</td><td>1 م في مختلف الأس الهيدروجيني</td></tr><tr><td>tRNA</td><td>سيجما</td><td>ألدريتش 10109541001</td><td>5 مجم / مل ، تخزينها عند -20 درجة ؛ C</td></tr><tr><td>Uridine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U3750</td><td>اصنع محلول 1 M في H2O. يقسم إلى 2 مل من الحصص ويخزن في -20 درجة مئوية.</td></tr><tr><td>قاعدة نيتروجين الخميرة بدون أحماض أمينية &nbsp ؛ مع كبريتات الأمونيوم</td><td>لأعمدة زيبا CYN0410</td><td></td><td></td>متوسطة</tr><tr><td>0.5 مل</td><td>Thermo Scientific</td><td>89882</td><td>يخزن في 4 درجات ؛ ج&nbsp;</td></tr><tr><td>حبات زركونيا</td><td>الشوك العلمي</td><td>110791052</td><td></td></tr> <tr><td><قوي > المعدات والمواد الاستهلاكية < / قوي ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>الخرز</td><td>Biospec</td><td>112011EUR</td><td>يمكن استخدام أدوات تجانس أخرى ؛ يجب وضع الشروط الصحيحة لكل متجانس وسلالة.</td></tr><tr><td>محلل حيوي (Agilent) أو ما شابه ذلك لتقييم جودة الحمض النووي الريبي. إذا لم يكن هذا مهما ، فإن مقياس الطيف الضوئي مفيد لتحديد كمية الحمض النووي الريبي.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>أجهزة الطرد المركزي: قادرة على غزل الثقافات عند 4 درجات ؛ ج و 3000 غرام على الأقل. يبرد مسبقا إن أمكن.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>جهاز الطرد المركزي: قادر على تدوير ما يصل إلى 2 مل من الأنابيب بسرعات متغيرة تصل إلى 13,000 جم ووصولا إلى 1000 جم & nbsp ؛</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>رف مغناطيسي لفصل الخرز عن العينة. النسخة المستخدمة في الورقة مطبوعة ثلاثية الأبعاد ، وهي متوفرة من Thingiverse (الشيء: 3562952). رفوف متوفرة Comercially موجودة&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>جهاز PCR بغطاء ساخن يسمح بالحضانة في الظلام.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>عجلة دوارة لتدوير أنابيب 1.5 مل تنتهي على النهاية &nbsp ؛</td><td></td><td></td><td></td></tr> يوصى <tr><td>باستخدام كتلة التسخين المهتزة (مثل Eppendorf Thermomixer)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>أنابيب ، أجهزة طرد مركزي ، احتباس منخفض ،</td> أنابيب H179467N <td></td><td>Eppendorf</td> خالية من RNase 0.5</tr><tr><td>مل ، أجهزة طرد مركزي ، احتباس منخفض ، أنابيب AM12350</td><td></td><td></td><td>Ambion</td> خالية من RNase 1.5</tr><tr><td>مل ، أجهزة طرد مركزي ، 50 مل & nbsp ؛</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.004</td><td>أنابيب الطرد المركزي الأخرى ليست مقاومة للغاز مما يسمح ل CO2 بالذوبان في الميثانول ، وهذا يخرج من الحل بقوة عند إضافة ثقافة دافئة ، مما يؤدي إلى فقدان العينة</td></tr><tr><td>أنابيب ، أجهزة الطرد المركزي ، 15 مل & nbsp ؛</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.001</td><td></td></tr><tr><td>أنابيب ، 2 مل ، غطاء لولبي</td><td>Greiner</td><td>723361</td><td></td></tr><tr><td>أنابيب 0.2 مل شريط من 8 مع أغطية متكاملة</td><td>العلامة</td><td>التجارية 781332</td><td></td></tr></tbody></table>

سريع للغاية ومحددة وضع العلامات الأيضية من الحمض النووي الريبي في فيفو مع 4-ثيوراسيل (ers4tu)

Extremely Rapid and Specific Metabolic Labelling of RNA In Vivo with 4-Thiouracil (Ers4tU)

التماثلية النيوكليوتيدات، 4-الثيوراسيل (4tU)، يتم تناولها بسهولة من قبل الخلايا ودمجها في الحمض النووي الريبي كما يتم تدوينها في الجسم الحي، مما يسمح العزلة من الحمض النووي الريبي المنتجة خلال فترة وجيزة من وضع العلامات. ويتم ذلك عن طريق إرفاق moiety البيوتين إلى مجموعة ثيو المدرجة وتنقية التقارب، وذلك باستخدام الخرز المغلفة streptavidin. تحقيق عائد جيد من الحمض النووي الريبي النقي، توليفها حديثا التي هي خالية من الحمض النووي الريبي الموجودة من قبل يجعل أقصر أوقات وضع العلامات ممكن ويسمح زيادة الدقة الزمنية في الدراسات الحركية. هذا هو بروتوكول لتنقية محددة جدا، وارتفاع العائد من RNA توليفها حديثا. يصف البروتوكول المعروض هنا كيف يتم استخراج الحمض النووي الريبي من الخميرة Saccharomyces سيريفيسياي. ومع ذلك، يجب أن يكون بروتوكول تنقية الحمض النووي الريبي الثيولاتي من إجمالي الحمض النووي الريبي فعالاً باستخدام الحمض النووي الريبي من أي كائن حي بمجرد استخراجه من الخلايا. الحمض النووي الريبي النقي هو مناسبة للتحليل من قبل العديد من التقنيات المستخدمة على نطاق واسع، مثل النسخ العكسي-qPCR، RNA-seq وSLAM-seq. خصوصية وحساسية ومرونة هذه التقنية تسمح رؤى لا مثيل لها في استقلاب الحمض النووي الريبي.

استخدام uracil ثيولاتيل لحساسة وعلى وجه التحديد تنقية الحمض النووي الريبي المنقولة حديثا من الخميرة Saccharomyces سيريفيسياي.

سريع للغاية ومحددة وضع العلامات الأيضية من الحمض النووي الريبي في فيفو مع 4-ثيوراسيل (Ers4tU)

The nucleotide analogue, 4-thiouracil (4tU), is readily taken up by cells and incorporated into RNA as it is transcribed in vivo, allowing isolation of ...

هذه الطريقة هامة لأنه لا يوجد بروتوكول آخر يسمح الحمض النووي الريبي توليفها حديثا ليتم تحليلها في مثل هذا النطاق الزمني القصير، والسماح تجارب النبض مطاردة مع مثل هذا النبض القصير. يعمل هذا البروتوكول بشكل جيد مع استنفاد البروتين، مثل بروتوكول أفضل AID 4U. الميزة الرئيسية هي أن الخلفية منخفضة.وهذا يسمح لأوقات وضع العلامات قصيرة، عن طريق إزالة تقريبا كل الحمض النووي الريبي غير ناول. كما يفصّل البروتوكول المكتوب العديد من أنواع التجارب المختلفة التي يمكن إجراؤها وكيفية دمجها في هذه التقنية. لبدء هذا الإجراء، تنمو الخميرة في YMM المتوسطة إلى 600 OD بين 0.6 و 0.8.في غطاء الدخان، أضف ميثانول يعادل 30 إلى 50٪ من حجم العينة المقصود إلى أنبوب 50 ملليلتر. أغلق الأنابيب بإحكام، وضع علامة عليها، ووضعها على الجليد الجاف للبرد. بعد ذلك، تسمية أنابيب مليلتر لتخزين العينات على المدى الطويل ووضعها على الجليد لتبرد.إضافة حبات الزركونيا إلى أنابيب ملليلتر اثنين. يبرد على الأقل ملليلتر من الماء لكل عينة على الجليد. إذا كان سباج S.pombe هو أن تضاف إلى الثقافة، ووضع aliquot من thiolated S.pombe الخلايا على الجليد للذوبان.دوامة aliquot المذابة وإضافته إلى الثقافة. ثم إضافة 4tU إلى الثقافة إلى تركيز 10 ميكرومولار ومزيج بقوة. ثيو التسمية لمدة زمنية تتراوح بين 15 ثانية وخمس دقائق.أخذ عينات من الثقافة على فترات منتظمة إلى نهاية الدورة الزمنية. تضاف كل عينة إلى أحد أنابيب الطرد المركزي المعدة التي تحتوي على الميثانول. ختم كل أنبوب، يهز لخلط جيدا، ووضعها على الجليد الجاف.بمجرد أخذ كل العينات، ضعها كلها على الجليد. تأكد من أن أيا من العينات قد جمدت. إذا كان أي قد جمدت، والدفء لهم بلطف في اليد في حين عكس باستمرار.أجهزة الطرد المركزي الخلايا في 3،000 مرات ز وعلى أربع درجات مئوية لمدة دقيقتين ل بيليه الخلايا. صب قبالة السائل، وإعادة تعليق بيليه في ما لا يقل عن ملليلتر من الماء البارد الجليد عن طريق الأنابيب بقوة صعودا وهبوطا. نقل التعليق إلى أنبوب غطاء المسمار المعدة ووضع الأنبوب على الجليد.أجهزة الطرد المركزي العينات لفترة وجيزة في سرعة أكبر من 13،000 مرات ز لإعادة بيليه الخلايا. ثم ضعها مرة أخرى على الجليد، وإزالة السائل. أولا، إضافة في 400 ميكرولترات من AE العازلة، 40 ميكرولترات من SDS، و 800 ميكرولترات من الفينول في درجة الحموضة منخفضة.إعادة الاعتماد عن طريق دوامة لمدة 10 ثوان. ثم lyse الخلايا في التجانس لمدة ثلاثة رشقات نارية لمدة دقيقتين في أدنى إعداد الطاقة. اترك العينات على الجليد لمدة دقيقتين بين نبضات التجانس.وضع الخلايا الليسين على الجليد الجاف لمدة خمس دقائق حتى يقوي. بعد ذلك، استخدم ميكروسنتريفروج لتدور الخلايا بسرعة أكثر من 13،000 مرات ز لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، قم بإجراء استخراج الكلوروفورم الفينول واستخراج الكلوروفورم كما هو موضح في بروتوكول النص.إضافة ما بين 1/3 إلى 1/2 من حجم 10 كلوريد الليثيوم المولر ومزيج لترسب الجيش الملكي النيبالي. جهاز طرد مركزي بسرعة تزيد عن 13,000 مرة ز لمدة خمس دقائق. إزالة السائل، لفترة وجيزة إعادة تدور عينة لإزالة الدريغ.ثم، وغسل بيليه مع 300 إلى 500 ميكرولتر من 70٪ الإيثانول. الطرد المركزي بيليه غسلها لفترة وجيزة، وإزالة أي الإيثانول المتبقية. إعادة حل بيليه RNA في 90 ميكرولترات من TE في درجة حرارة 7.0 عن طريق التدفئة في 65 درجة مئوية في حين تهتز.بعد التحقق من solubilization RNA الكامل، نقل التعليق إلى أنبوب 0.2 ملليلتر. للبدء، biotinylate بإضافة 10 ميكرولترات من حل HPDP-البيوتين إلى الحمض النووي الريبي وخلطها جيدا. احتضان في الظلام في 65 درجة مئوية لمدة 15 إلى 30 دقيقة.المقبل, إعداد حجم الراتنج الصغيرة, عمود استبعاد حجم لاستبعاد البيوتين غير مدمج. إزالة العلامة السفلية من العمود، وتخفيف الغطاء، ووضع العمود في أنبوب جهاز طرد مركزي ملليلتر اثنين. أجهزة الطرد المركزي في 1,500 مرات ز لمدة دقيقة واحدة لطرد العازلة وتجاهل تدفق من خلال.ثم أضف بلطف 0.3 ملليلتر من TE إلى أعلى العمود وتدور مرة أخرى باستخدام نفس الشروط. نقل العمود غسلها إلى أنبوب 1.5 ملليلتر الطازجة. عند اكتمال عملية الحضانة، أضف العينة إلى أعلى العمود.جهاز طرد مركزي في 1,500 مرات ز لمدة دقيقتين, ترك عينة الحمض النووي الريبي الحيوية في الجزء السفلي من الأنبوب. تجاهل العمود. وإضافة 1/3 إلى 1/2 حجم 10 كلوريد الليثيوم المولر إلى الأنبوب الذي يحتوي على العينة.مزيج لإعادة العجلة الجيش الملكي النيبالي. أولاً، إعادة حل الحمض النووي الريبي في 200 ميكرولتر من المياه المعالجة DEPC. قياس تركيز RNA، وحساب الكميات لكل عينة من شأنها أن تعطي كميات متساوية من RNA لجميع العينات.أضف هذه الكمية من الحمض النووي الريبي إلى أنبوب جديد، وأضف المياه المعالجة من DEPC مرة أخرى إلى حجم إجمالي قدره 200 ميكرولتر. عندما تكون العينة في درجة حرارة الغرفة، أضف 25 ميكرولترات من 10 × المخزن المؤقت NaTM، 25 ميكرولترات من فوسفات الصوديوم الضرس واحد، و 2.5 ميكرولترات من 10٪ SDS. اخلطي جيداً، والطرد المركزي برفق عند حوالي 100 مرة من الـ g لمدة تقل عن 30 ثانية.إعداد مليلترين من العازلة حبة لكل عينة مع واحد X NaTM العازلة، 0.1 فوسفات الصوديوم الضرس، و 0.1٪SDS. إضافة 50 ميكرولترات من الخرز streptavidin إلى انخفاض الاحتفاظ أنبوب 1.5 ملليلتر. وضع أنبوب على رف المغناطيسي وانتظر الخرز لتسوية.ثم، إزالة السائل عن طريق الطموح. لغسل الخرز، إضافة 200 ملليلتر من العازلة حبة ودوامة حتى يتم إعادة تعليق كامل بيليه حبة. جهاز طرد مركزي الأنبوب في حوالي 100 مرة ز لمدة أقصاها خمس ثوان.ضع الأنبوب في الحامل المغناطيسي للسماح بالتقاط الخرز بواسطة المغناطيس. إزالة السائل عن طريق الطموح إذا كان هناك عدد قليل من العينات. صب قبالة السائل ومن ثم التعرق إذا كان هناك العديد من العينات.كتلة مع 200 ميكرولترات من العازلة حبة، 10 ميكرولترات من الجليكوجين، و 2.5 ميكرولترات من الرنا. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة في حين أن نهاية الدورية على نهاية بسرعة معتدلة. بعد ذلك، قم بإزالة السائل واغسل مرة أخرى، كما هو موضح في بروتوكول النص.إعادة تعليق الخرز في العينة، واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة أثناء الدورية. خلال هذا الحضانة، وإعداد أنبوب 1.5 ملليلتر جديدة لكل عينة. إضافة 1/10 حجم من ثلاثة خلات الصوديوم الضرس في الأسي 5.3 و 20 ميكروغرام من الجليكوجين.أجهزة الطرد المركزي في حوالي 100 مرة ز لمدة ثلاث ثوان. إزالة الجيش الملكي النيبالي غير من الخرز، وغسلها كما هو موضح في بروتوكول النص. لeeute الجيش الملكي النيبالي، إضافة 50 ميكرولترات من 0.7 الطازجة أعدت بيتا mercaptoethanol إلى الخرز.بعد الدوامة والطرد المركزي، ضع الطين في الحامل المغناطيسي. Pipette الحمض النووي الريبي التي تحتوي على حل في أجهزة الطرد المركزي 1.5 milliliter أعدت. Elute مرة أخرى كما وصف سابقا.ثم، ضع العينة مرة أخرى في الحامل المغناطيسي لإزالة الخرز المتبقي من الحمض النووي الريبي المائل ونقل السائل إلى أنبوب طرد مركزي جديد منخفض الربط 0.5 ملليلتر. اخلطي العينة. ثم إضافة 2.5 مجلدات من الإيثانول لترسب ن سرنا.بعد خلط واحتضان، والطرد المركزي بسرعة لا تقل عن 13،000 مرات ز و4 درجات مئوية لمدة 20 دقيقة. يتم عرض الغلة النموذجية لsnRNA استردادها باستخدام هذا البروتوكول هنا. لاحظ أن استعادة RNA في الوقت نقطة الصفر هو جزء صغير جدا من أن تعافى من نقاط زمنية أطول مع 0.3 ميكروغرام فقط من RNA يجري استردادها من الخلايا حوالي 30 مليار.بعد 30 ثانية فقط من وضع العلامات ، ومع ذلك ، يتم جمع أكثر من ضعف الحمض النووي الريبي من نفس العدد من الخلايا. في أثر تحليل حيوي، يمكن رؤية سلائفنا الحمض النووي الريبي على أنها قمة قريبة من 1000 نوكليوتيدات ومضاعفة من القمم في 1، 700 إلى 1، 800 نيوكليوتيدات. وتزداد وفرة هذه الوسيطات مع استمرار التصبغ.ثم يتم تنفيذ ثيوليشن مع عينات يجري أخذها في 15 فواصل ثانية من بداية وضع العلامات thio ويتم رصد معالجة ACT1 RNA نسخة. كما يمكن أن ينظر إليه قبل مرنا و lariats يتم إنشاؤها حتى بعد 15 ثانية فقط من وضع العلامات. بعد حوالي 45 ثانية إلى دقيقة واحدة، وكمية من لاريات وما قبل مرنا التوصل إلى التوازن مع أكبر قدر من هذه الأنواع الحمض النووي الريبي التي يتم إنشاؤها عن طريق النسخ كما تتم معالجتها بعيدا عن طريق الربط.والخطوات الأكثر صعوبة هي تلك التي تنطوي على الخرز، وغسل، والحجب. يجب الحرص على عدم فقدان الخرز، أو السماح لهم تجف. مرة واحدة لديك تنقية RNA توليفها حديثا، يمكنك استخدام أي إجراء تحليل الحمض النووي الريبي التقليدية.من المستحسن أن تقوم بتشغيل RNA على محلل حيوي أو ما شابه ذلك. بعد ذلك، ونحن عادة استخدام QPCR والرنا-SEQ لتحليل الجيش الملكي النيبالي. أثبتت هذه الطريقة مثالية لتحليل حركية معالجة الحمض النووي الريبي.الخطوات الأكثر خطورة هي تلك التي تستخدم الفينول والكلوروفورم في استخراج الحمض النووي الريبي. في أي وقت يمكنك استخدام هذه المواد الكيميائية في حاوية غير محكم، القيام بذلك في غطاء الدخان، وارتداء الملابس الواقية المناسبة، ومعطف مختبر، والقفازات. خذ عناية خاصة أن هناك لا حبات الزركونيا في الخيط من أنبوب غطاء المسمار، لأن ذلك سيؤدي إلى تسرب.

extremely-rapid-specific-metabolic-labelling-rna-vivo-with-4

Research

JoVE Journal

Biochemistry

الكيمياء الحيوية

محاضر RNA تخضع للتنظيم واسعة posttranscriptional التي توسطت فيها العديد من البروتينات الحمض النووي الريبي ملزم عبر التمثيل (الممارسات التجارية التقييدية). هنا نقدم طريقة للتعميم لتحديد بدقة وعلى نطاق واسع transcriptome - RNA المواقع ملزمة الممارسات التجارية التقييدية.

PAR كليب -- وسيلة لتحديد نطاق Transcriptome مواقع الربط من البروتينات الحمض النووي الريبي تجليد

يوفر مجموع RNA الخلوية قالب الفقيرة لدراسة التغيرات قصيرة الأجل في تخليق الحمض النووي الريبي والاضمحلال وكذلك حركية معالجة RNA. هنا، نحن تصف وضع العلامات الأيضية من الحمض النووي الريبي المحولة حديثا مع 4 thiouridine تليها biotinylation ثيول محددة وتنقية RNA المحولة حديثا السماح للتغلب على هذه القيود.

وصفها الأيضية من الحمض النووي الريبي كتب حديثا للدقة عالية التنميط التعبير الجيني من تخليق الحمض النووي الريبي، ومعالجة تسوس في خلية ثقافة

ويصف هذا البروتوكول اندماجي استخدام رقاقة seq 4sU seq، وتسلسل الحمض النووي الريبي مجموع والريبوسوم التنميط لخطوط الخلايا والخلايا الأولية. فإنه يمكن تتبع التغييرات في النسخ-عامل ملزم، النسخ حيثياته وتجهيز الجيش الملكي النيبالي، ودوران والترجمة على مر الزمن، وعرض مسار الأحداث عموما في الخلايا المنشط و/أو المتغيرة بسرعة.

تحليل في الوقت الحقيقي النسخ عامل ملزم، النسخ والترجمة، ودوران لعرض الأحداث العالمية خلال التنشيط الهاتف الخلوي

يصف لنا منصة تحليل الحمض النووي الريبي نقل الأصلي المسمى بقعة (منهاج مبسط لمراقبة الحمض الريبي النووي النقال). بقعة في الوقت ذاته تدابير الخلوية مستويات ترنس جميع العينات البيولوجية وفي ثلاث خطوات فقط، وفي أقل من 24 ساعة.

وسم الأيضية والتنميط لنقل الكشف باستخدام ماكروارايس

يمكن استخدام هذا الأسلوب لقياس توليف الحمض النووي الريبي. 5-بروموريديني هو إضافة إلى الخلايا وإدماجها في الجيش الملكي النيبالي تجميعي. توليف الحمض النووي الريبي يقاس باستخراج الحمض النووي الريبي فورا بعد وضع العلامات، تليها إيمونوبريسيبيتيشن 5-بروموريديني-استهدفت توسم الجيش الملكي النيبالي والتحليل بالنسخ العكسي والكمية تفاعل البوليميراز المتسلسل.

التحقيق في توليف الحمض النووي الريبي استخدام الوسم 5-بروموريديني وإيمونوبريسيبيتيشن

البروتوكول هو موضح هنا يستند إلى التحديد الكمي للمركب حديثا مرناً تنقيته من خلايا الخميرة المسمى مع 4-ثيوراسيل على نطاق الجينوم. هذا الأسلوب يسمح بقياس توليف مرناً فصل من تسوس مرناً، ويوفر بالتالي، قياس دقيق للحمض النووي الريبي بوليميراز الثاني النسخ.

Saccharomyces cerevisiae الأيضية وسم مع 4-ثيوراسيل والتحديد الكمي حديثا توليفها مرناً كوكيل للنشاط الثاني رنا بوليميراز

تصف هذه المقالة وضع العلامات ثنائية اللون للحمض النووي الريبي الطويل في مواضع النهاية وتثبيت سطحها عن طريق التغليف في حويصلات الفوسفوليبيد لتطبيقات الفحص المجهري أحادي الجزيء FRET TIRF. يتيح الجمع بين هذه التقنيات التصور الدقيق وتحليلا لديناميكيات الحمض النووي الريبي على مستوى الجزيء الفردي.

وضع العلامات الطرفية الفلورية وتغليف الحمض النووي الريبي الطويل للفحص المجهري أحادي الجزيء FRET-TIRF

يصف هذا البروتوكول الكمي السريع وحساسة للغاية من فورستر نقل الطاقة الرنين (الحنق) بيانات الاستشعار باستخدام المحمولة محلل الحنق حسب الطلب. تم استخدام جهاز لكشف المالتوز ضمن نطاق درجة الحرارة الأهمية بمكان أن يزيد حساسية الكشف، مما يتيح تقييم عملي وفعال من محتوى السكر.

حساسة للغاية وسريع كشف الإسفار مع محلل الحنق المحمولة

يمكن أن يؤثر امتصاص الببتيد &lt; p class = 'jove_content '&gt; للأواني البلاستيكية أثناء التخفيفات التسلسلية التقليدية القائمة على الأطراف بشكل كبير على تحديد الفاعلية ويربك فهم علاقات الهيكل والنشاط المستخدمة لتحديد الرصاص ومراحل تحسين الرصاص لاكتشاف الأدوية. هنا يتم وصف طرق التخفيف التسلسلي الصوتي الآلي غير الملامس لعينات الببتيد.

الآلي الصوتية الاستغناء عن التخفيف المسلسل من الببتيد ناهضات في الفعالية تحديد فحوصات

يصف لنا وضع بروتوكول لتحديد البروتينات ملزم الجيش الملكي النيبالي ورسم خريطة مناطقها ربط الحمض النووي الريبي في الخلايا الحية باستخدام فوتوكروسلينكينج بوساطة الأشعة فوق البنفسجية والطيف الكتلي.

إعداد نموذج لتحديد الهوية الجماعية على أساس قياس الطيف الكتلي للجيش الملكي النيبالي-ربط المناطق

تعلم تقنية تسمية الحمض النووي الريبي باستخدام اليوراسيل الكبريتي لتحليل سريع ودقيق في خميرة Saccharomyces cerevisiae. تتيح هذه الطريقة إجراء تجارب النبض والمطاردة بفترات زمنية قصيرة جداً مع خلفية منخفضة.

سريع للغاية ومحددة وضع العلامات الأيضية من الحمض النووي الريبي في فيفو مع 4-ثيوراسيل (Ers4tU)

استكشف المزيد من الفيديوهات