معالجة الجنين، قشر البيض، والثقافة الفطرية لمسح المجهر الإلكتروني

لدينا بروتوكولات إعداد عينة موحدة لتصوير أجنت السلاحف المطلية، قشر البيض الجامدة والثقافات الفطرية باستخدام المجهر الإلكتروني المسح. تستخدم هذه الطرق الشاملة تعديلات دقيقة على بروتوكولات معروفة لمعالجة ثلاثة أنسجة حساسة تسمح بالتمايز بين الهياكل الأصلية وتجهيز القطع الأثرية. (إنّها ستُظهر الإجراء معي ستكون (جيسيكا غيبونز، طالبة دراسات عليا من مختبري

قبل جمع بيض السلاحف من موقع حقل خلال موسم التعشيش، قم بعمل أربعة إلى ستة ثقوب 0.25 سنتيمتر على طول جانبي الصناديق البلاستيكية وعلى أغطيةها للسماح بالتهيّم. قبل ملء الصناديق بمزيج رطب من الفرميكوليت والطحيات الخث الفراش في نسبة واحد إلى واحد. في موقع التعشيش ، قم بإزالة التربة بلطف للكشف عن البيض ومسح سطح كل بيضة سلحفاة مع صبغة اليود المخففة للحماية من التلوث الميكروبي أثناء الحضانة.

ضع ما يصل إلى 8 إلى 9 بيضات في الصندوق في نفس التوجه والمحاذاة كما تم وضعها ، مع الحفاظ على براثن فردية منفصلة عن بعضها البعض. عندما يتم جمع جميع البويضات ، قم بدفن البويضات يدويًا في الفراش ووضع الصناديق ذات الغطاء داخل حاضنة 30 درجة مئوية لمدة 10 إلى 17 يومًا للحصول على المراحل الجنينية 12 و13 و 18 جنينًا على التوالي. أضف الماء المقطر إلى رطوبة جزئية من أغطية الفراش كل يومين لتجنب الجفاف، وللحفاظ على مستوى الرطوبة من أجل تطوير الجنين الطبيعي.

في المرحلة المناسبة من التنمية، واستخدام مقص مدببة لجعل قطع على جانب واحد من قشر البيض الظهري وصفار غشاء معا، عموديا إلى محور طويل من البيض. بعد ذلك، قطع الجانب الآخر من البيضة على طول المحور القصير، واستخدام ملقط لقشر فتح قطعة مخرّضة مع جانب الجنين. قطع الجانب الجانبي الآخر من قشر البيض ووضع قطعة من قذيفة مخروق في برنامج تلفزيوني.

باستخدام مجسم مجسم وملقط، قشر الجنين وصفار الغشاء من قشر البيض. استخدم ملقط ومقص صغير لإزالة الأغشية الجنينية الزائدة، واستخدام ملعقة جنين لنقل الجنين إلى طبق بيتري من برنامج تلفزيوني جديد. بعد غسل أي دم وصفار، ضع ما يصل إلى ثلاثة أجنة في بئر من لوحة 12-جيدا، تحتوي على 4٪ شبهفورمالدهيد في أربع درجات مئوية لمدة يومين إلى ثلاثة أيام.

عندما تظهر العينات بيضاء، استخدم إدراج البوليسترين مع قيعان شبكة البوليستر لشطف الأجنة مع ثلاث غسلات لمدة خمس دقائق في PBS جديدة لكل غسل. بعد الغسيل الأخير، يجفف العينات في سلسلة الإيثانول الصاعدة لمدة ساعة واحدة لكل تركيز. بعد الغمر الإيثانول الثاني، جفف الأجنة في سلسلة من HMDS لتركيزات الإيثانول لمدة 20 دقيقة لكل غمر مع أطباق بيتري مغطاة جزئيا.

ثم ضع الأجنة في حل HMDS نهائي بنسبة 100٪، مغطى بالكامل أو جزئيًا في غطاء الدخان بين عشية وضحاها. التجفيف البطيء عن طريق زيادة تركيز HDMS على الإيثانول أمر مهم للكشف عن بنية سطحية ممتازة في الأجنة. في صباح اليوم التالي، استخدم مزدوج عصا الكربون موصل الشريط بعناية لتركيب العينات المجففة تماما على كعب دبوس الألومنيوم القياسية.

عندما تم تركيب جميع العينات ، أدخل العينات في غرفة المعطف المكسوة لثني العينات مع طبقة رقيقة جدًا من الذهب لمدة 60 إلى 120 ثانية في 35 ملليمب. ثم ربط بإحكام مسامير مجموعة لتركيب كعب على لوحات صب المقابلة. استخدم أداة تبادل العينة لنقل حامل العينة إلى غرفة العينة في المجهر الإلكتروني المسح الضوئي للتصوير.

لإعداد قشر البيض لفحص المجهر الإلكتروني ، ضع قشر البيض في الماء المقطر لمدة ساعة واحدة على الأقل بعد حصاد الجنين للقضاء على أي صفار أو تلوث الألبومين. بعد ذلك ، يجف الهواء قشر البيض النظيف على مناديل حساسة مضادة للثابت في غطاء الدخان بين عشية وضحاها. تخزين قشر البيض المجفف في زجاجات عينة نظيفة، وصفت من قبل عدد ومرحلة الجنين.

ثم، جبل، معطف sputter وصورة العينات قشر البيض كما أظهرت للتو للأجنة. لإنشاء الثقافات الفطرية الشريحة، واستخدام مشرط العقيمة لقطع نصف إلى ثلاثة أرباع كتل بوصة من البطاطا الصلبة dextrose أجار، ووضع كتل على الشرائح المجهر الزجاج الفردية. ضع المسواك العقيمة في الجزء السفلي من أطباق بيتري النظيفة لرفع الشرائح منها لخلق توتر سطحي بين الطبق والشريحة.

ضع كل شريحة على المسواك في طبق بيتري. بعد ذلك ، استخدم حلقة معقمة لنقل الفطريات من العينة إلى كل من الجوانب الجانبية الأربعة لـ agar. أضف بضع قطرات من الماء المقطر العقيم إلى طبق بيتري حول الشريحة لضمان الرطوبة للفطريات المتنامية.

ختم جزئيا لوحة مع فيلم البارافين ووضع لوحة في حاضنة درجة مئوية 30 لفترة الحضانة المناسبة للأنواع الفطرية. في نهاية الحضانة، وإزالة الشريحة من طبق بيتري واستخدام ملقط العقيمة لنقل كتلة أجار الالتزام بإحكام من الشريحة إلى حاوية من 3٪ glutaraldehyde لاحتضان بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية. في صباح اليوم التالي، يجفف العينات في سلسلة الإيثانول الصاعدة لمدة 15 دقيقة لكل تركيز.

بعد الغمر 90٪، معالجة العينات للجفاف النهائي مع اثنين من التغييرات 30 دقيقة في 100٪ الإيثانول لضمان تشبع كامل قبل وضع العينات المجففة في غرفة جهاز التجفيف نقطة الحرجة. ختم الغرفة وفتح الصمامات للسماح لثاني أكسيد الكربون السائل للتنفيس في والسماح للتنفيس الإيثانول حتى السائل ثاني أكسيد الكربون يملأ تماما الغرفة. بعد ذلك، ختم وتسخين الغرفة ببطء لتحقيق نقطة حرجة عندما يتجاوز ضغط الغرفة 1، 000 رطل من الضغط لكل بوصة مربعة، ودرجة الحرارة تتجاوز 31 درجة مئوية، ومساحة السائل والغاز من ثاني أكسيد الكربون في التوازن.

ثم تصريف ببطء ثاني أكسيد الكربون من الغرفة والعينة كغاز، لتجنب أي آثار التوتر السطحي على العينة، وجبل، لوحة، وصورة العينات الفطرية كما هو موضح. يكشف منظر ميكروجراف إلكتروني ضوئي جانبي للمرحلة 12 مرسومة كيف يمتد بروز الفك العلوي إلى ما وراء الفك الفكي ويحد من الوسيللي حفرة أنف مميزة بشكل جيد. ويمكن أيضا ملاحظة خمسة أقواس البلعوم.

في مرحلة 15 الجنين، somites شكلت حديثا مرئية في منطقة الذيل الخلفي من الجنين، وبراعم forelimb نقطة أكثر cortallyally من البطين. ويمكن أيضا تصور نمو واضح المعالم لقمة كارابيس على طول منطقة الجناح الداخلي بأكملها للجنين. في المرحلة 18 ، وقد تشكلت قصيرة إسقاط خطم ضعيف مع منقار أقل مقلوبة قليلا مع خطاف المحطة الطرفية التي تناسبها في الشق المركزي من المنقار العلوي.

يظهر الفك العلوي مظهرًا مرقًا ، ويمكن رؤية سن بيضة صغيرة يتشكل على طرف الفك العلوي. التحليل Ultrastructural من قشر البيض Chrysemys picta وغشاء قذيفة عن طريق مسح المجهر الإلكترون، ويكشف عن طبقة قشر البيض كالكارينوس الخارجي، تعلق بقوة على غشاء قذيفة خيوطية الداخلية. ويتكون السطح الخارجي لقشرة البيض من وحدات مُعددنة مُميزة مصنوعة من عقيدات كروية كروية مجهّزة في مجموعات وبين وحدات القشرة المجاورة، مع تركيز منخفضات أو مسام دائرية صغيرة من مختلف الأحجام.

لا يمكن تعميم المنهجيات المشتركة لجميع العينات البيولوجية لتحقيق جودة صورة لائقة باستخدام SEM. التعديلات الفريدة كما هو موضح ضرورية لأنواع محددة من الأنسجة. ويمكن أيضا استخدام طريقة التجفيف الكيميائي والجوي للعينات العضوية الأخرى، ويمكن استخدام تقنية زراعة الشرائح التي لديها اقتران في جميع الثقافات الميكروبية الناعمة والقوية.