Name: العزلة السريعة للضامة الجذرية الدجورة (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-07T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 22 s
Description: اكتشف بروتوكول الفصل الميكانيكي لعزل الضامة من العقد الجذرية الظهرية بسرعة. تتيح هذه الطريقة الخالية من الإنزيمات تحليل النمط الظاهري بكفاءة عالية لدراسة آليات الألم العصبي وإصلاح الأعصاب.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

وقد تم دعم الدراسة من قبل: مؤسسة التثقيف والبحوث التخدير (XY)؛ قسم التخدير والرعاية المحيطة بالجراحة (XY) في جامعة كاليفورنيا في لوس أنسياف. و1R01NS100801-01 (GZ). وقد تم دعم هذه الدراسة جزئيا من قبل مختبر HDFCCC لتحليل الخلايا مرفق الموارد المشتركة من خلال منحة من المعاهد الوطنية للصحة (P30CA082103).

تمت الموافقة على جميع التجارب الحيوانية من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها في جامعة كاليفورنيا سان فرانسيسكو وأجريت وفقا لدليل المعاهد الوطنية للصحة لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية.
1. جمع DRG القطنية من الفئران التجريبية
<ol><li>قبل بدء التجربة، قم بإعداد حل العمل لوسط تدرج الكثافة (على سبيل المثال، Percoll) عن طريق خلط 9 وحدات تخزين من الوسط مع 1 وحدة تخزين من Ca++/Mg++-free HBSS. أبقيه على الثلج</li>
	<li>التخدير الماوس مع 2.5٪ Avertin. تأكد من أن الحيوان هو التخدير الكامل من قبل عدم الاستجابة لقرصة مخلب الخلفية. ملاحظة:تم استخدام كل من الفئران الذكور والإناث الذين تتراوح أعمارهم بين 6-8 أسابيع.</li>
	<li>Perfuse الماوس transcardially مع 10 مل من قبل المبردة 1X PBS.<ol>
<li>وضع الماوس في موقف supine مع أربعة الكفوف المضمون مع الشريط داخل غطاء محرك الدخان الكيميائية. رفع الجلد تحت القفص الصدري من قبل ملقط، وجعل شق صغير مع مقص الجراحية لفضح الكبد والحجاب الحاجز.</li>
		<li>الاستمرار في استخدام مقص لقطع الحجاب الحاجز والقفص الصدري، وفتح التجويف الجنبي لفضح القلب النابض.</li>
		<li>بسرعة قطع الزائدة الأذينية الحق مع مقص قزحية العين. بمجرد ملاحظة النزيف، أدخل إبرة 30 G في الطرف الخلفي من البطين الأيسر، وحقن ببطء 10 مل من PBS 1X المبردة مسبقا لperfuse الحيوان.</li>
	</ol>
</li>
	<li>إجراء استئصال الصفيحات الظهرية15 على الماوس وضعت في موقف عرضة. ملاحظة: إذا تم التخطيط لثقافة الخلية، رش الماوس مع الإيثانول 70٪ قبل شق واستخدام الأدوات الجراحية قبل تعقيمها للتشريح.<ol>
<li>استخدم مشرط بحجم 11 لإجراء شقوق جانبية طولية عميقة تبدأ من منطقة الصدر وصولاً إلى المنطقة العجزية. إزالة الجلد عن طريق مقص لفضح طبقة العضلات الظهرية.</li>
		<li>استخدم فريدمان بيرسون رونجور لتقشير الأنسجة الضامة والعضلات حتى يتم الكشف عن عمليات العمود الفقري اللوبوسكرال والعمليات العرضية الثنائية.</li>
		<li>استخدم مقص ربيع نويس لفتح العمود الفقري الظهري بعناية، ثم قم بالتبديل إلى فريدمان بيرسون رونغور لإزالة العظام الفقرية لفضح الحبل الشوكي مع الأعصاب الشوكية السليمة المرفقة.</li>
	</ol>
</li>
	<li>تشريح بعناية ipsilateral والمضادة القطنية DRG (L4 /L5 DRG في دراستنا) ووضعها في 1 مل من الجليد الباردة Ca++/ Mg++خالية 1X HBSS في المجانسة الأنسجة Dounce. الآن الأنسجة جاهزة للخطوة 2. ملاحظة: تقليم العصب الشوكي تعلق على DRG إذا كان ذلك ممكنا.</li>
</ol>2. عزل خلايا واحدة من الماوس القطني DRG
<ol><li>تجانس أنسجة DRG مع مدقة فضفاضة في الخالطون Dounce 20-25 مرات.</li>
	<li>ضع مصفاة خلية نايلون معقمة بـ 70 م في أنبوب مخروطي معقم بـ 50 مل. الرطب مصفاة الخلية مع 800 درجة مئوية من الجليد البارد 1X HBSS، ويتم جمع تدفق من خلال في أنبوب مخروطي.</li>
	<li>جمع تعليق الأنسجة المتجانسة من المجانسة باستخدام ماصة وتمر من خلال الرطب 70 ميكرومتر مصفاة خلية النايلون في أنبوب مخروطي 50 مل.</li>
	<li>شطف المجانسة مرتين مع 800 درجة مئوية من الجليد البارد 1X HBSS ثم decant في نفس أنبوب مخروطي 50 مل مع مصفاة الخلية لزيادة الغلة.</li>
	<li>أضف 1.5 مل من وسط تدرج الكثافة متساوي التوتر المثلج (المعد في الخطوة 1.1) إلى أنبوب معقمة من البوليستيرين FACS بـ 5 مل.</li>
	<li>نقل التجانس الخلية من أنبوب مخروطي 50 مل (في الخطوة 2.4) في أنبوب FACS، مزيج جيد مع وسط التدرج الكثافة عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا. أضف 500 ميكرولتر إضافية من HBSS 1x لإغلاق الجزء العلوي.</li>
	<li>بيليه الخلايا عن طريق الطرد المركزي في 800 × ز لمدة 20 دقيقة في 4 درجة مئوية.</li>
	<li>يستنشق بعناية supernatant التي تحتوي على الملين في المتوسط دون إزعاج بيليه الخلية في الجزء السفلي من أنبوب FACS.</li>
	<li>إعادة تعليق الخلايا في PBS أو FACS العازلة التي تحتوي على 5٪ مصل البقر الجنيني (FBS) لتحليل FACS. ملاحظة: من المتوقع أن يكون هناك ما لا يقل عن 50,000 إلى 100,000 خلية من L4/L5 DRG ماوس واحد.<ol>
<li>إعادة تعليق خلايا DRG المعزولة ميكانيكيًا (L4/L5) في 100 ميكرولتر من PBS التي تحتوي على مصل البقر الجنيني بنسبة 5% ثم الحضانة مع الأجسام المضادة CX3CR1-APC (1:2000) في الظلام عند 4 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.</li>
		<li>غسل الخلايا مع 5 مل من PBS مرة واحدة. الطرد المركزي الخلايا 360 × ز لمدة 8 دقائق في 4 درجة مئوية.</li>
		<li>يستنشق supernatant، ثم إعادة تعليق بيليه الخلية في 300 درجة مئوية من PBS لتحليل FCAS. إذا تم تخطيط فرز الخلايا، قم بإعادة تعليق الخلايا في المخزن المؤقت FACS بدلاً من ذلك.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Ji, R. R., Chamessian, A., Zhang, Y. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pain+regulation+by+non-neuronal+cells+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Pain regulation by non-neuronal cells and inflammation.</a> Science. 354 (6312), 572-577 (2016).</li>
<li>Inoue, K., Tsuda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+in+neuropathic+pain%3A+cellular+and+molecular+mechanisms+and+therapeutic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Microglia in neuropathic pain: cellular and molecular mechanisms and therapeutic potential.</a> Nature Reviews Neurosciences. 19 (3), 138-152 (2018).</li>
<li>Hu, P., McLachlan, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+functional+types+of+macrophage+in+dorsal+root+ganglia+and+spinal+nerves+proximal+to+sciatic+and+spinal+nerve+transections+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Distinct functional types of macrophage in dorsal root ganglia and spinal nerves proximal to sciatic and spinal nerve transections in the rat.</a> Experimental Neurology. 184 (2), 590-605 (2003).</li>
<li>Simeoli, R., Montague, K., Jones, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomal+cargo+including+microRNA+regulates+sensory+neuron+to+macrophage+communication+after+nerve+trauma%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">Exosomal cargo including microRNA regulates sensory neuron to macrophage communication after nerve trauma.</a> Nature Communication. 8 (1), 1778(2017).</li>
<li>Cobos, E. J., Nickerson, C. A., Gao, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanistic+differences+in+neuropathic+pain+modalities+revealed+by+correlating+behavior+with+global+expression+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Mechanistic differences in neuropathic pain modalities revealed by correlating behavior with global expression profiling.</a> Cell Reports. 22 (5), 1301-1312 (2018).</li>
<li>Zhang, H., Li, Y., de Carvalho-Barbosa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dorsal+Root+Ganglion+Infiltration+by+Macrophages+Contributes+to+Paclitaxel+Chemotherapy-Induced+Peripheral+Neuropathy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Pain%22%5BJournal%5D)">Dorsal Root Ganglion Infiltration by Macrophages Contributes to Paclitaxel Chemotherapy-Induced Peripheral Neuropathy.</a> The Journal of Pain. 17 (7), 775-786 (2016).</li>
<li>Liu, T., van Rooijen, N., Tracey, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depletion+of+macrophages+reduces+axonal+degeneration+and+hyperalgesia+following+nerve+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">Depletion of macrophages reduces axonal degeneration and hyperalgesia following nerve injury.</a> Pain. 86 (1-2), 25-32 (2000).</li>
<li>Peng, J., Gu, N., Zhou, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+and+monocytes+synergistically+promote+the+transition+from+acute+to+chronic+pain+after+nerve+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">Microglia and monocytes synergistically promote the transition from acute to chronic pain after nerve injury.</a> Nature Communication. 7, 12029(2016).</li>
<li>Barclay, J., Clark, A. K., Ganju, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+cysteine+protease+cathepsin+S+in+neuropathic+hyperalgesia%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">Role of the cysteine protease cathepsin S in neuropathic hyperalgesia.</a> Pain. 130 (3), 225-234 (2007).</li>
<li>Lim, H., Lee, H., Noh, K., Lee, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IKK%2FNF-kappaB-dependent+satellite+glia+activation+induces+spinal+cord+microglia+activation+and+neuropathic+pain+after+nerve+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">IKK/NF-kappaB-dependent satellite glia activation induces spinal cord microglia activation and neuropathic pain after nerve injury.</a> Pain. 158 (9), 1666-1677 (2017).</li>
<li>Rutkowski, M. D., Pahl, J. L., Sweitzer, S., van Rooijen, N., DeLeo, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limited+role+of+macrophages+in+generation+of+nerve+injury-induced+mechanical+allodynia%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology+and+Behavior%22%5BJournal%5D)">Limited role of macrophages in generation of nerve injury-induced mechanical allodynia.</a> Physiology and Behavior. (3-4), 225-235 (2000).</li>
<li>Kwon, M. J., Shin, H. Y., Cui, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CCL2+Mediates+Neuron-Macrophage+Interactions+to+Drive+Proregenerative+Macrophage+Activation+Following+Preconditioning+Injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">CCL2 Mediates Neuron-Macrophage Interactions to Drive Proregenerative Macrophage Activation Following Preconditioning Injury.</a> Journal of Neuroscience. 35 (48), 15934-15947 (2015).</li>
<li>Zigmond, R. E., Echevarria, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+biology+in+the+peripheral+nervous+system+after+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Macrophage biology in the peripheral nervous system after injury.</a> Progress in Neurobiology. 173, 102-121 (2019).</li>
<li>Ghasemlou, N., Chiu, I. M., Julien, J. P., Woolf, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD11b%2BLy6G-+myeloid+cells+mediate+mechanical+inflammatory+pain+hypersensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+USA%22%5BJournal%5D)">CD11b+Ly6G- myeloid cells mediate mechanical inflammatory pain hypersensitivity.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 112 (49), E6808-E6817 (2015).</li>
<li>Malin, S. A., Davis, B. M., Molliver, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+dissociated+sensory+neuron+cultures+and+considerations+for+their+use+in+studying+neuronal+function+and+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Production of dissociated sensory neuron cultures and considerations for their use in studying neuronal function and plasticity.</a> Nature Protocols. 2 (1), 152-160 (2007).</li>
<li>Lin, Y. T., Chen, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dorsal+Root+Ganglia+Isolation+and+Primary+Culture+to+Study+Neurotransmitter+Release%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiment%22%5BJournal%5D)">Dorsal Root Ganglia Isolation and Primary Culture to Study Neurotransmitter Release.</a> Journal of Visualized Experiment. (140), (2018).</li>
<li>Burnett, S. H., Kershen, E. J., Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+macrophage+ablation+in+transgenic+mice+expressing+a+Fas-based+suicide+gene%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">Conditional macrophage ablation in transgenic mice expressing a Fas-based suicide gene.</a> J Leukoc Biol. 75 (4), 612-623 (2004).</li>
<li>Lopes, D. M., Malek, N., Edye, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex+differences+in+peripheral+not+central+immune+responses+to+pain-inducing+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">Sex differences in peripheral not central immune responses to pain-inducing injury.</a> Science Reports. 7 (1), 16460(2017).</li>
<li>Kim, Y. S., Anderson, M., Park, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupled+Activation+of+Primary+Sensory+Neurons+Contributes+to+Chronic+Pain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Coupled Activation of Primary Sensory Neurons Contributes to Chronic Pain.</a> Neuron. 91 (5), 1085-1096 (2016).</li>
<li>Vicuna, L., Strochlic, D. E., Latremoliere, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+serine+protease+inhibitor+SerpinA3N+attenuates+neuropathic+pain+by+inhibiting+T+cell-derived+leukocyte+elastase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">The serine protease inhibitor SerpinA3N attenuates neuropathic pain by inhibiting T cell-derived leukocyte elastase.</a> Nature Medicine. 21 (5), 518-523 (2015).</li>
</ol>

يعلن المؤلفون عدم وجود مصالح مالية متنافسة تتعلق بهذه المخطوطة.

هنا نقدم طريقة جديدة لإثراء بفعالية الضامة المعزولة من الماوس DRG. النهج التقليدي لعزل الخلايا المناعية DRG يتطلب الهضم الأنزيمي15،18، والتي يتم استبدالها الآن مع التجانس الميكانيكية في بروتوكولنا للحد من تلف الخلايا غير المرغوب فيها وزيادة الغلة. ولذلك، فإن البروتوكول الجديد أقل استهلاكاً للوقت بكثير. والأهم من ذلك، قد يحفز هضم الإنزيم الضامة ويغيّر التوقيع الجزيئي. وعلى النقيض من ذلك، فإن نهجنا الميكانيكي يحد إلى حد كبير من الإجهاد الخلوي.
<p class="jove_co...

هناك الآن أدلة كبيرة على أن الخلايا المناعية تسهم في الألم العصبي بعد إصابة العصب المحيطي1،2. ومن المعروف أن الخلايا الأحادية الطرفية، بما في ذلك الضامة الناضجة، تستجيب لإصابة الأنسجة والعدوى الجهازية من خلال داء البلغم، وعرض المستضد، وإطلاق السيتوكين. بالتوازي مع تنشيط microglia الناجم عن إصابة الأعصاب في القرن الظهري الشوكي ، توسع الضامة في العقد ية الجذر الظهرية (DRG) بشكل كبير بعد إصابة الأعصاب3،4. وتجدر الإشارة إلى أن هناك مصالح متزايدة لتحديد ما إذا كانت الضامة تسهم في نمو الألم العصبي بعد إصابة الأعصاب المحيطية من خلال التفاعل مع الخلايا العصبية الحسية في DRG5،6،7، 8 , 9 , 10 سنوات , 11.وعلاوة على ذلك، والدراسات الحديثة تورط أيضا مساهمة الضامة DRG في إصلاح axonal بعد إصابة الأعصاب12،13. وتشير دراسة أخرى كذلك إلى أن التجمعات السكانية الفرعية في الضامة (أي CD11b+Ly6Chi وCD11b+Ly6Cمنخفضة/- الخلايا) قد تلعب دوراً مختلفاً في فرط الحساسية الميكانيكية14. ولذلك، فإن الفينول بسرعة استجابة الضامة DRG في سياق إصابة الأعصاب قد تساعدنا على تحديد عوامل المناعة العصبية التي تسهم في الألم العصبي.
تقليديا ، فإن بروتوكول عزل الضامة في DRG ينطوي على خطوات متعددة بما في ذلك الهضم الأنزيمي15،16. وغالبا ما تستغرق هذه التقنية وقتا طويلا ويمكن أن تكون مكلفة بالنسبة للتجارب الواسعة النطاق. على الرغم من أن الهضم الخفيف مع الكولاجين النوع الثاني (4 ملغ / مل) وديسباس النوع الثاني (4.7 ملغ / مل) لمدة 20 دقيقة أوصى سابقا15، فمن المتصور أن الخلايا بعد التعرض لهذا الإنزيم عرضة لتلف الخلايا أو موت الخلايا ، والتي قد تؤدي إلى انخفاض العائد. وبالإضافة إلى ذلك، فإن الفرق في نوعية الإنزيمات من دفعة إلى دفعة قد يؤثر بشكل أكبر على كفاءة هذه العملية. والأهم من ذلك، الضامة المعرضة لهضم الإنزيم قد تكون محفزة بشكل غير مرغوب فيه، وبالتالي يمكن أن تكون مختلفة جدا عن الوضع في الجسم الحي. وقد تؤدي التغييرات إلى تعقيد نتائج الدراسة الوظيفية.
هنا نقوم بوصف بروتوكول خال من الإنزيم لعزل الضامة DRG بسرعة في 4 درجة مئوية باستخدام التفكك الميكانيكي. يتم الاحتفاظ العينات على الجليد للحد من الإجهاد الخلوي. ونتيجة لذلك، يوفر نهجنا ميزة للحفاظ على اتساق العزلة، ويفترض أن الخلايا المعزولة هي أكثر صحة وأقل تحفيزا. كما نقدم الأدلة للتحقق من جودة الخلايا المعزولة مع تحليل فرز الخلايا المنشط ة الفلورية (FACS).

<table><tbody><tr><td>AP20187</td><td>Clontech</td><td>635058</td><td></td></tr><tr><td>&# 945;-mouse CX3CR1-APC الأجسام المضادة</td><td>Biolegend</td><td>149007</td><td></td></tr> مصفاة الخلية <tr><td>Avertin</td><td>Sigma</td><td>T48402</td><td></td></tr><tr><td>(70 مم نايلون)</td><td>Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>الطرد المركزي</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>Dounce مخالط الأنسجة</td><td>Wheaton</td><td>357538 ( 1 مل)</td><td></td></tr> <tr><td>أنابيب FACS (5 مل)</td> <td>فالكون</td><td>352052</td><td></td></tr><tr><td>فريدمان بيرسون رونجر</td><td>FST</td><td>16121-14</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (10x ، Ca ++ / Mg ++ - مجاني)</td> <td>Gibco</td><td>14185-052</td><td></td></tr><tr><td>Noyes Spring Scissor</td><td>FST</td><td>15012-12</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>Sigma</td><td>P4937-500ml</td><td></td></tr><tr><td>بروبيديوم يوديد</td><td>سيجما</td><td>P4864-10 مل</td><td></td></tr></tbody></table>

العزلة السريعة للضامة الجذرية الدجورة

Rapid Isolation of Dorsal Root Ganglion Macrophages

هناك اهتمامات متزايدة لدراسة التفاعلات الجزيئية والخلوية بين الخلايا المناعية والخلايا العصبية الحسية في العقد ية الجذر الظهري بعد إصابة العصب المحيطي. ومن المعروف أن الخلايا الأحادية الطرفية، بما في ذلك الضامة، تستجيب لإصابة الأنسجة من خلال داء الفيغوسية، وعرض مستضد، وإطلاق سراح السيتوكين. وقد تورطت الأدلة الناشئة مساهمة الضامة جذور الظهر في تطوير الألم العصبي وإصلاح axonal في سياق إصابة الأعصاب. الفينول بسرعة (أو "العزلالسريع من") استجابة الضامة الجذور الظهرية في سياق إصابة الأعصاب هو المطلوب لتحديد عوامل المناعة العصبية غير معروف. هنا نبين كيف أن مختبرنا يعزل الضامة بسرعة وفعالية من العقد الجذرية الظهرية باستخدام بروتوكول فك نأفة ميكانيكية خالية من الإنزيمات. يتم الاحتفاظ العينات على الجليد في جميع أنحاء للحد من الإجهاد الخلوي. هذا البروتوكول هو أقل بكثير من الوقت المستهلكة بالمقارنة مع البروتوكول الأنزيمي القياسية، وقد استخدمت بشكل روتيني لتحليلنا فرز الخلايا تنشيط الفلورة.

للتحقق من صحة الخلايا المعزولة، اخترنا أولا ً الفئران المعدلة وراثياً (MAFIA)17. هذا الخط يعبر عن البروتين FK506 المخدرات الانضج (FKBP)-فاس الانتحار الانصهار الجينات والبروتين الفلورسنت الأخضر (eGFP) تحت سيطرة المروج لمستقبلات CSF1 (CSF1R)، والتي يتم التعبير عنها على وجه التحديد في كل من الضامة وmicroglia. حقن الجهازية من ديمرزر البروتين ربط FK, AP20187 (AP), يحفز المبرمج من الخلايا التي تعبر عن transgene. التعبير عن EGFP يسمح لنا أيضا لمراقبة الضامة في DRG. لاستنفاد الضامة في الفئران المافيا، بدأ...

هنا نقدم بروتوكول التفكك الميكانيكية لعزل الضامة بسرعة من العقدة الجذر الظهري للنماذج الظاهرية والتحليل الوظيفي.

There are growing interests to study the molecular and cellular interactions among immune cells and sensory neurons in the dorsal root ganglia after ...

وقد تورطت الأدلة الناشئة مساهمة الضامة جذر الظهرية الضامة في تطوير الألم العصبي وإصلاح محور عصبي في سياق إصابة الأعصاب. مرغوب في ظاهري بسرعة استجابة الضامة جذر الظهرية لتحديد العوامل العصبية غير معروف. هنا نُظهر كيف أن مختبرنا يعزل الضامة بسرعة وفعالية من جذر الظهرية ganglia باستخدام بروتوكول انفصال ميكانيكي خال من الإنزيم.هذا البروتوكول هو أقل استهلاكا للوقت مقارنة مع بروتوكولات الأنزيمية القياسية، ولقد استخدمنا بشكل روتيني لدينا تحليل الخلايا تنشيط الفلوريس. قبل البدء في التجربة، إعداد حل العمل للتدرج المتوسط الكثافة من خلال خلط تسعة مجلدات من المتوسطة مع حجم واحد من الكالسيوم والمغنيسيوم خالية HBSS والحفاظ على الجليد. تأكد من أن الماوس هو تخدير كامل من عدم وجود استجابة لقرصة مخلب الخلفي.تبدأ عن طريق وضع الماوس تخدير داخل غطاء محرك الدخان الكيميائية في موقف supine مع أربعة الكفوف المضمونة مع الشريط. استخدام ملقط لرفع الجلد تحت القفص الصدري. وبعد ذلك مع مقص الجراحية، وجعل شق صغير لفضح الكبد والحجاب الحاجز.باستخدام نفس المقص، وقطع الحجاب الحاجز والقفص الصدري. ثم افتح التجويف الجنبي لفضح القلب النابض. المقبل مع مقص القزحية، وقطع بسرعة الملحق الأذيني الأيمن.بمجرد ملاحظة النزيف ، أدخل إبرة 30 قياسًا في الطرف الخلفي للبطين الأيسر وحقن ببطء 10 ملليلترات من PBS 1X المبرد مسبقًا لبث الحيوان. لإجراء استئصال لامينك dorsal، ضع الماوس في وضعية التعرض. استخدام مشرط حجم 11 لجعل اثنين من الشقوق الجانبية العميقة الطولية بدءا من منطقة الصدر وصولا الى المنطقة sacral.ثم إزالة الجلد تعريض طبقة العضلات الظهرية. ثم مع فريدمان بيرسون rongeur، وتقشر قبالة الأنسجة الضامة والعضلات حتى يتعرض عمليات العمود الفقري lumbosacral والعمليات العرضية الثنائية. أولاً، استخدم رونغور فريدمان بيرسون لفتح العمود الفقري الظهري بعناية، ثم التبديل بين رونغيور فريدمان بيرسون ومقص الربيع ناي لإزالة العظام الفقرية، مما يعرض الحبل الشوكي بأعصاب العمود الفقري السليمة المرفقة.تشريح بعناية ipsilateral و contralateral ررج القطنية. وضعه في ملليلتر واحد من الكالسيوم البارد الجليد والمغنيسيوم خالية من 1X HBSS في التجانس الأنسجة دونسي. التجانس الأنسجة DRG في التجانس Dounce مع آفة فضفاضة لمدة 20 إلى 25 مرة.ضع مصفاة خلايا نايلون معقمة سعة 70 ميكرومتر في أنبوب مخروطي معقم بـ 50 ملليلتر. استخدام 800 ميكرولترات من الجليد رمز HBSS 1X لبرلل مصفاة الخلية. استخدام ماصة لجمع تعليق الأنسجة المجانسة من التجانس على مصفاة الخلية الرطبة، وجمعه في أنبوب مخروطي 50 ملليلتر.شطف المهووس مرتين مع 800 ميكرولترات من الجليد البارد HBSS 1X، وجمع السائل في نفس أنبوب مخروطي 50 ملليلتر لزيادة العائد. إضافة 1.5 ملليلتر من الجليد الباردة الكثافة متساوي المدى التدرج المتوسطة في أنبوب قارورة البوليسترين خمسة ملليلتر العقيمة. نقل تجانس الخلية من أنبوب مخروطي 50 ملليلتر في هذا الأنبوب قارورة.وماصة صعودا وهبوطا لخلط جيدا. إضافة 500 ميكرولترات إضافية من 1X HBSS لختم أعلى. الطرد المركزي الخلايا في 800 مرة G لمدة 20 دقيقة في أربع درجات مئوية.الطامح بعناية عظمى تحتوي على الميلين في الوسط دون إزعاج بيليه الخلية في الجزء السفلي من الأنبوب. إضافة 100 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني تحتوي على مصل الأبقار الجنينية 5٪ إلى بيليه، وإعادة تعليق الخلايا DRG. ثم إضافة ألفا ماوس CX3CR1 APC الأجسام المضادة للخلايا واحتضان في الظلام في أربع درجات مئوية لمدة ساعة واحدة.غسل الخلايا مرة واحدة مع خمسة ملليلتر من برنامج تلفزيوني. الطرد المركزي الخلايا في 360 مرة G لمدة ثماني دقائق في أربع درجات مئوية. التعرق المابير ، ومن ثم إعادة تعليق بيليه الخلية في 300 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني لتحليل الحقائق.بعد الحقن داخل الصفتون من FK ملزمة بروتين ملطف AP في الفئران MaFIA لنضوب الضامة، كان هناك خسارة كبيرة من الخلايا الإيجابية GFP في DRGs من الفئران AP المعالجة مقارنة الفئران المعالجة مركبة تسيطر عليها. وكشف تحليل الحقائق عن استنفاد ناجح للسكان المرتفعين في فئران المعالجة بـ AP وأظهر الجودة العالية للخلايا المعزولة. 4٪ من مجموع الخلايا المعزولة من DRG من الحيوانات المعالجة مركبة كانت الضامة GFP عالية.في المقابل فقط 0.4٪ من إجمالي خلايا DRG كانت الضامة GFP عالية في الماوس AP المعالجة. كانت خلايا DRG المعزولة ميكانيكيًا من الفئران من النوع البري ملطخة بالأجسام المضادة للماوس CX3CR1-APC. 6٪ من خلايا DRG كانت الضامة CX3CR1 إيجابية.عندما تم تقييم صلاحية الخلية مع يوديد بروبدييوم، كشفت أن أكثر من 80٪ من خلايا DRG المعزولة حديثا كانت قابلة للحياة. إذا لوحظت غلة الخلية غير المرضية، قد يشتبه في التجانس غير الكافي أو المفرط للأنسجة DRG. بالإضافة إلى ذلك، قد يتطلب تشريح DRG ممارسة متكررة للمبتدئين.من المحتمل أن يتم توسيع تطبيق بروتوكول لدينا لدراسة الخلايا الأخرى غير الخلايا العصبية مثل الخلايا الأقمار الصناعية والخلايا التائية. قد يكون من الضروري إجراء المزيد من الدراسات لتأكيد فعالية عزل الخلايا.

rapid-isolation-of-dorsal-root-ganglion-macrophages

Research

JoVE Journal

Neuroscience

علم الأعصاب

يوضح هذا الفيديو بروتوكولا خاليا من الإنزيم لعزل البلاعم من عقدة الجذر الظهري للفأر (DRG) باستخدام تقنية التفكك الميكانيكي. عند تجانس أنسجة DRG التي تم جمعها حديثا ، يتم استخدام الأجسام المضادة ضد مستقبلات سطح الخلية على البلاعم لتسمية الخلايا بالفلورسنت ، متبوعا بإجراء قياس التدفق الخلوي لتأكيد وجود البلاعم في العينة.

عزل البلاعم عن عقدة الجذر الظهري للفأر باستخدام التفكك الميكانيكي

&lt; p class = "jove_content" &gt;يوضح هذا الفيديو طريقة لحصاد الخلايا العصبية من العقد الجذرية الظهرية (DRG). يتم عزل DRG من العمود الفقري للفئران ، ومعالجته بالإنزيمات ، ثم فصله ميكانيكيا للحصول على تعليق أحادي الخلية. يتم فصل الخلايا العصبية عن الخلايا الدبقية باستخدام الطرد المركزي المتدرج للكثافة ويتم زراعتها في وسط النمو.

تقنية لحصاد وفصل العقد الجذرية الظهرية للثقافات العصبية

يوضح هذا الفيديو بروتوكولا لإثراء الثقافات العصبية من العقد الجذرية الظهرية عن طريق التحريك المناعي ، وبالتالي تحسين نقائها وفائدتها للأبحاث العصبية.

التخصيب العصبي للعقد الجذرية الظهرية عن طريق التحريك المناعي

يوضح هذا الفيديو تقنية لعزل واستزراع خلايا العقد الجذرية الظهرية (DRG) من العمود الفقري للفئران. يتم التعامل مع DRGs المستخرجة من العمود الفقري بالإنزيمات وفصلها ميكانيكيا للحصول على تعليق أحادي الخلية. يتم زراعة الخلايا في وسط يحتوي على مثبطات وعوامل نمو تحد من تكاثر الخلايا الدبقية وتعزز نمو الخلايا العصبية ، على التوالي.

إنشاء ثقافة خلايا العقد الجذرية الجذرية الأولية من العمود الفقري للفئران

العقد الجذرية الظهرية (DRG) والهياكل التي تحتوي على الخلايا العصبية الحسية في الجهاز العصبي المحيطي. عندما فصلها، فإنها يمكن أن تكون شارك في تربيتها مع الخلايا الجذعية الدهنية المشتقة مثل SC (ASC)، وتوفير نموذجا قيما للدراسة في المختبر تجديد الأعصاب وتكون الميالين، ومحاكاة البيئة في الجسم الحي في موقع الإصابة.

الظهرية جذر العقد الخلايا العصبية والخلايا الجذعية المتباينة الدهنية المشتقة: ل<em&gt; في المختبر</em&gt; المشارك الثقافة نموذج لدراسة الأعصاب الطرفية التجديد

يصف هذا البروتوكول عزل الخلايا العصبية العقدية الجذرية الظهرية (DRG) المعزولة من الفئران وثقافة الخلايا العصبية DRG على نظام زراعة الخلايا الممتدة مسبقا لتعزيز محاذاة المحاور العصبية ، مع الزراعة المشتركة اللاحقة لخلايا شوان (SCs) لتعزيز تكوين النخاع.

مدخل لتعزيز التوافق وتكون الميالين في ظهري الجذر العقدة العصبية

هنا ، نقدم بروتوكولا للبثق الهيدروليكي للحبل الشوكي بالإضافة إلى تحديد وعزل العقد الجذرية الظهرية المحددة (DRGs) في نفس القوارض. بالمقارنة مع طرق عزل الحبل الشوكي القياسية ، فإن هذه الطريقة أسرع بكثير وتقلل من خطر تلف الأنسجة.

البثق الهيدروليكي من الحبل الشوكي وعزل الظهرية جذر العقد في القوارض

قد أعيقت الجهود المبذولة لفهم الدالة ميكروجليال بالتفصيل بعدم وجود نماذج الثقافة ميكروجليال أن الخص خصائص ناضجة في فيفو microglia. ويصف هذا البروتوكول نهج العزلة والثقافة تهدف إلى المحافظة على بقاء قوية من microglia الفئران الناضجة متشعب جداً في ظل الظروف المحددة والمتوسطة.

العزلة وثقافة Microglia القوارض تعزيز دينامية تتفرع مورفولوجيا في المتوسط خالية من المصل

كثيرا ما تستخدم الجذر الظهرية ganglia (DRG) الثقافات الأولية لدراسة الوظائف الفسيولوجية أو الأحداث المتعلقة بعلم الأمراض في الخلايا العصبية الحسية. هنا، نحن شرح استخدام الثقافات DRG القطني للكشف عن الإفراج عن العصبية بعد مستقبلات neuropeptide فرنك فرنسي اكتب التحفيز 2 مع مؤثر انتقائية.

عزل العقد الجذرية الظهرية والثقافة الأولية لدراسة الإفراج عن ناقل عصبي

يوفر هذا البروتوكول تقنية لحصاد وزراعة العقدة الجذرية الظهرية المزروعة (DRG) من فئران Sprague Dawley البالغة في جهاز متعدد الأجزاء (MC).

حصاد وتضمين وزراعة العقد الجذرية الظهرية في أجهزة متعددة الأجزاء لدراسة السمات العصبية الطرفية

تحتوي العقد الجذرية الظهرية (DRG) على أجسام خلايا عصبية حسية أولية وتنقل إشارات حسية محيطية إلى الحبل الشوكي. يصف هذا البروتوكول طريقة لتشريح DRG للفأر تدعم العزل الموحد للعقد السليمة هيكليا، والتعرف التشريحي على المقطعات، والتوجيه الحدسي للمستخدمين المبتدئين، وتقليل إصابات الأنسجة الإجرائية.

تشريح وعزل عقد الجذر الظهرية للفأر

اكتشف بروتوكول الفصل الميكانيكي لعزل الضامة من العقد الجذرية الظهرية بسرعة. تتيح هذه الطريقة الخالية من الإنزيمات تحليل النمط الظاهري بكفاءة عالية لدراسة آليات الألم العصبي وإصلاح الأعصاب.

العزلة السريعة للضامة الجذرية الدجورة

استكشف المزيد من الفيديوهات