Name: توصيف الناقلات غشاء بواسطة تعبير مغاير في كولاي وإنتاج الحويصلات الغشائية (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-31T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 16 s
Description: تعلم توصيف الناقلات غشائية في E. coli باستخدام حويصلات غشائية معكوسة. تتيح هذه الطريقة قياس تقارب الركيزة ودراسة آليات النقل بسهولة أكبر من طرق إعادة التشكيل التقليدية.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

وجاء الدعم لهذا المشروع من كليه الدراسات العليا BGSU ، ومكتب BGSU من البرامج والبحوث التي ترعاها.

<ol><li>Haferkamp, I., Linka, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+expression+and+characterisation+of+membrane+transport+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biology+%28Stuttgart%29%22%5BJournal%5D)">Functional expression and characterisation of membrane transport proteins.</a> Plant Biology (Stuttgart). 14 (5), 675-690 (2012).</li>
<li>Sauer, N., Caspari, T., Klebl, F., Tanner, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+expression+of+the+Chlorella+hexose+transporter+in+Schizosaccharomyces+pombe%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Functional expression of the Chlorella hexose transporter in Schizosaccharomyces pombe.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (20), 7949-7952 (1990).</li>
<li>Sauer, N., Stolz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SUC1+and+SUC2%3A+two+sucrose+transporters+from+Arabidopsis+thaliana%3B+expression+and+characterization+in+baker%27s+yeast+and+identification+of+the+histidine-tagged+protein%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">SUC1 and SUC2: two sucrose transporters from Arabidopsis thaliana; expression and characterization in baker's yeast and identification of the histidine-tagged protein.</a> The Plant Journal. 6 (1), 67-77 (1994).</li>
<li>Weber, H., Borisjuk, L., Heim, U., Sauer, N., Wobus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+sugar+transporters+during+seed+development%3A+molecular+characterization+of+a+hexose+and+a+sucrose+carrier+in+fava+bean+seeds%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">A role for sugar transporters during seed development: molecular characterization of a hexose and a sucrose carrier in fava bean seeds.</a> Plant Cell. 9 (6), 895-908 (1997).</li>
<li>Huang, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GhDREB1+enhances+abiotic+stress+tolerance%2C+delays+GA-mediated+development+and+represses+cytokinin+signalling+in+transgenic+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant%2C+Cell+%26+Environment%22%5BJournal%5D)">GhDREB1 enhances abiotic stress tolerance, delays GA-mediated development and represses cytokinin signalling in transgenic Arabidopsis.</a> Plant, Cell & Environment. 32 (8), 1132-1145 (2009).</li>
<li>Bassham, D. C., Raikhel, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+cells+are+not+just+green+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Plant cells are not just green yeast.</a> Plant Physiology. 122 (4), 999-1001 (2000).</li>
<li>Garcia-Mata, R., Bebok, Z., Sorscher, E. J., Sztul, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+dynamics+of+aggresome+formation+by+a+cytosolic+GFP-chimera%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Characterization and dynamics of aggresome formation by a cytosolic GFP-chimera.</a> Journal of Cell Biology. 146 (6), 1239-1254 (1999).</li>
<li>Liu, J., Sitaram, A., Burd, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+copper-dependent+endocytosis+and+vacuolar+degradation+of+the+yeast+copper+transporter%2C+Ctr1p%2C+by+the+Rsp5+ubiquitin+ligase%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Regulation of copper-dependent endocytosis and vacuolar degradation of the yeast copper transporter, Ctr1p, by the Rsp5 ubiquitin ligase.</a> Traffic. 8 (10), 1375-1384 (2007).</li>
<li>Drew, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GFP-based+optimization+scheme+for+the+overexpression+and+purification+of+eukaryotic+membrane+proteins+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">GFP-based optimization scheme for the overexpression and purification of eukaryotic membrane proteins in Saccharomyces cerevisiae.</a> Nature Protocols. 3 (5), 784-798 (2008).</li>
<li>Schachtman, D. P., Schroeder, J. I., Lucas, W. J., Anderson, J. A., Gaber, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+an+inward-rectifying+potassium+channel+by+the+Arabidopsis+KAT1+cDNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Expression of an inward-rectifying potassium channel by the Arabidopsis KAT1 cDNA.</a> Science. 258 (5088), 1654-1658 (1992).</li>
<li>Boorer, K. J., Forde, B. G., Leigh, R. A., Miller, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+expression+of+a+plant+plasma+membrane+transporter+in+Xenopus+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Functional expression of a plant plasma membrane transporter in Xenopus oocytes.</a> FEBS Letters. 302 (2), 166-168 (1992).</li>
<li>Miller, A. J., Zhou, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenopus+oocytes+as+an+expression+system+for+plant+transporters%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Xenopus oocytes as an expression system for plant transporters.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1465 (1-2), 343-358 (2000).</li>
<li>Reinders, A., Sivitz, A. B., Starker, C. G., Gantt, J. S., Ward, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+analysis+of+LjSUT4%2C+a+vacuolar+sucrose+transporter+from+Lotus+japonicus%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Functional analysis of LjSUT4, a vacuolar sucrose transporter from Lotus japonicus.</a> Plant Molecular Biology. 68 (3), 289-299 (2008).</li>
<li>Kovermann, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Arabidopsis+vacuolar+malate+channel+is+a+member+of+the+ALMT+family%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">The Arabidopsis vacuolar malate channel is a member of the ALMT family.</a> The Plant Journal. 52 (6), 1169-1180 (2007).</li>
<li>Blattner, F. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+complete+genome+sequence+of+Escherichia+coli+K-12%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The complete genome sequence of Escherichia coli K-12.</a> Science. 277 (5331), 1453-1462 (1997).</li>
<li>Terpe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+bacterial+expression+systems+for+heterologous+protein+production%3A+from+molecular+and+biochemical+fundamentals+to+commercial+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Overview of bacterial expression systems for heterologous protein production: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 72 (2), 211-222 (2006).</li>
<li>Miroux, B., Walker, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Over-production+of+proteins+in+Escherichia+coli%3A+mutant+hosts+that+allow+synthesis+of+some+membrane+proteins+and+globular+proteins+at+high+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Over-production of proteins in Escherichia coli: mutant hosts that allow synthesis of some membrane proteins and globular proteins at high levels.</a> Journal of Molecular Biology. 260 (3), 289-298 (1996).</li>
<li>Wagner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Consequences+of+membrane+protein+overexpression+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Consequences of membrane protein overexpression in Escherichia coli.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 6 (9), 1527-1550 (2007).</li>
<li>Bernaudat, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterologous+expression+of+membrane+proteins%3A+choosing+the+appropriate+host%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Heterologous expression of membrane proteins: choosing the appropriate host.</a> PLoS One. 6 (12), e29191(2011).</li>
<li>Takabatake, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+cDNAs+encoding+mitochondrial+phosphate+transporters+in+soybean%2C+maize%2C+rice%2C+and+Arabidopis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of cDNAs encoding mitochondrial phosphate transporters in soybean, maize, rice, and Arabidopis.</a> Plant Molecular Biology. 40 (3), 479-486 (1999).</li>
<li>Picault, N., Palmieri, L., Pisano, I., Hodges, M., Palmieri, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+novel+transporter+for+dicarboxylates+and+tricarboxylates+in+plant+mitochondria.+Bacterial+expression%2C+reconstitution%2C+functional+characterization%2C+and+tissue+distribution%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Identification of a novel transporter for dicarboxylates and tricarboxylates in plant mitochondria. Bacterial expression, reconstitution, functional characterization, and tissue distribution.</a> Journal of Biological Chemistry. 277 (27), 24204-24211 (2002).</li>
<li>Snowden, C. J., Thomas, B., Baxter, C. J., Smith, J. A., Sweetlove, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tonoplast+Glu%2FAsp%2FGABA+exchanger+that+affects+tomato+fruit+amino+acid+composition%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">A tonoplast Glu/Asp/GABA exchanger that affects tomato fruit amino acid composition.</a> The Plant Journal. 81 (5), (2015).</li>
<li>Kashiwagi, K., Igarashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+assays+of+polyamine+transport+systems+in+Escherichia+coli+and+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Identification and assays of polyamine transport systems in Escherichia coli and Saccharomyces cerevisiae.</a> Methods in Molecular Biology. 720, 295-308 (2011).</li>
<li>Kashiwagi, K., Miyamoto, S., Suzuki, F., Kobayashi, H., Igarashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excretion+of+putrescine+by+the+putrescine-ornithine+antiporter+encoded+by+the+potE+gene+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Excretion of putrescine by the putrescine-ornithine antiporter encoded by the potE gene of Escherichia coli.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (10), 4529-4533 (1992).</li>
<li>Tsuchiya, T., Rosen, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+transport+driven+by+a+proton+gradient+and+inverted+membrane+vesicles+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Calcium transport driven by a proton gradient and inverted membrane vesicles of Escherichia coli.</a> Journal of Biological Chemistry. 251 (4), 962-967 (1976).</li>
<li>Baba, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+Escherichia+coli+K-12+in-frame%2C+single-gene+knockout+mutants%3A+the+Keio+collection%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Systems+Biology%22%5BJournal%5D)">Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection.</a> Molecular Systems Biology. 2, (2006).</li>
<li>Nichols, B. P., Shafiq, O., Meiners, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+analysis+of+Tn10+insertion+sites+in+a+collection+of+Escherichia+coli+strains+used+for+genetic+mapping+and+strain+construction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Sequence analysis of Tn10 insertion sites in a collection of Escherichia coli strains used for genetic mapping and strain construction.</a> Journal of Bacteriology. 180 (23), 6408-6411 (1998).</li>
<li>Sauer, B. P1vir phage transduction. , https://openwetware.org/wiki/Sauer:P1vir_phage_transduction (2011).</li>
<li>Invitrogen. pBAD-DEST49 Gateway Destination Vector. , https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/12283016 (2010).</li>
<li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGreen%2C+MR+%22Molecular+Cloning%3A+a+laboratory+Manual%22">Molecular Cloning: a laboratory Manual</a>. , 4th edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2012).</li>
<li>GlennMills. Thermo Electron French Press Operation Manual. , http://www.glenmills.com/wp-content/uploads/2011/06/GLEN-MILLS-INC.-FRENCH-PRESS-Operating-Manual-Feb-2007-Rev-11.pdf (2007).</li>
<li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+protein+using+biochinic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Measurement of protein using biochinic acid.</a> Analytical Biochemistry. 150, 76-85 (1985).</li>
<li>Wright, J. K., Overath, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+the+lactose%3A+H%2B+carrier+of+Escherichia+coli+and+characterization+of+galactoside+binding+and+transport%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Purification of the lactose: H+ carrier of Escherichia coli and characterization of galactoside binding and transport.</a> European Journal of Biochemistry. 138 (3), 497-508 (1984).</li>
<li>PRISM. GaphPad Software. , https://www.graphpad.com/data-analysis-resource-center/ (2019).</li>
<li>Kirchberger, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+biochemical+analysis+of+the+plastidic+ADP-glucose+transporter+%28ZmBT1%29+from+Zea+mays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Molecular and biochemical analysis of the plastidic ADP-glucose transporter (ZmBT1) from Zea mays.</a> Journal of Biological Chemistry. 282 (31), 22481-22491 (2007).</li>
<li>Deniaud, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+a+chloroplast+ATP%2FADP+transporter+in+E.+coli+membranes%3A+behind+the+Mistic+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Expression of a chloroplast ATP/ADP transporter in E. coli membranes: behind the Mistic strategy.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1808 (8), 2059-2066 (2011).</li>
<li>Sze, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H%2B-Translocating+ATPases%3A+Advances+Using+Membrane+Vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">H+-Translocating ATPases: Advances Using Membrane Vesicles.</a> Annual Review of Plant Physiology. 36, 175-208 (1985).</li>
<li>Bush, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proton-coupled+sugar+and+amino+acid+transporters+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Plant+Physiology+Plant+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Proton-coupled sugar and amino acid transporters in plants.</a> Annual Review of Plant Physiology Plant Molecular Biology. 44, 513-542 (1993).</li>
<li>Futai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orientation+of+membrane+vesicle+from+Escherichea+coli+prepared+by+different+procedures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Membrane+Biology%22%5BJournal%5D)">Orientation of membrane vesicle from Escherichea coli prepared by different procedures.</a> Journal of Membrane Biology. 115, 15-28 (1974).</li>
<li>Seckler, R., Wright, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sideness+of+native+membrane+vesicles+of+Escherichea+coli+and+orientation+of+the+reconstituted+lactose%3A+H%2B+carrier%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Sideness of native membrane vesicles of Escherichea coli and orientation of the reconstituted lactose: H+ carrier.</a> European Journal of Biochemistry. 142 (2), 269-279 (1984).</li>
<li>LaVallie, E. R., Lu, Z., Diblasio-Smith, E. A., Collins-Racie, L. A., McCoy, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thioredoxin+as+a+fusion+partner+for+production+of+soluble+recombinant+proteins+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Thioredoxin as a fusion partner for production of soluble recombinant proteins in Escherichia coli.</a> Methods in Enzymology. 326, 322-340 (2000).</li>
<li>Goodman, D. B., Church, G. M., Kosuri, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Causes+and+effects+of+N-terminal+codon+bias+in+bacterial+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Causes and effects of N-terminal codon bias in bacterial genes.</a> Science. 342 (6157), 475-479 (2013).</li>
<li>Wacker, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-linked+glycosylation+in+Campylobacter+jejuni+and+its+functional+transfer+into+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">N-linked glycosylation in Campylobacter jejuni and its functional transfer into E. coli.</a> Science. 298 (5599), 1790-1793 (2002).</li>
</ol>

وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.

في هذه الدراسة ، ونحن الخطوط العريضة طريقه لتوصيف انتيبورتر عن طريق التعبير أولا عن البروتين في كولاي ومن ثم توليد الحويصلات الغشائية ، بحيث يمكن ان يكون البروتين المعرب عنها بشكل غير متجانس في نظام خاليه من الخلايا. الاضافه إلى المعدات الموجودة في معظم مختبرات البيولوجيا الجزيئية ، تتطلب هذه الاستراتيجية استخدام الصحافة الفرنسية ، والوصول إلى المرافق لاجراء اختبارات النظائر المشعة.
ومن المتطلبات الاساسيه لهذا الأسلوب هو ان البروتين غير المتجانس يستهدف بشكل صحيح إلى غشاء البلازما من <...

البروتينات المتورطة في الاتجار بالأيض تشكل مستوي أساسيا من التنظيم الفسيولوجي ، ولكن الغالبية العظمي من ناقلات الغشاء النباتي لم تتميز بعد وظيفيا. وقد نفذت عده استراتيجيات لتوصيف بروتينات النقل الجديدة. وقد استخدمت التعابير غير المتجانسة في الكائنات الحية النموذجية مثل الخلايا القولونية والنواة الحقيقية مثل الخميرة والبويضات xenopus وخلايا الثدييات وخلايا الحشرات والخلايا النباتية لتحديد نشاط النقل1. ويفضل الخلايا ذات النواة الحقيقية للتعبير عن البروتينات النواة ، لان التركيب الخلوي الأساسي ، ومسارات تحويل الإشارات ، والنسخ والترجمة أليات متوافقة مع الظروف الاصليه.
كانت الخميرة كائنا نموذجيا هاما لتوصيف بروتينات النقل الجديدة في النباتات. أول البروتين النقل النباتي الذي تم التعبير عنه بنجاح في الخميرة (ساكاروميسز pombe) كان الناقل هيكسوز HUP1 من شلوريلا2. ومنذ ذلك الحين ، والعديد من البروتينات نقل النبات تتميز وظيفيا باستخدام نظام التعبير الخميرة. وتشمل هذه المعدات ناقلات السكر النباتية (SUC1 و SUC23و VfSUT1 و VfSTP14) وناقلات اوكاين (الAUX1 والدبوس5). مساوئ استخدام الخميرة للتعبير عن البروتينات النباتية يمكن ان تشمل ضعف النشاط من البروتينات المترجمة plastid لان الخميرة تفتقر إلى هذا organelle ، ثمة6، وتشكيل المجاميع المضللة وتفعيل الاستجابات الإجهاد في الخميرة بسبب الإفراط في التعبير عن البروتينات غشاء7،8،9.
التعبير المغاير للبروتينات النقل في البويضات Xenopus وقد استخدمت علي نطاق واسع لتوصيف إلكتروفيزيولوجي للناقلات10. وكانت أول البروتينات النقل النباتية التي تتميز باستخدام التعبير المغاير في البويضات Xenopus Arabidopsis قناه البوتاسيوم KAT110 وناقل Arabidopsis هيكز STP111. ومنذ ذلك الحين ، وقد استخدمت البويضات Xenopus لتوصيف العديد من البروتينات النقل النباتية مثل البلازما الناقلات غشاء12، فاكولار السكروز الناقل SUT413 و فاكولار مالات الناقل ALMT914. ومن القيود الهامه علي البويضات Xenopus لاختبارات النقل ان تركيز الأيض داخل الخلايا لا يمكن التلاعب1. وعلاوة علي ذلك ، مطلوب المعرفة المهنية لاعداد البويضات Xenopus وتنوع دفعات البويضة من الصعب السيطرة عليها.
التعبير المغاير في الكائن الحي النموذجي e. كولاي هو نظام مثالي من حيث توصيف البروتينات الجديدة لنقل النباتات. مع الجينوم متسلسلة تماما15، والخصائص الجزيئية والفسيولوجية لل e. القولونية معروفه جيدا. أسست أدوات جزيئيه وتقنيات جيدا16. الاضافه إلى ذلك ، مختلفه ناقلات التعبير ، سلالات غير المسببة للامراض والمسوخ متاحه17،18،19. وعلاوة علي ذلك ، e. كولاي لديها معدل نمو مرتفع ويمكن زراعتها بسهوله في ظل ظروف المختبر. يمكن التعبير عن العديد من البروتينات بسهوله وتنقيتها بكميات عاليه في e. كولاي9. عندما لا يمكن ان تكون البروتينات التهاوي مباشره في النظم الخلوية ، وأعاده تكوين البروتينات في الجسيمات الشحمية كان أيضا ناجحه ، وان كانت تحديا الابتكار لتوصيف البروتينات الغشاء المنقي. وقد تم إنجاز توصيف وظيفي للبروتينات النقل الميتوكوندريا النبات بما في ذلك الناقلات مذاب مثل ناقلات الفوسفات في فول الصويا والذرة والأرز والArabidopsis ، dicarboxylate-tricarboxylate الناقل في Arabidopsis باستخدام هذا النظام نموذج20،21. ومع ذلك ، تم العثور علي البروتينات المؤتلف من بروتين الطماطم SICAT9 لتكون غير وظيفية في تجارب أعاده التشكيل ، والأعضاء الآخرين من الاسره الناقل CAT وجدت لتكون غير وظيفية في اختبارات البويضات Xenopus 22. التالي ، هناك حاجه إلى أدوات جزيئيه اضافيه لتوصيف ناقلات الغشاء.
تم العثور علي خمسه أنظمه النقل بولياميني في e. كولاي23. وهي تشمل اثنين من الناقلين ABC التوسط في امتصاص سبيرمدين والوضع ، ومبادل النبات/اورنيثين ، ومبادل cadaverine/يسين ، ومصدر سبيرمدين والمستورد بوسكارين. وقد اتسمت في الأصل مبادل بوتريسين PotE باستخدام فحص حويصلة ، حيث تم اعداد الحويصلات الداخلية من قبل الخلايا الليسينجه مع الصحافة الفرنسية وقياس امتصاص بوتريمين الشعاعية في الحويصلات في مقابل اورنيثين24. واستخدمت اختبارات الحويصلة أيضا لتوصيف ناقل الكالسيوم ، الذي توسط في نقل الكالسيوم ردا علي التدرج البروتون25. وقد دفعتنا هذه التجارب إلى وضع استراتيجية لتوصيف مبادلات البوليامين الأخرى. انشانا لأول مره سلاله من e. القولونية ناقصه في pote والمبادلات cadb . هنا ، فاننا نظهر التوصيف الوظيفي لمصنع بوليامين انتيبورتر عن طريق التعبير غير المتجانس في سلاله e. القولونية المعدلة ، وتوليد الحويصلات الغشائية باستخدام الصحافة الفرنسية ، والمقايسات الشعاعية.

<table><tbody><tr><td>2-mercaptoethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>3H-putrescine</td><td>PerkinElmer</td><td>NET185001MC</td><td></td></tr><tr><td>3H-spermidine</td><td>PerkinElmer</td><td>NET522001MC</td><td></td></tr><tr><td>4-chloro-1-naphthol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8890</td><td></td></tr><tr><td>14C arginine</td><td>Moravek Inc.</td><td>MC137</td><td></td></tr><tr><td>Arginine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-5006</td><td></td></tr><tr><td>Anti-His (C-term)-HRP الجسم المضاد</td><td>ThermoFisher</td><td>R931-25</td><td>يكتشف علامة البولي هيستيدين C-terminal (6xHis) ، ويتطلب مجموعة carboxyl المجانية للكشف عن</td></tr><tr><td>أرابينوز</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3256</td><td></td></tr><tr><td>BCA مجموعة فحص البروتين</td><td>ThermoFisher</td><td>23227</td><td>Pierce BCA asay عده.</td></tr><tr><td>بروموفينول الأزرق</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0404</td><td></td></tr><tr><td>Carboxypeptidase B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9584-1mg</td><td></td></tr> جهاز <tr><td>طرد مركزي</td><td>Sorvall</td><td></td><td>SS-34 دوار بزاوية ثابتة و GA-6 دوار بزاوية</td></tr> ثابتة <tr><td>مطحنة أنسجة Dounce</td><td>LabGenome</td><td>7777-7</td><td>Corning 7777-7 الخالط بيركس مع صنبور الصب.</td></tr><tr><td>Ecoscint-H</td><td>National Diagnostics</td><td>LS275</td><td>كوكتيل التلألؤ</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>مشعب الترشيح</td><td>Hoefer</td><td>FH225V</td><td></td></tr><tr><td>خلية الضغط الفرنسية</td><td>Glen Mills</td><td>FA-080A120</td><td></td></tr><tr><td>GABA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2129</td><td></td></tr><tr><td>Glutamate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6904</td><td></td></tr> برنامج <tr><td></td> Glycerol <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism</td><td><a href = "http://www.graphpad.com/prism/Prism.htm" target = "_blank" >http://www.graphpad.com/prism/Prism.htm< / a></td> بيروكسيد الهيدروجين KROGER كلوريد البوتاسيوم JT Baker 3040-01 عداد التلألؤ السائل <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>بيكمان</td><td>LS-6500</td><td></td></tr><tr><td>Maleate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0375</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>مرشحات غشاء النيتروسليلوز</td><td>Merck Millipore</td><td>hawp02500</td><td>0.45 & micro ؛ </td></tr><tr><td>طقم تنظيف M PCR</td><td>Genscript</td><td></td><td>QuickClean II</td></tr><tr><td>فوسفات البوتاسيوم ثنائي القاعدة</td><td>ThermoFisher</td><td>P290-500</td><td></td></tr><tr><td>بوتريسين</td><td>فلوكا</td><td>32810</td><td></td></tr><tr><td>فوسفات البوتاسيوم أحادي القاعدة</td><td>JTBaker</td><td>4008</td><td></td></tr><tr><td>Spermidine</td><td>Sigma-aldrich</td><td>S2501</td><td></td></tr><tr><td>سلالات: E. coli & Delta ؛ potE740 (ديل) :: كان ، & دلتا ؛ cadB2231::Tn10</td><td>هذه المخطوطة</td><td>متاحة عند الطلب.</td><td>السلالة ناقصة في مبادلات البولي أمين PotE و CadB.</td></tr><tr><td>منتجات أبحاث</td> <td>Tris-base</td><td>T60040-1000</td><td></td></tr><tr><td>أجهزة الطرد المركزي الفائقة</td><td>Sorvall MTX 150</td><td>46960</td><td>Thermo Fisher S150-AT أنابيب الطرد المركزي الدوار ذات الزاوية</td></tr> الثابتة <tr><td></td><td>ThermoFisher</td><td>45237</td><td>أنابيب الطرد المركزي ل S150-AT</td></tr><tr><td>ناقلات الدوار: pBAD-DEST49</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td>Gateway Gateway التعبير المتجه ل E. القولوني</td></tr></tbody></table>

توصيف الناقلات غشاء بواسطة تعبير مغاير في كولاي وإنتاج الحويصلات الغشائية

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

وقد تم تطوير العديد من الطرق لتوصيف وظيفيا ناقلات غشاء الرواية. بوليامينيس في كل مكان في جميع الكائنات الحية ، ولكن لم يتم التعرف علي مبادلات بوليامين في النباتات. هنا ، ونحن الخطوط العريضة طريقه لتوصيف الحمالين بوليامين باستخدام الحويصلات الغشاء المتولدة من تحلل من الخلايا القولونية اساشيكوجيا التعبير عن انتيبورتر النبات. أولا ، ونحن عبرت بشكل غير متجانس AtBAT1 في سلاله e. القولونية ناقصه في بوليامين والناقلون الصرف ارجينين. وأنتجت الحويصلات باستخدام الصحافة الفرنسية ، وتنقيتها من قبل نبذ حلول واستخدامها في فحص غشاء الترشيح من الركائز المسمية لإظهار خصوصية الركيزة للناقل. وأظهرت هذه المقايسات ان AtBAT1 هو نقل بوساطة البروتون من ارجينين, حمض γ الامينيه (GABA), بوتريسين و spermidine. سلاله متحولة التي تم تطويرها لفحص AtBAT1 قد تكون مفيده للتحليل الوظيفي لأسر أخرى من المبادلات النباتية والحيوانية بوليامين. ونحن نفترض أيضا ان هذا النهج يمكن استخدامها لتوصيف العديد من أنواع أخرى من مضادات الحمالين ، طالما يمكن التعبير عن هذه البروتينات في غشاء الخلية البكتيرية. E. القولونية هو نظام جيد لتوصيف ناقلات الرواية ، لان هناك طرق متعددة التي يمكن استخدامها لطفرة الناقلات الاصليه.

وتلخص الخطوات الرئيسية في هذا البروتوكول في الشكل 1. لفتره وجيزة ، e. كولاي الخلايا الناقصة في جميع المبادلات بوليامين والتعبير عن AtBAT1 هي مثقف ، طرد ، وغسلها مع العازلة واخضع لتحلل الخلية باستخدام الصحافة الفرنسية. تحلل يميل إلى إنتاج الحويصلات التي هي في الغالب داخل الخارج وفخ العازلة خارج الخلايا. يتم أزاله الحطام الخلوي بواسطة طرد ، ويتم استخدام خطوه ثانيه لجمع غشاء طيني. يتم أعاده تعليق الغشاء بيليه في تريس-Maleate العازلة pH 5.2 وتخز...

نحن وصف طريقه لتوصيف ناقلات الغشاء التي يحركها البروتون في الاستعدادات غشاء الحويصلة التي تنتجها التعبير المغاير في كولاي تحلل من الخلايا باستخدام الصحافة الفرنسية.

Several methods have been developed to functionally characterize novel membrane transporters. Polyamines are ubiquitous in all organisms, but polyamine ...

واحدة من المزايا الرئيسية لهذه التقنية لتميز الناقلين غشاء هو أنه يمكنك تحديد التقارب النسبي للنقل لركائز محددة، فضلا عن الحصول على نظرة ثاقبة على آلية النقل. توصيف البروتينات الأغشية التي تستخدم تدرجات البروتين لدفع النقل الركيزة مناسبة بشكل خاص لهذا من الداخل إلى الخارج فحص الحضيض التي نثبتها هنا. في حين أن هذا الفحص يتطلب بعض المعدات المتخصصة مثل الصحافة الفرنسية والوصول إلى الطرد فائقة التركيز ، نعتقد أنه قد يكون أسهل من الناحية الفنية من المقايسات التي تتطلب ناقلات الأغشية لإعادة تشكيلها في liposomes الاصطناعية.والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تمكننا من تحديد النسب النسبية للركائز المختلفة والقيام باختبارات المنافسة لاختبار تأثير الركائز المتنافسة على قضبان النقل. في حالة الناقل BAT1 المستخدمة لتوضيح هذا الفحص، كنا أيضا قادرة على إظهار التنشيط الركيزة من الناقل من قبل أرجينين. لبدء هذا الإجراء، والثقافة أعدت E.coli الخلايا المتحولة التي تعبر عن البروتين المستهدف عن طريق تلقيح مستعمرة واحدة في خمسة ملليلتر من وسائل الإعلام بوليامين 3 مع المضادات الحيوية المناسبة وتنميتها بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.في اليوم التالي، نقل هذه الثقافة إلى 500 ملليلتر من وسائل البوليمين الطازجة 3 وسائل الإعلام التي تستكمل مع 0.0002٪ arabinose وتنمو حتى ثقافة الخلية تصل إلى OD600 بين 0.6 و 0.8. بعد ذلك، الطرد المركزي في 2000 مرة G وعلى أربع درجات مئوية لمدة 15 دقيقة لجمع بيليه الخلية. إعادة تعليق بيليه وغسلها ثلاث مرات مع العازلة واحدة عن طريق الطرد المركزي في 2000 مرات G وعلى أربع درجات مئوية لمدة 15 دقيقة في كل مرة.يجب أن يكون حجم النهائي من الخلايا في المخزن المؤقت واحد بعد الدوران الثالث 10 ملليلتر. حدد خلية ضغط فرنسية 35 ملليلتر وصب تعليق الخلية في جسم الخلية. قم بتشغيل الجهاز باستخدام المفتاح على RHS في الجزء الخلفي من الوحدة، وقم بتعيين مفتاح تحديد النسبة إلى مرتفع.تشغيل مفتاح المضخة. سيبدأ المكبس في الارتفاع من القاعدة لإزاحة الهواء في الغرفة. زيادة الضغط عن طريق تحويل صمام زيادة الضغط في اتجاه عقارب الساعة حتى يصل مقياس 640 PSI.وهذا سيخلق ضغطا داخليا قدره 000 10 من PSI. بمجرد أن تصل الخلية إلى ضغط الهدف، افتح تجميع صمام التدفق قليلاً عن طريق تحويلها عكس اتجاه عقارب الساعة. ضبط فتحة صمام للسماح لمعدل تدفق فقط حوالي 10 قطرات في الدقيقة الواحدة.عندما خط التوقف على الجسم المكبس تصل إلى أعلى الخلية تدفق التبديل قبالة مضخة. خفض لوحة أسفل عن طريق وضع التبديل محدد نسبة إلى أسفل، ومن ثم، تعيين مفتاح المضخة على. عندما يتم سحب لوحة أسفل تماما، والحد من ضغط النظام إلى الصفر عن طريق تحويل صمام زيادة الضغط تماما عكس عقارب الساعة.قم بإيقاف تشغيل مفتاح المضخة وإيقاف تشغيل الجهاز. جهاز طرد مركزي الصحافة الفرنسية eluant في 10،000 مرات G وعلى أربع درجات مئوية لمدة 15 دقيقة لإزالة الخلايا غير المنقطعة ومخلفات الخلية. تجاهل بيليه ونقل سوبرنانت إلى أنابيب فائقة التركيز.فائقة الrifuge المنابع في 150، 000 مرات G وعلى أربع درجات مئوية لمدة ساعة واحدة ل بيليه حويصلات الغشاء. غسل الغشاء الصدّيات مرة واحدة دون إعادة التعليق في العازلة الثانية. ثم، استخدام طاحونة الأنسجة Dounce لإعادة تعليق الغشاء في عازلة اثنين.إعداد 100 ميكرولتر aliquots من الاستعدادات الغشاء في 1.5 ملليلتر أنابيب الطرد المركزي وتخزينها في ناقص -80 مئوية. أولاً، غسل وإعادة تعليق الفحوى في 30 ملليمولار من تريس في 7.8 pH، الذي يحتوي على 0.1 ملليمتر من كلوريد الكوبالت الثاني. إضافة ميكرولتر واحد من carboxypeptidase A في كلوريد الصوديوم، تريس، والكوبالت الثاني كلوريد لكل عينة ميكرولتر 100.احتضان في 20 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. إضافة خمسة ميكرولترات من محلول يحتوي على EDTA الصوديوم و 2-Mercaptoethanol في PH 7.5 لوقف الهضم. احتضان الحل في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة لإبزيم تماما.بعد ذلك، أضف ما بين خمسة و10 ميكرولترات من محلول يحتوي على كبريتات ليثيوم دوديسيل، الجلسرين، بروموفينول الأزرق، وتريز عند 7.5 إلى 100 ميكرولترات من العينة وتحليل العينات بواسطة الكهرباء. لأداء النشاف الأمينية، وضع مرشح nitrocellulose مبللة مع 25 ملليمولار فوسفات الهيدروجين الصوديوم على هلام polyacrylamide. ضع هذه بين اثنين من مرشحات السليلوز مبللة، وأخيرا، بين اثنين من منصات البلاستيك مبللة تجوب.ضع هذا التجميع بين أقطاب غرفة تحتوي على 25 ملليمولار فوسفات هيدروجين الصوديوم في درجة حرارة تتراوح بين درجتين وأربع درجات مئوية. نقل البروتينات الكهربائية في 20 فولت وعلى اثنين إلى ثلاثة أمبير لمدة ثلاث ساعات. سد الغشاء نيتروسيلولوسي في سد العازلة بين عشية وضحاها في درجتين مئويتين.في اليوم التالي، احتضان nitrocellulose في 20 ملليلتر من واحد إلى 5، 000 تخفيف من المضادة له C-محطة HRP الأجسام المضادة وسد العازلة لمدة ساعتين وغسل مرتين مع 50 ملليلتر من العازلة لما مجموعه 60 دقيقة. لتصور لطخة الأمينية، تذوب ستة ملليغرام من 4-الكلورو-1-نابثول في 20 ملليلتر من الكحول المشوهة وإضافة 80 ملليلتر من 15 ملليمولار تريس و 50 ميكرولترات من بيروكسيد الهيدروجين 30٪. قم باستحمام ورقة التصفية في هذا الحل الركيزة لمدة 20 دقيقة.عندما يكون لون كاف قد وضعت، شطف الغشاء بالماء والسماح لها لتجف. للبدء، احتضان 100 ميكرولتر aliquot من حويصلات الغشاء في 12 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. إضافة العازلة 3 تحتوي على البوليامينات ذات علامة وراعية في تركيز نهائي من 50 ميكرومولار إلى غشاء vesicles في 1.5 ملليلتر microcentrifuge أنابيب لبدء النقل.إجراء عملية نقل في 12 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة. بعد ذلك، نقل خليط التفاعل إلى الترشيح متعددة وتصفية من خلال مرشح غشاء نيتروسيلولوز 0.45 ميكرومتر. إضافة ثلاثة ملليلترات من الجليد الباردة العازلة المقايسة التي تحتوي على تركيز أعلى عشرة أضعاف من البوليامين غير المُشرَّم، تليها ثلاثة ملليلترات من العازلة المقايسة دون البوليامينات للحد من الربط غير المحدد.نقل المرشحات المغسولة إلى 20 ملليلتر قنينات متألقة يمكن التخلص منها تحتوي على 10 ملليلترات من سائل التلألؤ، واستخدم عداد مُلألؤ سائل لتحديد النشاط الإشعاعي. حساب امتصاص البولي أمين صافي كما هو موضح في بروتوكول النص. تحديد كم للركيزة عن طريق قياس امتصاص الركيزة المشعة إلى فِيَضِي تعبر عن البروتين المستهدف وتحسب حركية مايكليس مينتن باستخدام أسلوب الانحدار غير الخطي.بالنسبة لتجارب المنافسة، أضف الركيزة التنافسية غير المسماة المصنوعة في المخزن المؤقت للمختبر إلى أنبوب الطرد المركزي الذي يحتوي على 100 ميكروليت من الفُيَسَس عند 12 درجة مئوية مع إضافة 50 ميكرومولار من البوليمين المشع في نفس الوقت. قياس النشاط الإشعاعي المحاصرين داخل الحوي كما هو موضح سابقا. تحديد الـ KM الأم للركائز التنافسية من خلال قياس امتصاص البوليامينات المشعة ووجود 100 من الركازة الدقيقة أو أعلى غير المسمى واستخدام أسلوب الانحدار غير الخطية لرسم المنحنى.في هذه الدراسة، يتميز مضاد الحمال بالتعبير عن البروتين لأول مرة في الإشريكية القولونية، ومن ثم توليد حويصلات الغشاء بحيث يمكن تحليل البروتين غير المعبّر عنه بشكل غير مباشر في نظام خالٍ من الخلايا. يتم استخدام لطخة غربية للتحقق من أن AtBAT1 يتم نقل إلى vesicle. التحقيق في لطخة مع المضادة له C-محطة الأجسام المضادة كشفت عن بروتين بناء الانصهار الذي هو ما يقرب من 72.3 كيلودالتون.أدى هضم الفُيصلات قبل SDS-PAGE إلى تضاؤل، ولكن ليس فقدانًا كاملًا لإشارة المسبار. في 12 درجة مئوية، امتصاص الحيوانات المنوية المشعة من قبل الفحوى هو أعلى في دقيقة واحدة وظلت خطية على مدى ثلاث دقائق. لذلك، يتم تحديد وقت الحضانة للمقايسة النقل في دقيقة واحدة.بعد دقيقة واحدة، لا يوجد امتصاص صافي للنظائر بواسطة الأغشية التي تم إعدادها وتخزينها في 8.0 من البروتونات حيث لا يوجد تدرج في الغشاء الحوائي. لإثبات تأثير تبديد تدرج البروتون الاصطناعي ، يتم احتضان غشاء vecuicles في 8.0 درجة هيدروليكية 8.0 العازلة لمدة 10 دقائق قبل إضافة الركيزة المسماة ، مما يؤدي إلى امتصاص الحد الأدنى من الركيزة ذات العلامات الإشعاعية. معا، وهذه النتائج تشير إلى أن امتصاص البروتون يحركها من الحيوانات المنوية ويرجع ذلك إلى بروتين BAT1.لتحديد خصوصية الركيزة للبروتين، يتم حساب قيم الـ كم بقياس امتصاص الركيزة ذات علامات الراديو بتركيزات مختلفة. تشير قيم كم لـ spermidine و putrescine وArginine إلى أن هذا البروتين هو بوليمين عالي التقارب ومبادل أرجينين. ويمكن أيضا تحديد تقارب الناقل لركيزة معينة بشكل غير مباشر باستخدام مقايسات المنافسة.تكشف هذه الأقوال أن GABA هو مثبط تنافسي من الحيوانات المنوية. وعلاوة على ذلك، فإن قياس امتصاص 50 من الميكرومولار من الحيوانات المنوية ذات الوميض المشع في وجود تركيزات مختلفة من الأحماض الأمينية المختلفة يكشف أن AtBAT1 قادر أيضًا على نقل الغلوتامات والألانين بتركيزات المليمولار. عند تنفيذ هذا الإجراء ، من الواضح أن دمج ناقل الغشاء في الغشاء البكتيري أمر بالغ الأهمية.التحقق من أن البروتين الفائدة هو متكامل في الغشاء يمكن القيام به باستخدام الأجسام المضادة الموجهة ضد العلامات C-المحطة الطرفية. 10- ويمكن أن يؤثر الاختلاف الوراثي في ناقلات البشر على نقل نواتج الأيض والعقاقير التي تشكل ركائز الناقل المعين. وهكذا، يمكن أن يؤثر الاختلاف الليني على امتصاص المخدرات وإفرازها على حد سواء.يمكن إجراء العديد من المتغيرات الالية بسرعة عن طريق الطفرات الموجهة جنبًا إلى جنب من جين الناقل في متجه التعبير. يمكن بعد ذلك اختبار الفحوصات الوظيفية لهذه المتغيرات في ظل ظروف خاضعة للرقابة الشديدة باستخدام مقايسات من الداخل إلى الخارج. وتشكل ناقلات الأغشية 8 إلى 10 من جميع البروتينات ولم تتميز معظمها تماما في أي من الكائنات الحية النموذجية.الناقلون التي يتم تحديدها إلى الأغشية العضية هي صعبة بشكل خاص لتوصيفها بالتعبير غير المتغاير في الخلايا الكاوية. إذا كان نوع التبادل أو الناقلين بوساطة البروتون يمكن أن تكون موضعية لهذا الغشاء الإشريكية القولونية، يمكن أن تكون هذه الناقلات وظيفياً مُصفة باستخدام هذا الفحص في المختبر. وتتأثر نوعية والغلة من العويصلات من معدل elution من شظايا الخلية من الصحافة الفرنسية.في القيام بمقايسات النقل من الفينات مع النظائر ، من المهم أن يكون الإعداد التجريبي الذي يسهل القيام النسخ المتماثلة التجريبية. هناك العديد من الطرق للقيام بذلك، ولكننا نعتقد أنه سيكون من المفيد لنا أن نريك كيف فعلنا ذلك.

characterization-membrane-transporters-heterologous-expression-e-coli

Research

JoVE Journal

Biochemistry

الكيمياء الحيوية

في هذا البروتوكول نظهر التعبير ، solubilization ، وتنقيتها من بروتين الغشاء أعرب recombinantly ، MexB ، ومجمع للذوبان البروتين المنظفات. MexB هو غشاء المقاومة للأدوية المتعددة من نقل البكتيريا الانتهازية الزائفة الزنجارية الممرض.

التعبير ، Solubilization منظفات ، وتنقية من الناقل الأغشية ، ومقاومة الأدوية المتعددة MexB البروتين

ويرد نهج مبسط لفحص للتعبير عن بروتينات الغشاء المؤتلف في القولونية استنادا إلى الانصهار البروتين الفلوري الأخضر.

الأخضر الفلورسنت القائم على البروتين التعبير فحص غشاء البروتينات في<em&gt; الإشريكية القولونية</em

&lt; p class = 'jove_content'&gt;β برميل بروتينات الغشاء الخارجي (OMPs) تخدم العديد من الوظائف داخل الأغشية الخارجية للبكتيريا سالبة الجرام والميتوكوندريا والبلاستيدات الخضراء. هنا ، نأمل في التخفيف من عنق الزجاجة المعروف في الدراسات الهيكلية من خلال تقديم بروتوكولات لإنتاج OMPs β برميل بكميات كافية لتحديد الهيكل عن طريق علم البلورات بالأشعة السينية أو التحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي النووي.

من التركيبات لبلورات - نحو تحديد هيكل β برميل الخارجي بروتينات الغشاء

&lt; p class = 'jove_content'&gt; يتم تقديم بروتوكول لإنتاج وتنقية واستخدام حويصلات الغشاء الخارجي المعبأة بالإنزيم (OMV) مما يوفر ثباتا معززا للإنزيم للتنفيذ عبر تطبيقات متنوعة.

توجه التغليف البروتين داخل الخارجي غشاء الحويصلات من<em&gt; كولاي</em&gt;: تصميم وإنتاج وتنقية

ويصف هذا البروتوكول التقنيات المستخدمة لتحديد هياكل قناة أيون بالميكروسكوب cryo-الإلكتروني، بما في ذلك نظام باكولوفيروس لكفاءة التعبير عن الجينات في خلايا الثدييات مع الحد الأدنى من الجهد وسمية واستخراج البروتين وتنقية، والتحقق من الجودة، وإعداد شبكة العينة والفحص، فضلا عن جمع البيانات وتجهيزها.

التعبير وتنقية TRPC3 الإنسان حساسة للدهن قناة الأيونات الموجبة للتصميم الهيكلي بالفحص المجهري واحد-الجسيمات Cryo-إلكترون

تقدم هنا بروتوكولات لإنشاء الحويصلات أحادية اللاميلار الصغيرة القائمة على الببتيد قادرة على النمو. لتسهيل في إنتاج vesiculo من الببتيد الغشاء، وقد تم تجهيز هذه الحويصلات مع نظام ترجمة النسخ وبلازميد الببتيد ترميز.

في فيسيكولو التوليف من السلائف غشاء الببتيد لنمو الحويصلة المستقلة

يتيح الإدخال الانتقالي المشترك في الأقراص النانوية المشكلة مسبقا دراسة بروتينات الغشاء المركبة الخالية من الخلايا في بيئات دهنية محددة دون ملامسة المنظفات. يصف هذا البروتوكول إعداد مكونات النظام الأساسية والمعلمات الحرجة لتحسين كفاءة التعبير وجودة العينة.

الإدخال الانتقالي المشترك لبروتينات الغشاء في الأقراص النانوية سابقة التشكيل

يصف هذا البروتوكول طريقة فعالة خالية من الخلايا لإنتاج بروتيوليبوزوم عالي الجودة عن طريق طريقة غسيل الكلى ثنائية الطبقة باستخدام نظام خال من خلايا القمح والليبوزومات. توفر هذه الطريقة وسيلة مناسبة للتحليل الوظيفي للبروتينات الغشائية ، وفحص أهداف الأدوية ، وتطوير الأجسام المضادة.

إنتاج البروتينات الخالية من الخلايا للتحليل الوظيفي وتطوير الأجسام المضادة التي تستهدف البروتينات الغشائية

تقدم هذه المقالة بروتوكول عزل غشاء البلازما على نطاق صغير لتوصيف المبيضات albicans ABC (ATP ملزمة كاسيت) البروتين Cdr1، مفرط التعبير في Saccharomyces cerevisiae. تم تصميم علامة مزدوجة من طراز protease-cleavable C-terminal mGFPHis مع وصلة من 16 بقايا بين Cdr1 والعلامة لتسهيل تنقية وفحص المنظفات من Cdr1.

إعداد غشاء البلازما على نطاق صغير لتحليل المبيضات albicans Cdr1-mGFPHis

يصف هذا البروتوكول طريقة مفصلة لإنتاج البكتيريا للبروتينات المؤتلفة ، بما في ذلك البروتينات المحتوية على روابط غير قابلة للذوبان أو ثاني كبريتيد ، معبأة داخل حويصلات محاطة بغشاء خارج الخلية. ويمكن تطبيق ذلك على مجالات متنوعة من البحث العلمي، بما في ذلك التكنولوجيا الأحيائية التطبيقية والطب.

تحسين إنتاج وتحليل الحويصلات المملوءة بالبروتين المؤتلف من الإشريكية القولونية

يصف هذا البروتوكول طريقة المستحلب المقلوب المستخدمة لتغليف نظام التعبير الخالي من الخلايا (CFE) داخل حويصلة عملاقة أحادية الصفيحة (GUV) للتحقيق في تخليق ودمج بروتين غشاء نموذجي في طبقة الدهون المزدوجة.

إعادة تكوين قناة مستقبلات الغلوتامات البكتيرية عن طريق تغليف نظام التعبير الخالي من الخلايا

تعلم توصيف الناقلات غشائية في E. coli باستخدام حويصلات غشائية معكوسة. تتيح هذه الطريقة قياس تقارب الركيزة ودراسة آليات النقل بسهولة أكبر من طرق إعادة التشكيل التقليدية.

توصيف الناقلات غشاء بواسطة تعبير مغاير في كولاي وإنتاج الحويصلات الغشائية

استكشف المزيد من الفيديوهات