توليد عالي الكفاءة من الخلايا T السامة للماوس الأولية الخاصة بالمستضد للاختبار الوظيفي في نموذج مرض السكري المناعي الذاتي
August 16th, 2019
توضح هذه المقالة بروتوكولًا لتوليد خلايا CD8 T الخاصة بالمستضد، وتوسيعها في المختبر، بهدف إنتاج أعداد كبيرة من الخلايا T الوظيفية لاستخدامها في المختبر وفي الجسم الحي.
هذا البروتوكول يسمح لك لتوليد عدد كبير من الخلايا التائية المستضد وظيفية محددة التي هي النهج المطلوب آمنة في علاج أمراض المناعة الذاتية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها توفر لك عملية تحويل عالية الكفاءة وعدد كبير من الخلايا التائية الوظيفية. يمكن توسيع هذه التقنية لعلاج مرض السكري من النوع 1 وأمراض المناعة الذاتية الأخرى التي تعرف المستضدات.
وعلاوة على ذلك، قد تكون خلايا CAR T علاج واعد لأنواع معينة من السرطان. يمكن استخدام هذه الطريقة لتوليد خلايا مناعية تعبر عن الـ CARs الأخرى. من المهم أن يكون لديك تقنية مقبولة جيدة ، وقراءة البروتوكول بأكمله وخطة التجربة بأكملها مقدما.
هذا البروتوكول لمدة أسبوعين يتضمن خطوات مصغرة والنجاح يعتمد على الأداء السليم لكل خطوة. إن العروض التوضيحية المرئية لهذه الطريقة أمر بالغ الأهمية بالنسبة للمتعلمين لمتابعة بشكل صحيح. إعداد خلايا فينيكس للانعلاق كما هو موضح في المخطوطة.
ومن الممارسات الجيدة لوضع علامة على الجدار الجانبي حيث سيتم إضافة المتوسطة وإزالتها لتقليل تهب قبالة الخلايا. في اليوم صفر يتبخر من الخلايا ويغسلها بخمسة ملليلترات من PBS. إضافة بعناية سبعة ملليلتر من انخفاض قطرة متوسطة المصل إلى الجدار الجانبي من لوحة ونقل الخلايا مرة أخرى إلى الحاضنة.
إضافة 1.5 ملليلتر من متوسطة المصل انخفاض إلى اثنين من 14 ملليمتر جولة أسفل أنابيب البولي بروبلين. إضافة 40 ميكرومتر من كاشف transfection إلى واحد من الأنابيب و 15 ميكروغرام من الأجسام المضادة إعادة توجيه CAR plasmid جنبا إلى جنب مع خمسة ميكروغرام من بلازميد التعبئة والتغليف إلى الآخر. احتضان الأنابيب في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق ثم إضافة كاشف transfection إلى أنبوب البلازميد.
مزيج عن طريق الأنابيب بلطف الحل صعودا وهبوطا ثلاث مرات واحتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة على الأقل. إضافة ثلاثة ملليلتر من الخليط إلى خلايا فينيكس ووضعها في حاضنة زراعة الأنسجة. بعد أربع إلى خمس ساعات إضافة ملليلتر واحد من FCS إلى الخلايا وثقافتها بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
في اليوم التالي، إزالة ناظر من الخلايا وإضافة أربعة ملليلتر من ثقافة جديدة قبل الدفء المتوسطة. حصاد الفيروس في اليوم الثاني عن طريق جمع الفيروس الذي يحتوي على المتوسطة من خلايا فينيكس وتصفية لإزالة بقايا حطام الخلية. إضافة المؤتلف البشرية IL-2 المخزون إلى الفيروس لتركيز النهائي من 200 وحدة دولية لكل ملليلتر واستخدامها على الفور في النقل.
إضافة أربعة ملليلتر من المتوسطة الطازجة إلى خلايا فينيكس ووضعها في الحاضنة بين عشية وضحاها. تكرار جمع الفيروسات في اليوم التالي من أجل عملية نقل ثانية وتجاهل الخلايا. يوم واحد قبل بذر مورين CD8 الخلايا T، إضافة ملليلتر واحد من خليط من المضادة للماوس CD3 وCD28 الأجسام المضادة لكل بئر من 24 لوحة جيدا واحتضان لوحة بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية.
في اليوم صفر، حصاد الطحال الماوس ووضعها على مصفاة الخلية نقع في 10 ملليلتر من برنامج تلفزيوني في طبق ثقافة الخلية على الجليد. في غطاء لثقافة الخلية، قطع كل طحال إلى ثلاث إلى خمس قطع واستخدام المكبس العقيم من حقنة للضغط على الأنسجة من خلال شبكة الأسلاك. إزالة بلطف خلايا الدم الحمراء عن طريق إعادة تعليق الطحال في واحد إلى أربعة المخفر خلية حمراء مخففة واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق ثم تمييع 10 ميكرولترات من تعليق الخلية مع Trypan الأزرق لعد الخلايا.
وبليه بقية الخلايا عن طريق الطرد المركزي في 350 مرات ز لمدة سبع دقائق. استخدام ماوس CD8 T خلية عزل عدة لإثراء CD8 الخلايا T وتعليق الكريات الخلية في 400 microliters من المخزن المؤقت مع 100 ميكرولترات من كوكتيل الأجسام المضادة الحيوية لكل مرة واحدة 10 إلى الخلايا الثامنة. اخلطي تعليق الخلية جيداً وحضنيها لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية للسماح بربط الأجسام المضادة.
ثم إضافة 300 ميكرولتررس من وضع العلامات العازلة و 200 ميكرولترات من ميكروبينتين المضادة للMicroBeads لكل مرة واحدة 10 إلى الخلايا الثامنة. اخلطي جيداً وينكضن لمدة 10 دقائق أخرى عند أربع درجات مئوية. وفي الوقت نفسه، قم بإعداد عمود فصل على الفاصل وغسله بثلاثة ملليلترات من المخزن المؤقت للتسمية.
وضع مصفاة 40 ميكرومتر الخلية على الجزء العلوي من عمود وتمرير ملليلتر واحد من خليط الخرزة وخلية من خلال مصفاة في عمود الفصل. جمع تدفق من خلال في أنبوب 15 ملليلتر prechilled وغسل العمود وفقا لتوجيهات الشركة المصنعة، وجمع النفايات السائلة في نفس الأنبوب. عد الخلايا وجمعها عن طريق الطرد المركزي في 350 مرات ز لمدة خمس دقائق.
غسلها مع مليلتر اثنين من خلية تي المتوسطة والطرد المركزي مرة أخرى. ثم resuspend لهم في خلية T قبل الدفء المتوسطة بتركيز من 250، 000 إلى 500، 000 خلية لكل ملليلتر. غسل CD3 أعدت سابقا وCD28 لوحات مضادة المغلفة مع ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني عقيم ثلاث مرات وإضافة ملليلترين من تعليق الخلية إلى كل بئر.
استخدام حركة دوامة لصرف الخلايا بالتساوي. كتحكم، لوحة نفس العدد من خلايا CD8 T في بئر واحد غير مغلفة من لوحة واحتضان الخلايا في 37 درجة مئوية في 10٪ ثاني أكسيد الكربون خزان حاضنة لمدة 48 ساعة. في اليوم الأول ، وإعداد شظايا الليفية البشرية لوحات المغلفة عن طريق إضافة 0.5 ملليلتر من الليفية إلى آبار لوحة 24 جيدا واحتضانه على مدى الليل في أربع درجات مئوية.
في اليوم التالي، وإزالة حل fibronectin وإضافة ملليلتر واحد من 2٪ BSA وBBS في بئر. احتضان لوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة وغسل الآبار المعالجة مع ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني عقيم. لوحة جاهزة للاستخدام بعد إزالة محلول الغسيل.
عد الخلايا T CD8 تنشيط باستخدام الأزرق Trypan. جمعها عن طريق الطرد المركزي. و إعادة تعليقها بخمسة ملايين خلية قابلة للحياة لكل ملليلتر من أجل النقل
إضافة 100 ميكرولترات من تعليق الخلايا CD8 المنشط إلى كل بئر من لوحة مغلفة fibronectin. ثم إضافة 1.5 إلى مليلترين من الفيروس المعد سابقا تحتوي على المتوسطة ومزيج باستخدام حركة دوامة للاستغناء عن الخلايا بالتساوي. ختم لوحة في كيس زيبلوك والطرد المركزي في 2، 000 مرات ز لمدة 90 دقيقة في 37 درجة مئوية.
قم بإزالة اللوحة من جهاز الطرد المركزي واصطُلها إلى خزانة السلامة البيولوجية. إزالة بعناية كيس من البلاستيك والتأكد من أن خارج لوحة غير ملوثة مع المتوسطة. نقل لوحة إلى 37 درجة مئوية من ثاني أكسيد الكربون حاضنة.
بعد أربع ساعات، وإزالة ملليلتر واحد من المتوسطة من كل بئر، واستبدالها بميليلتر واحد من خلية تي كاملة مسبقة المدى المتوسطة ووضع لوحة مرة أخرى في الحاضنة. الجوانب الهامة لهذا البروتوكول هي فيروس تتر عالية، الخلايا التائية تنشيط صحية، وطريقة تحويل المناسبة. وكانت الخلايا الملطخة بالاشتراك مع PE حجم سبعة مترافق المضادة لـ CD8، AF647 مترافق المضادة لـ CD3، وBV 421 مترافق المضادة CD28 لتحليل التدفق السيتوميتري.
تقريباً، 70٪ من خلايا CD8 T شارك في التعبير عن GFP الذي يشير إلى تعبير CAR. كما أعربوا عن مؤتمري المؤتمر 28 و CD3. الأهم من ذلك, كل من اختبار GFP الخلايا الإيجابية أيضا تشارك في الملطخة مع I-Ag7 الأنسولين BR3 tetramers الذي يشير إلى التعبير عن CAR على سطح الخلية ولكن ليس مع رباعية التحكم.
وعلاوة على ذلك، فإن اختبار والسيطرة CAR T الخلايا كل يفرز مستويات عالية من الانفيرون غاما فقط بعد تربية الخلايا المستهدفة مع التعبير عن أربطة المشترك التي تؤكد أن الخلايا العابرة لديها CD8 تأثير T الظاهري الخلية الموجهة نحو الهدف من الأجسام المضادة الأم. إن تحويل خلايا إنتاج الفيروسات، وعزل الخلايا التائية CD8 الأساسية، وتفعيل هذه الخلايا التائية هي أهم خطوات هذه التجربة. وجود خلايا T تنشيط صحية وtransduction من هذه الخلايا التائية مع الكواشف المناسبة يضمن نتائج مواتية.
يمكن استخدام هذا الأسلوب إلى transduce الخلايا T الأخرى ولكن يجب تخصيص لنوع خلية T معينة. يمهد هذا البروتوكول الطريق للوقاية من مرض السكري من النوع 1 مع مستضد مستضدات التكيمية الخاصة بالعلاج بالخلايا T.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
نظرة عامة
تصف هذه المقالة بروتوكولاً لتكوين عدد كبير من الخلايا التائية CD8 المتخصصة في مستضد معين، والتي يمكن استخدامها في علاج أمراض المناعة الذاتية والسرطان. تؤكد التقنية عملية نقل فعّالة للغاية لتوسع الخلايا التائية في المختبر.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلوم
- علم المناعة
- بيولوجيا الخلية
- المناعة الذاتية
الخلفية
- الخلايا التائية CD8 المتخصصة في مستضد معين ضرورية للاستجابات المناعية الفعالة.
- تتطلب أمراض المناعة الذاتية استراتيجيات علاج آمنة وفعالة.
- تمثل الخلايا التائية المعدلة بالمستقبل المضاد للخلايا (CAR T) نهجًا جديدًا في علاج السرطان.
- يمكن أن يؤدي فهم توليد الخلايا التائية إلى تعزيز التطبيقات العلاجية.
هدف الدراسة
- توفير بروتوكول لتكوين خلايا تائية متخصصة في مستضد معين.
- تسهيل توسع الخلايا التائية للاستخدام العلاجي.
- استكشاف التطبيقات في علاج أمراض المناعة الذاتية والسرطان.
الطرق المستخدمة
- تكوين الخلايا التائية CD8 في المختبر.
- عمليات النقل لتوسع الخلايا التائية.
- تقييم فعالية الخلايا التائية.
- التخطيط وتنفيذ البروتوكولات التجريبية.
النتائج الرئيسية
- تكوين ناجح لعدد كبير من الخلايا التائية الفعالة.
- كفاءة عملية النقل المثبتة.
- تطبيقات محتملة في علاج مرض السكري من النوع الأول وأمراض المناعة الذاتية الأخرى.
- يمكن تكوين الخلايا التائية المعدلة بالمستقبل المضاد للخلايا (CAR T) للعلاجات السرطانية المختلفة.
الاستنتاجات
- يوفر البروتوكول طريقة موثوقة لتوليد الخلايا التائية.
- يفتح أبوابًا للبحث في أمراض المناعة الذاتية والسرطان.
- التخطيط السليم واتباع التقنية أمران ضروريان للنجاح.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Efficient generation of antigen-specific primary mouse cytotoxic T cells enables robust functional testing in autoimmune diabetes models, directly supporting early-stage target validation and mechanistic de-risking. High transduction efficiency and cell viability provide predictive confidence for downstream translational research and portfolio triage in autoimmune and immuno-oncology pipelines. This protocol's scalability and adaptability position it as a reusable platform for disease-relevant system interrogation across multiple therapeutic areas.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of disease-driving antigens in autoimmune and cancer models.
- Supports functional validation of therapeutic hypotheses targeting pathogenic epitopes.
- Facilitates mechanistic de-risking by isolating antigen-specific T cell responses.
- Provides a platform for rapid assessment of target engagement and immune modulation.
Screening & Assay Development
- Delivers high-efficiency generation of validated T cells for reproducible assay development.
- Standardizes cell preparation for quantitative functional readouts in screening workflows.
- Enables scalable expansion of engineered T cells for compound or biologic evaluation.
- Supports robust comparison of antigen-specific responses across experimental conditions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models for translational biomarker discovery in autoimmunity.
- Ensures continuity from in vitro validation to in vivo efficacy studies in preclinical pipelines.
- Reduces biological risk by providing predictive functional data on engineered T cell therapies.
- Facilitates risk-adjusted advancement decisions for cell-based therapeutic candidates.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates at the interface of early discovery, lead identification, and preclinical validation, enabling seamless transition from hypothesis testing to translational research.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven testing of antigen-specific immune responses and pathway clarification.
- Screening: Provides reproducible, quantitative outputs for assay standardization and compound evaluation.
- Analytics: Enables flow cytometric and functional readouts to compare engineered T cell phenotypes and activities.
- Translational Research: Bridges in vitro findings with in vivo disease models for biomarker and efficacy alignment.
- Enterprise Reuse: Adaptable to diverse disease models and antigen targets, supporting platform-based R&D strategies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Delivers standardized, scalable, and reproducible T cell generation workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by enabling robust functional testing.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of cell-based therapeutic programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary cell isolation, viral transduction, and flow cytometry analysis.
- Demands access to tissue culture, viral production, and analytical instrumentation infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization of cell handling and assay protocols for reproducibility.
- Adaptation may be needed for different T cell subsets or disease models based on antigen specificity.
- Success depends on maintaining cell viability, high-titer virus, and precise execution of protocol steps.
