توليد عالي الكفاءة من الخلايا T السامة للماوس الأولية الخاصة بالمستضد للاختبار الوظيفي في نموذج مرض السكري المناعي الذاتي

هذا البروتوكول يسمح لك لتوليد عدد كبير من الخلايا التائية المستضد وظيفية محددة التي هي النهج المطلوب آمنة في علاج أمراض المناعة الذاتية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها توفر لك عملية تحويل عالية الكفاءة وعدد كبير من الخلايا التائية الوظيفية. يمكن توسيع هذه التقنية لعلاج مرض السكري من النوع 1 وأمراض المناعة الذاتية الأخرى التي تعرف المستضدات.

وعلاوة على ذلك، قد تكون خلايا CAR T علاج واعد لأنواع معينة من السرطان. يمكن استخدام هذه الطريقة لتوليد خلايا مناعية تعبر عن الـ CARs الأخرى. من المهم أن يكون لديك تقنية مقبولة جيدة ، وقراءة البروتوكول بأكمله وخطة التجربة بأكملها مقدما.

هذا البروتوكول لمدة أسبوعين يتضمن خطوات مصغرة والنجاح يعتمد على الأداء السليم لكل خطوة. إن العروض التوضيحية المرئية لهذه الطريقة أمر بالغ الأهمية بالنسبة للمتعلمين لمتابعة بشكل صحيح. إعداد خلايا فينيكس للانعلاق كما هو موضح في المخطوطة.

ومن الممارسات الجيدة لوضع علامة على الجدار الجانبي حيث سيتم إضافة المتوسطة وإزالتها لتقليل تهب قبالة الخلايا. في اليوم صفر يتبخر من الخلايا ويغسلها بخمسة ملليلترات من PBS. إضافة بعناية سبعة ملليلتر من انخفاض قطرة متوسطة المصل إلى الجدار الجانبي من لوحة ونقل الخلايا مرة أخرى إلى الحاضنة.

إضافة 1.5 ملليلتر من متوسطة المصل انخفاض إلى اثنين من 14 ملليمتر جولة أسفل أنابيب البولي بروبلين. إضافة 40 ميكرومتر من كاشف transfection إلى واحد من الأنابيب و 15 ميكروغرام من الأجسام المضادة إعادة توجيه CAR plasmid جنبا إلى جنب مع خمسة ميكروغرام من بلازميد التعبئة والتغليف إلى الآخر. احتضان الأنابيب في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق ثم إضافة كاشف transfection إلى أنبوب البلازميد.

مزيج عن طريق الأنابيب بلطف الحل صعودا وهبوطا ثلاث مرات واحتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة على الأقل. إضافة ثلاثة ملليلتر من الخليط إلى خلايا فينيكس ووضعها في حاضنة زراعة الأنسجة. بعد أربع إلى خمس ساعات إضافة ملليلتر واحد من FCS إلى الخلايا وثقافتها بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.

في اليوم التالي، إزالة ناظر من الخلايا وإضافة أربعة ملليلتر من ثقافة جديدة قبل الدفء المتوسطة. حصاد الفيروس في اليوم الثاني عن طريق جمع الفيروس الذي يحتوي على المتوسطة من خلايا فينيكس وتصفية لإزالة بقايا حطام الخلية. إضافة المؤتلف البشرية IL-2 المخزون إلى الفيروس لتركيز النهائي من 200 وحدة دولية لكل ملليلتر واستخدامها على الفور في النقل.

إضافة أربعة ملليلتر من المتوسطة الطازجة إلى خلايا فينيكس ووضعها في الحاضنة بين عشية وضحاها. تكرار جمع الفيروسات في اليوم التالي من أجل عملية نقل ثانية وتجاهل الخلايا. يوم واحد قبل بذر مورين CD8 الخلايا T، إضافة ملليلتر واحد من خليط من المضادة للماوس CD3 وCD28 الأجسام المضادة لكل بئر من 24 لوحة جيدا واحتضان لوحة بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية.

في اليوم صفر، حصاد الطحال الماوس ووضعها على مصفاة الخلية نقع في 10 ملليلتر من برنامج تلفزيوني في طبق ثقافة الخلية على الجليد. في غطاء لثقافة الخلية، قطع كل طحال إلى ثلاث إلى خمس قطع واستخدام المكبس العقيم من حقنة للضغط على الأنسجة من خلال شبكة الأسلاك. إزالة بلطف خلايا الدم الحمراء عن طريق إعادة تعليق الطحال في واحد إلى أربعة المخفر خلية حمراء مخففة واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق ثم تمييع 10 ميكرولترات من تعليق الخلية مع Trypan الأزرق لعد الخلايا.

وبليه بقية الخلايا عن طريق الطرد المركزي في 350 مرات ز لمدة سبع دقائق. استخدام ماوس CD8 T خلية عزل عدة لإثراء CD8 الخلايا T وتعليق الكريات الخلية في 400 microliters من المخزن المؤقت مع 100 ميكرولترات من كوكتيل الأجسام المضادة الحيوية لكل مرة واحدة 10 إلى الخلايا الثامنة. اخلطي تعليق الخلية جيداً وحضنيها لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية للسماح بربط الأجسام المضادة.

ثم إضافة 300 ميكرولتررس من وضع العلامات العازلة و 200 ميكرولترات من ميكروبينتين المضادة للMicroBeads لكل مرة واحدة 10 إلى الخلايا الثامنة. اخلطي جيداً وينكضن لمدة 10 دقائق أخرى عند أربع درجات مئوية. وفي الوقت نفسه، قم بإعداد عمود فصل على الفاصل وغسله بثلاثة ملليلترات من المخزن المؤقت للتسمية.

وضع مصفاة 40 ميكرومتر الخلية على الجزء العلوي من عمود وتمرير ملليلتر واحد من خليط الخرزة وخلية من خلال مصفاة في عمود الفصل. جمع تدفق من خلال في أنبوب 15 ملليلتر prechilled وغسل العمود وفقا لتوجيهات الشركة المصنعة، وجمع النفايات السائلة في نفس الأنبوب. عد الخلايا وجمعها عن طريق الطرد المركزي في 350 مرات ز لمدة خمس دقائق.

غسلها مع مليلتر اثنين من خلية تي المتوسطة والطرد المركزي مرة أخرى. ثم resuspend لهم في خلية T قبل الدفء المتوسطة بتركيز من 250، 000 إلى 500، 000 خلية لكل ملليلتر. غسل CD3 أعدت سابقا وCD28 لوحات مضادة المغلفة مع ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني عقيم ثلاث مرات وإضافة ملليلترين من تعليق الخلية إلى كل بئر.

استخدام حركة دوامة لصرف الخلايا بالتساوي. كتحكم، لوحة نفس العدد من خلايا CD8 T في بئر واحد غير مغلفة من لوحة واحتضان الخلايا في 37 درجة مئوية في 10٪ ثاني أكسيد الكربون خزان حاضنة لمدة 48 ساعة. في اليوم الأول ، وإعداد شظايا الليفية البشرية لوحات المغلفة عن طريق إضافة 0.5 ملليلتر من الليفية إلى آبار لوحة 24 جيدا واحتضانه على مدى الليل في أربع درجات مئوية.

في اليوم التالي، وإزالة حل fibronectin وإضافة ملليلتر واحد من 2٪ BSA وBBS في بئر. احتضان لوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة وغسل الآبار المعالجة مع ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني عقيم. لوحة جاهزة للاستخدام بعد إزالة محلول الغسيل.

عد الخلايا T CD8 تنشيط باستخدام الأزرق Trypan. جمعها عن طريق الطرد المركزي. و إعادة تعليقها بخمسة ملايين خلية قابلة للحياة لكل ملليلتر من أجل النقل

إضافة 100 ميكرولترات من تعليق الخلايا CD8 المنشط إلى كل بئر من لوحة مغلفة fibronectin. ثم إضافة 1.5 إلى مليلترين من الفيروس المعد سابقا تحتوي على المتوسطة ومزيج باستخدام حركة دوامة للاستغناء عن الخلايا بالتساوي. ختم لوحة في كيس زيبلوك والطرد المركزي في 2، 000 مرات ز لمدة 90 دقيقة في 37 درجة مئوية.

قم بإزالة اللوحة من جهاز الطرد المركزي واصطُلها إلى خزانة السلامة البيولوجية. إزالة بعناية كيس من البلاستيك والتأكد من أن خارج لوحة غير ملوثة مع المتوسطة. نقل لوحة إلى 37 درجة مئوية من ثاني أكسيد الكربون حاضنة.

بعد أربع ساعات، وإزالة ملليلتر واحد من المتوسطة من كل بئر، واستبدالها بميليلتر واحد من خلية تي كاملة مسبقة المدى المتوسطة ووضع لوحة مرة أخرى في الحاضنة. الجوانب الهامة لهذا البروتوكول هي فيروس تتر عالية، الخلايا التائية تنشيط صحية، وطريقة تحويل المناسبة. وكانت الخلايا الملطخة بالاشتراك مع PE حجم سبعة مترافق المضادة لـ CD8، AF647 مترافق المضادة لـ CD3، وBV 421 مترافق المضادة CD28 لتحليل التدفق السيتوميتري.

تقريباً، 70٪ من خلايا CD8 T شارك في التعبير عن GFP الذي يشير إلى تعبير CAR. كما أعربوا عن مؤتمري المؤتمر 28 و CD3. الأهم من ذلك, كل من اختبار GFP الخلايا الإيجابية أيضا تشارك في الملطخة مع I-Ag7 الأنسولين BR3 tetramers الذي يشير إلى التعبير عن CAR على سطح الخلية ولكن ليس مع رباعية التحكم.

وعلاوة على ذلك، فإن اختبار والسيطرة CAR T الخلايا كل يفرز مستويات عالية من الانفيرون غاما فقط بعد تربية الخلايا المستهدفة مع التعبير عن أربطة المشترك التي تؤكد أن الخلايا العابرة لديها CD8 تأثير T الظاهري الخلية الموجهة نحو الهدف من الأجسام المضادة الأم. إن تحويل خلايا إنتاج الفيروسات، وعزل الخلايا التائية CD8 الأساسية، وتفعيل هذه الخلايا التائية هي أهم خطوات هذه التجربة. وجود خلايا T تنشيط صحية وtransduction من هذه الخلايا التائية مع الكواشف المناسبة يضمن نتائج مواتية.

يمكن استخدام هذا الأسلوب إلى transduce الخلايا T الأخرى ولكن يجب تخصيص لنوع خلية T معينة. يمهد هذا البروتوكول الطريق للوقاية من مرض السكري من النوع 1 مع مستضد مستضدات التكيمية الخاصة بالعلاج بالخلايا T.