فحص Durotaxis خلية واحدة لتقييم السيطرة الميكانيكية للحركة الخلوية والأحداث الإشارات ذات الصلة

هناك تقدير متزايد لتأثير البيئة الدقيقة الميكانيكية على إشارات الخلايا والهجرة. مما يستلزم استخدام نهج تجريبية فريدة من نوعها لتقديم التحفيز الميكانيكي إلى الخلايا الفردية. هذه التقنية تسمح للتلاعب الديناميكي من البيئة الدقيقة الميكانيكية تحت خلية في الوقت الحقيقي.

السماح بمراقبة التغيرات المنظمة ميكانيكياً في سلوك ترحيل الخلايا، وأحداث الإشارات شبه الخلوية. إظهار الإجراء معي ستكون نيلا نعيم، طبيبة ما بعد الطبيب وجوناثان باترسون، فني من مختبرنا. تبدأ باستخدام Chorono-1 لتنشيط السطح الزجاجي لكل زلة الغطاء السفلي لمدة 20 ثانية، قبل أن الإفراط فورا 50 microliters من ربط سيلان حل العمل على كل زلة الغطاء.

السماح للمحلول لتجف لمدة 10 دقائق قبل شطف الغطاء زلات مرتين مع 95٪ الإيثانول ومرتين مع ايزبروبانول. ثم، السماح لزلات الغطاء لتجف الهواء لمدة 20 دقيقة تقريبا. لترسب الخرزة الفلورية الصغيرة، sonicate الأول من العمل الحل الخرزة الصغيرة لمدة ساعة واحدة.

قبل 15 دقيقة من نهاية سونيكيشن، ضع الغطاء المنشط ينزلق عموديا في حامل زلة غطاء السيراميك ونقل حامل إلى نظافة البلازما الجدول الأعلى لعلاج البلازما غرفة الهواء لمدة ثلاث دقائق. المقبل، مكان قطعة من فيلم البارافين في 60 ملليلتر أغطية طبق بيتري، ووضع غطاء زلات على الأفلام، والنقر بخفة كل زلة غلاف لضمان اتصال جيد بين الفيلم و coverlip. ثم، إضافة 150 ميكرولترات من حل حبة العمل إلى الجزء العلوي من كل غطاء، وعلى الفور الطامح حل الإيثانول من جانب الأغطية، وترك الخرز على غطاء.

لإلقاء الهيدروجيل مباشرة بعد إعدادها، إضافة 25 قطرات ميكرولتر من حل هيدروجيل إلى الجانب المنشط من كل غطاء أسفل، وعلى الفور الوجه أغلفة أعلى مطرز، حبة الجانب إلى أسفل، على قطرات. السماح للجل البلمرة لمدة 30 دقيقة قبل استخدام ملقط لإزالة بلطف الأغطية. ثم، شطف المواد الهلامية مع ثلاثة، خمس دقائق يغسل في الطازجة 50 miliMoler Hepes في الغسيل.

لتنشيط السطوح Hydrogels، احتضان المواد الهلامية في 50 miliMoler Hepes الطازجة، تستكمل مع 0.4 miliMolar Sulfo Sanpah، ويعرض على الفور المواد الهلامية لمصباح قوس الأشعة فوق البنفسجية في منطقة مغلقة لمدة 90 ثانية. في نهاية التنشيط، وغسل المواد الهلامية مع ثلاثة، خمس دقائق يغسل في hepes الطازجة، وعلاج هيدروجيل المنشط مع 20 ميكروغرام لكل ملليلتر من الليفي لمدة ساعة واحدة في 37 درجة مئوية. في نهاية الحضانة ، تعرق محلول الليفي الزائد ، وغسل المواد الهلامية ثلاث مرات في PBS لمدة خمس دقائق لكل غسل.

بعد الغسيل الأخير، ضع الهيدروجيل في حجم صغير من برنامج تلفزيوني وتعقيم المواد الهلامية لمدة 15 دقيقة تحت الضوء فوق البنفسجي في غطاء لثقافة الأنسجة. ثم، غسل المواد الهلامية مرة واحدة في برنامج تلفزيوني جديد. بالنسبة لطلاء الخلايا، بذور 2.1 مرة 10 من الخلايا الأربعة من الفائدة في ثلاثة ملليلتر من المتوسطة لكل هيدروجيل والسماح للخلايا للتمسك في 37 درجة مئوية لمدة أربع إلى 18 ساعة.

في حين أن الخلايا هي الإكويبت، واستخدام سحب ماصة صغيرة لسحب قطر ملليمتر واحد من قبل 100 ملليمتر طويلة البورسليكات الزجاج الصغير الماص، للحصول على مفتق أكثر من ملليمترين أن يقلل إلى ما يقرب من 50 ميكرومتر في القطر في المليمتر الأول، ويمتد إلى طويلة، موازية 10 ميكرومتر قطر أنبوب في المليمتر الأخير. بعد ذلك، تحميل ماصة في microforge وتشكيل ماصة أن يكون 15 ميكرومتر حادة تلميح التي يتم المرفقة في نهاية قسم 250 ميكرومتر، عازمة على ما يقرب من 35 درجة الملاك من بقية ماصة. يجب أن يكون القطر التقريبي عند الانحناء حوالي 30 ميكرومترًا لتقديم القوة إلى الطرف.

بعد ذلك، ضع هيدروجيل على خشبة المجهر المقلوب. تغطية المتوسطة مع النفط المعدني واختيار الهدف 10x. تعقيم الماصات الدقيقة المعدة مع 70٪ الكحول.

ثم، إدراج في حامل ماصة صغيرة مع هوك وأشار نحو الطبق، واستخدام المتلاعب بالطبع لخفض ماصة حتى هوك فقط تلامس سطح السائل. تركيز المجهر على الخلايا الملتزمة إلى الجزء العلوي من الجل، والحرص على أن الهدف هو في أي خطر من ضرب العينة أو المرحلة، وجلب التركيز فوق الجل للعثور على غيض من ماصة صغيرة. قم بتدوير الماصة حتى يتم تعامد الطرف على المستوى البؤري، بحيث يشير الطرف الحاد من الماصات الصغيرة إلى الأسفل، ثم يعيد التركيز على طرف الماصات عند الضرورة.

التركيز مرة أخرى إلى طبقة الخلية لقياس مدى ما هو الماص من سطح هلام، والتركيز مرة أخرى تصل إلى الطائرة التي هي جزء في الاتجاه بين هلام وتلميح من ماصة. ثم، ببطء خفض ماصة للوصول إلى المستوى البؤري وسيطة، وزيادة التكبير إلى تلك التي سيتم استخدامها في التجربة، قبل خفض ماصة حتى تحوم فوق سطح هيدروجيل. لمعايرة المتلاعبة الدقيقة، صورة منطقة خالية من الخلايا، منطقة مع الخرز، ولكن لا التلاعب، مع ماصة إشراك هلام، ومع ماصة تشارك سحب هلام.

ثم، استخدم الصورة J لمقارنة حقول الخرزة إلى حقول الخرز دون مشاركة، وحقول الخرز مع الجل المشاركة، وجل سحبت لحساب التشريد حبة النسبية والقوة المطبقة على المواد الهلامية. لإجراء فحص دوروتاكسي، مراقبة مجموعة من الخلايا لمدة 30 دقيقة لتحديد الخلايا التي تتحرك بطريقة موجهة. حدد خلية تتحرك بثبات في اتجاه واحد، ثم قم بمراقبة خلايا معدل الإطار المطلوب لمدة 30 دقيقة إضافية.

بعد ذلك، ضع الماصات حوالي 50 ميكرومتر أمام الجانب القريب من الحافة الأمامية للخلية المختارة، وتحريك المتلاعب الصغير بحيث يتم تشويه الجل بشكل متعمّد إلى اتجاه الخلية من السفر. ثم، مراقبة الخلية مع مرور الوقت لأنها تستجيب للان تدرج حاد، المحلية من صلابة هيدروجيل. باستخدام هذه التقنية كما هو موضح، الجرذ الجنينية الخلايا الليفية التحرك نحو زيادة صلابة في التدرجات المطبقة من قبل ماصة صغيرة الزجاج.

الخلايا الليفية الجنينية الفئران، والتعبير عن عابرة استشعار التوتر vinculin على 125 كيلوباسكال polyacrylamide المواد الهلامية تظهر أيضا تشكيل التصاقات البؤري في اتجاهات تمتد على مدى فترة 40 دقيقة. فورستر الرنين نقل الطاقة تحليل يكشف أن vinculin المترجمة إلى الالتصاقات البؤري يواجه تغييرا فوريا في التوتر, عندما قدمت مع التحفيز دوروتتيك الحاد. توسيع فائدة هذا الفحص إلى مراقبة الأحداث إشارات شبه الخلوية، استجابة لتحفيز durotactic.

إذا قمت بإجراء محاولات متعددة لتمتد خلية، أو إذا زلات microneedle أثناء الفحص، تبدأ من جديد مع خلية جديدة لتجنب نقل متعددة، متغير، المحفزات الميكانيكية. وإلى جانب فائدتها في تحليل دوروتاكسيس، يمكن الجمع بين هذه التقنية والنهج الجينية، مثل أجهزة الاستشعار البيولوجية، أو الحمض النووي الريبي، أو تحرير الجينات للمساعدة في تحديد الآليات الجزيئية المشاركة في التحويل الميكانيكي.