عزل مجموعات الضامة والخلايا اللحمية من الإنسان والماوس عينات عضله القلب
December 17th, 2019
يقدم هنا بروتوكول لعزل مختلف المجموعات الفرعية من الضامة وغيرها من الخلايا غير المناعية من عضله الدم البشرية والماوس من خلال اعداد تعليق خليه واحده من خلال الهضم الانزيمي. وتعرض أيضا مخططات الصب لتحديد وتوصيف الضامة المعزولة علي أساس التدفق الخلوي.
القلب يحتوي على سكان غير متجانسة من الخلايا المناعية التي تلعب أدوارا حاسمة في التهاب القلب، فضلا عن إصلاح. من أجل فهم عدم تجانس الخلايا المناعية واكتساب المزيد من التبصر في وظيفتها ، من المهم أن يكون لديك طريقة تسمح باسترداد هذه الخلايا من القلب. يمكن أن تساعد هذه التقنية في الكشف عن تنوع الخلايا المناعية وغير المُمَنية التي توجد في القلب الصحي أو المريض.
هناك ثلاث مزايا رئيسية لهذه التقنية. أولا ، انها سير عمل واحد بسيط يؤدي إلى توليد تعليق خلية واحدة من أنواع الخلايا المختلفة في غضون ثلاث ساعات من الوقت. ثانيا، أنه يؤدي إلى انتعاش عالية من السكان الخلايا المناعية وغير المناعة قابلة للحياة.
وثالثا، انها طريقة متعددة جدا ويمكن تطبيقها على أنسجة القلب في الأنواع الأخرى كذلك. من المهم الانتباه إلى كمية الأنسجة المستخدمة في رد فعل الهضم الواحد. استخدام مقص معقمة، تشريح عينة الأنسجة من جدار apical أو الجانبي من البطين الأيسر في المالحة الباردة أو HBSS.
تشريح بعناية من الدهون epicardial وتريال tendineae من العينة. مع مساعدة من شفرة معقم أو مقص، تشريح قطع الأنسجة إلى قطع تزن حوالي 200 ملليغرام. بعد القتل الرحيم الماوس، وفتح تجويف الصدر بمساعدة مقص حاد.
استخدام الهيموستات حادة لرفع القلب صعودا. اثقب القلب بـ PBS البارد باستخدام إبرة قياس 25 متصلة بحقنة خمسة ملليلتر. perfuse حتى يظهر القلب مبيض في اللون.
إزالة القلب ووضعها في طبق بيتري العقيمة على الجليد. ضع 200 ملليغرام من قطع الأنسجة القلبية البشرية أو قلب المورين في طبق بيتري معقمة. ناعما min الأنسجة باستخدام شفرة معقمة أو مقص.
لإعداد الهضم، في أنبوب مخروطي 15 ملليلتر، إعداد حجم الهضم النهائي من ثلاثة ملليلتر لكل قطعة الأنسجة القلبية البشرية أو قلب مورين واحد مع الإنزيمات collagenase الأول، DNase الأول، وهيالورونيداز بتركيزات من 450، 60، و 60 وحدة لكل ملليلتر. إضافة 2.5 ملليلتر من DMEM في الأنبوب. مع مساعدة من ملقط نظيفة، ووضع الأنسجة المفروم ناعما في كل أنبوب رد فعل.
تخلط جيدا من قبل دوامة لطيف. اجست لمدة ساعة واحدة في 37 درجة مئوية في حاضنة اهتزاز تعيين إلى سرعة التحريض منخفضة إلى متوسطة. بعد ساعة واحدة من الهضم، أخرج الأنابيب من الحاضنة ووضعها على الجليد.
قم بإعداد 50 ملليلتر أنابيب مخروطية مع مصفاة 40 ميكرون خلية على القمة. الرطب المرشحات مع مليلتر اثنين من الإنزيم تعطيل العازلة. المقبل، إلغاء تنشيط الانزيمات الهضم عن طريق إضافة ثمانية ملليلتر من الإنزيم تعطيل العازلة لكل أنبوب الهضم.
ثم صب الناتج 13 ملليلتر من مجموع خليط من خلال 40 ميكرون مصفاة الخلية في أنابيب مخروطية 50 ملليلتر. نقل العينات المصفاة مرة أخرى في أنابيب مخروطية 15 ملليلتر جديدة. تدور العينات في 400 مرات ز لمدة ست دقائق في أربع درجات مئوية.
تجاهل supernatant ترك 0.5 ملليلتر من وسائل الإعلام. Resuspend بيليه الخلية عن طريق pipetting لطيف وإضافة ملليلتر واحد من ACK تحلل العازلة. دوامة لطيف الأنبوب واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق لأداء خلايا الدم الحمراء.
بعد خمس دقائق في المخزن المؤقت ACK، إضافة تسعة ملليلتر DMEM إلى العينة. وضع الغطاء مرة أخرى على الأنابيب وعكس بلطف الأنابيب لخلط. تصفية من خلال مصفاة 40 ميكرون خلية وجمع الترشيح في أنابيب مخروطية 15 ملليلتر.
الطرد المركزي الأنابيب في 400 مرات ز لمدة ست دقائق والتخلص من الفائق. إضافة ملليلتر واحد من العازلة FACS وإعادة تعليق بيليه. ثم نقله إلى أنبوب microcentuge 1.5 ملليلتر.
مرة أخرى في جهاز طرد مركزي 400 مرة ز لمدة خمس دقائق. تجاهل الماوسين و resuspend بيليه في 100 ميكرولترات من العازلة FACS. تعليق خلية واحدة الآن على استعداد لتلوين الأجسام المضادة.
أضف لوحة الأجسام المضادة البشرية النموذجية إلى عينات القلب عند تخفيف واحد إلى 50. استخدام الأجسام المضادة المختلفة للخلايا الوماضة و الضامة القلب مورين. احتضان لمدة 30 إلى 40 دقيقة في أربع درجات مئوية في الظلام.
يضاف ملليلتر واحد من حاجز FACS ودوامة وبرفق والطرد المركزي بمعدل 400 مرة ز لمدة خمس دقائق. كرر هذه الخطوة الغسيل للمرة الثانية. ثم إعادة تعليق العينة في 350 ميكرولترات من المخزن المؤقت FACS وإضافة DAPI للوصول إلى تركيز نهائي من ميكرومولار واحد.
وقد أصبحت العينات جاهزة الآن لتحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية. في هذا البروتوكول، تم تحقيق عزل الضامة من الماوس و عضلة القلب البشرية. هذا الرقم يبين غير المجهزة والمعالجة الإنسان LVAD الأساسية.
وقدم مخطط الغسور لتدفق الفرز من CCR2 السلبية وCR2 الضامة البشرية الإيجابية من عضلة القلب البشرية وكذلك لD45 الخلايا القوية السلبية من اعتلال عضلة القلب الإقفي الإنسان. صور رايت الملون FACS فرز CD45 إيجابية وCD45 تظهر الخلايا السلبية سليمة غشاء الخلية مما يدل على صلاحية. كما نجح مخطط البوابات لفرز الضامة من قلب الماوس.
وزن الأنسجة المستخدمة للتفاعل الأنزيمي أمر بالغ الأهمية للهضم الفعال. لا تستخدم أكثر من 200 ملليغرام من الأنسجة لتركيزات انزيم المشار إليها في البروتوكول. بعد هذه الطريقة، يمكن أن تكون الخلايا مثقفا لتشيز في المختبر المقايسات.
يمكن فرز الخلايا لتسلسل RNA المجمع أو تسلسل الخلايا المفردة. وقد خدم هذا الأسلوب كتقنية لا تقدر بثمن في اكتشاف التغايرية الضامة التي لم يتم التعرف عليها من قبل التي هي موجودة في قلب الإنسان صحي أو المريض. باستخدام هذه الطريقة متبوعة بتسلسل الخلايا المفردة، تجري دراسات للكشف عن كيفية اختلاف مختلف الخلايا المناعية وغير المناعية بين القلب المريض مقابل القلب السليم.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
نظرة عامة
يحدد هذا البروتوكول طريقة لعزل مختلف مجموعات الخلايا الضامة والخلايا غير المناعية من عضلة القلب البشرية والفأرة. من خلال تحضير تعليق خلية واحدة من خلال الهضم الأنزيمي، يمكن للباحثين فهم أفضل لتغاير الخلايا المناعية في التهاب القلب وإصلاحه.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- بيولوجيا القلب والأوعية الدموية
- علم المناعة
الخلفية
- يحتوي القلب على مجموعة متنوعة من الخلايا المناعية.
- تلعب هذه الخلايا أدوارًا حاسمة في التهاب القلب وإصلاحه.
- فهم تغايرها ضروري لدراسة صحة القلب.
- تساعد هذه التقنية في استعادة الخلايا المناعية وغير المناعية من القلب.
غرض الدراسة
- لعزل وتوصيف الخلايا الضامة وأنواع الخلايا الأخرى من عضلة القلب.
- لكشف تغاير الخلايا المناعية وغير المناعية في قلوب صحية ومرضية.
- لتوفير طريقة موثوقة لدراسة الاستجابات المناعية القلبية.
الطرق المستخدمة
- الهضم الأنزيمي لتحضير تعليقات خلية واحدة.
- قياس التدفق الخلوي لتحديد وتوصيف الخلايا.
- عزل أنواع مختلفة من الخلايا من عضلة القلب البشرية والفأرة.
- سير عمل بسيط يتم الانتهاء منه في غضون ثلاث ساعات.
النتائج الرئيسية
- استعادة عالية للمجموعات الحية من الخلايا المناعية وغير المناعية.
- عزل فعال لمجموعات الخلايا الضامة.
- تبيين تغاير الخلايا المناعية في الأنسجة القلبية.
- تسهيل المزيد من البحث في آليات التهاب القلب وإصلاحه.
الاستنتاجات
- توفر هذه التقنية أداة قيّمة للبحوث القلبية.
- تعزز فهم أدوار الخلايا المناعية في صحة القلب.
- يمكن للدراسات المستقبلية الاستفادة من هذه الطريقة لاستكشاف الأمراض القلبية.
الأسئلة المتداولة
Executive Industry Relevance
Understanding macrophage heterogeneity in cardiac tissue is critical for de-risking target validation in cardiovascular drug discovery. This protocol enables reproducible isolation of immune and stromal subsets from human and mouse myocardium, supporting mechanistic studies that inform target confidence and portfolio prioritization. The method’s simplicity and cross-species applicability enhance translational continuity from discovery through preclinical validation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of macrophage subset functions in cardiac inflammation and repair pathways.
- Operational Value: Provides a standardized workflow for isolating viable immune and non-immune cells with minimal day-to-day variation.
- Strategic Value: Supports hypothesis-driven target validation by clarifying cellular contributors to disease phenotypes.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates purified cell populations suitable for functional assays and downstream omics applications.
- Operational Value: Delivers high recovery of viable cells within a three-hour workflow, enabling assay standardization.
- Strategic Value: Facilitates scalable preparation of disease-relevant systems for compound screening and target engagement studies.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Enables direct comparison of immune and stromal cell profiles between healthy and diseased human hearts.
- Operational Value: Compatible with bulk and single-cell RNA sequencing for biomarker discovery and mechanistic de-risking.
- Strategic Value: Supports risk-adjusted advancement decisions by linking cellular phenotypes to disease states across species.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation to preclinical research, enabling isolation of mechanistically relevant cell types for functional and genomic analysis.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by isolating defined macrophage and stromal subsets.
- Screening: Produces standardized, viable cell suspensions suitable for assay development and compound screening.
- Analytics: Generates quantitative inputs for flow cytometry, sequencing, and functional readouts that enable comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects discovery findings to preclinical continuity through cross-species applicability and disease-relevant specimen use.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for immune profiling across cardiovascular disease models and therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in immune-mediated cardiac pathology.
- Operational Value: Ensures reproducibility and scalability through a simple, time-efficient workflow.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early biological de-risking of cardiovascular targets.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization based on validated cellular mechanisms in human and mouse disease models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in enzymatic tissue dissociation, flow cytometry, and sterile cell handling.
- Dependent on access to collagenase I, DNase I, hyaluronidase, ACK lysis buffer, and FACS-compatible instrumentation.
- Necessitates standardized tissue dissection protocols (e.g., 200 mg apical/lateral left ventricle chunks) to ensure digestion efficiency.
- Requires adaptation of antibody panels for species-specific macrophage and stromal cell markers (e.g., CCR2 for humans, CD45 for mice).
- Limited by input tissue quality and quantity; suboptimal yields may occur with fibrotic or calcified specimens.
