استخدام مجموعة مستضد الأنفلونزا الدقيقة لقياس اتساع الأجسام المضادة للمصل عبر الأنواع الفرعية للفيروس

يسمح مستضد الإنفلونزا الصغير بالقياس المتزامن لأشكال الأجسام المضادة المتعددة ضد أكثر من 300 سلالة من الأنفلونزا من حجم عينة دم صغير لم ميكرولتر واحد فقط. يسهل microarray قياس عالية الإنتاجية من اتساع الأجسام المضادة للأنفلونزا عبر المشهد المضاد للضداد من سلالات الأنفلونزا. من خلال وصف الأجسام المضادة للأنفلونزا بمزيد من التفصيل مما كان ممكنا في السابق ، يمكن أن تساعد هذه microarray تحديد سبب بعض الناس تطوير عدوى الأنفلونزا وغيرها لا.

وقد تم تطبيق تقنية المستضدات الصغرى على 35 مسببات أمراض مختلفة في مختبرنا، مما يسمح بقياس الأجسام المضادة مقابل 60،000 أهداف مستضد ومن 50،000 عينة مصل تم جمعها من حالات الأمراض المعدية والضوابط الصحية في جميع أنحاء العالم. بعد أن درس هذه التقنية من خلال ورش العمل الشخصية ، وجدنا أن القدرة على إثبات بصريا لهذه التقنية أمر بالغ الأهمية لفهمها وأدائها. ومن خلال هذا الإجراء، سيكون آل جاسينسكاس ورافائيل دي أسيس، علماء المشروع من مختبرنا.

لطباعة المستضدات باستخدام طابعة microarray، حدد طابعة ذات حجم منخفض microarray اكتشاف دبابيس التي يمكن أن تتبخر المستضدات من لوحة مصدر 384 جيدا في قناة عينة وإيداع المستضدات عن طريق الاتصال المباشر والعمل الشعري على 16 لوحة الشرائح الزجاجية المغلفة نيتروسيلولوس. في برنامج الطباعة، أدخل عدد اللوحات التي سيتم استخدامها في مربع نص عدد اللوحات وحدد نوع اللوحة الذي سيتم استخدامه للتحليل. حدد تكوين دبوس وتعيين إزاحات الأصل إلى المسافات بين أصل الشريحة والموقع حيث ستبدأ دبابيس الطباعة الطباعة على الشرائح.

ضمن علامة تبويب تصميم الصفيف، حدد حجم وشكل الصفائف وحدد المعلمات لكيفية التقاط دبابيس الطباعة و توزيعها على العينات. تكوين البروتوكولات تنظيف دبوس ونشاف وتحديد التسلسل الذي يتم طباعة كتل العينة على الشرائح. سوف برنامج الصفيف بناء ملف فهرس الشبكة مشروح لوصف ترتيب المستضدات داخل كل microarray.

بعد برمجة برنامج الطباعة مع البروتوكول المطلوب، بدء تشغيل الطباعة. عند الانتهاء، ضع شرائح microarray غير منقوشة في مربع مقاوم للضوء في خزانة مجففات في درجة حرارة الغرفة. للتحقيق سيرا للأجسام المضادة على microarray، استخدم لقطات لإرفاق الشرائح microarray وسادة الجانب حتى على غرف التحقيق ووضع الغرف في الإطارات.

كن حذرا عند تجميع الشرائح، كما يتم كسرها بسهولة والتحقق من أي تسرب بعد الإماهة. إذا لزم الأمر، تفكيك وإعادة تجميع الشرائح لإصلاح التسريبات. Rehydrate الشرائح مع 100 ميكرولترات من العازلة حجب المصفاة في البئر وتمييع سيرا في نسبة واحد إلى 100 في 100 ميكرولترات من العازلة حظر لكل عينة.

ثم، احتضان الشرائح microarray rehydrated وsera المخفف لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة و 100 إلى 250 التناوب في الدقيقة الواحدة على شاكر المدارية. في نهاية الحضانة، استخدم نصائح الماصات المتصلة بخط فراغ مع قارورة تجميع ثانوية لطامح المخزن العازل للحجب بعناية من زاوية كل غرفة دون لمس الوسادات وإضافة سيرا المخففة على الفور إلى الوسادات دون السماح للمنصات بالجفاف. ثم، ضع الإطارات المغطاة في صواني تحتوي على مناشف ورقية رطبة مختومة للحفاظ على الرطوبة واحتضان الإطارات بين عشية وضحاها عند أربع درجات مئوية على شاكر هزاز.

بالنسبة لنقطة الكم المترافقة مع وضع العلامات المضادة الثانوية ، اضمب بعناية السراج كما هو موضح للتو وشطف الشرائح مع ثلاثة يغسل في 100 ميكرولترات من العازلة TTBS الطازجة في البئر لمدة خمس دقائق لكل منها على شاكر المدارية. ثم يتم احتضان الشرائح مع خليط من الأجسام المضادة الثانوية النقطة الكمومية ثم غسلها ثلاث مرات كما هو موضح في البروتوكول، وذلك باستخدام نفس الأسلوب كما أظهرت للتو. بعد الغسيل الأخير، قم بإزالة الشرائح بعناية من الغرف وشطف الشرائح بلطف بالماء المقطر المزدوج المصفى ثم ضع كل شريحة في أنبوب 50 ملليلتر.

ثم، جفف الشرائح عن طريق الطرد المركزي. للحصول على صور الشرائح microarray، أولاً بدوره على الصورة المحمولة ووضع بعناية الشريحة أن تكون صورة الوجه إلى أسفل في حامل الشريحة في غرفة التصوير. افتح برنامج التصوير وتحت علامة تبويب imager تكوين، حدد تكوين الشريحة المناسبة.

ضمن علامة التبويب التحكم في الصورة، حدد القناة الفلورية المناسبة وقم بضبط مرات التعرض والاكتساب حسب التفاعل مع الـ sera. ثم انقر فوق التقاط لبدء الحصول على الصورة. في نهاية عملية الاستحواذ، استخدم الشبكات الموجهة على علامات فيدوسيل للكشف عن بقع الصفيف.

لقياس كثافة البقعة، في لوحة معلومات الملف، قم بتحميل ملف GAL وحدد المجلد الذي سيتم حفظ ملفات إخراج التحليل فيه في قسم خيارات التحليل. ضمن علامة التبويب التحكم في الصورة، افتح إحدى الصور التي تم الحصول عليها ليتم تحديدها كمًا وتحديد تلقائي. في قسم تحليل الصفيف، قم بإنشاء قالب fiducial كما هو معبّر من قبل البرنامج.

انقر فوق تحليل المجموعة لتحديد المجلد الذي يحتوي على الصور التي سيتم تحديدها كمياً وحدد القالب fiducial الذي تم إنشاؤه للتو. سيقوم البرنامج بتحليل كل صورة وقياس شدة البقعة. ثم، تحليل البيانات الخام لمقارنة ربط الأجسام المضادة عبر المستضدات وعبر عينات المصل.

في هذه الدراسة التمثيلية، كانت الأجسام المضادة الثانوية المستخدمة الماعز المضادة للإنسان IgG مترافق إلى نقطة كم تنبعث منها في 800 نانومتر والماعز المضادة للإنسان IgA مترافق إلى نقطة الكم التي تنبعث منها في 585 نانومتر للكشف المتعدد من الأجسام المضادة IgG وIgA على التوالي. في الخريطة الحرارية الناتجة، تم تسمية الأنواع الفرعية ذات الصلة سريرياً فقط مع التمثيل العالي لتوفير مساحة مع علامة الجمع تدل على جميع الأنواع الفرعية المتبقية من عدد أعلى. تم تجميع مصل IgA وIgG من خلال أشكالها الجزيئية ونييرامينيداز والأنماط الفرعية.

لإثبات خصوصية عالية من الأجسام المضادة مجموعة الرأس hemagglutinin ل الأنواع الفرعية السريرية وعالية عبر التفاعل من هيماغلوتينين كامل triamerized الأجسام المضادة hemagglutinin كله مع إدراج منطقة الأسهم. يمكن تأكيد استجابات الأجسام المضادة للأنفلونزا التي تم قياسها على الميكروتراي بالتقنيات التقليدية، بما في ذلك تثبيط الهدوغلوتينية ومقايسات القياس الجزئي. وقد أنتجت هذه التقنية رؤى في النوع الفرعي لخصائص الأجسام المضادة لمجموعة الرأس الأنفلونزا والأهمية النسبية للأجسام المضادة IgA وIgG لقابلية الإصابة بالأنفلونزا.

وفي حين أن أياً من هذه المواد لا ينطوي على أي خطر شديد، فإنه ينبغي معالجة جميع عينات المصل البشري وفقاً لبروتوكولات السلامة البيولوجية المؤسسية.