نظام فحص تكوين الأوعية ثلاثي الأبعاد باستخدام Spheroids الثقافة المشتركة التي شكلتها الخلايا المكونة للمستعمرة البطانية والخلايا الجذعية Mesenchymal

تم تصميم هذا النظام spheroid شارك 3D لتقليد الأوعية الوعائية. وسيكون فعالاً في تقييم التضمينات الجيوجينية المحتملة ويوفر معلومات يمكن التنبؤ بها قبل الدراسات الحية. هذا النظام يستخدم spheroids المشتركة في الثقافة التي شكلتها اثنين من الخلايا السلف الأوعية الدموية ويمكن استخدامها للتحقيق في التفاعلات الخلوية، تنبت، ونضج أنبوبي من تولد الأوعية الدموية.

إذا استطعنا استخدام خلايا المريض لتشكيل spheroids ثقافة المشاركة، يمكننا استخدام هذا النظام لتطوير العلاجات الشخصية للأمراض غير طبيعية ذات الصلة الأوعية الدموية، مثل السرطان. هذا النظام يمكن أن تزيد من حساسية وكفاءة الدراسات من الأوعية الدموية وتطوير المخدرات. ابدأ باستخدام 05٪ تبسين-EDTA لفصل ECFCs و MSCs من 80 إلى 90٪ التقاء البيانات الخلية لـ ثلاث أو خمس دقائق في حاضنة ثقافة الخلية على التوالي.

إلغاء تنشيط trypsin مع طازجة كاملة DMEM المتوسطة، والميصة الخلايا عدة مرات لتوليد تعليق خلية واحدة. جمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي، تليها اثنين من يغسل مع المتوسطة خالية من المصل. بعد الغسل الثاني، تمييع ECFCs إلى ثلاث مرات 10 إلى الخلايا الست لكل ملليلتر من التركيز المتوسط وMSCs إلى مرتين 10 إلى ست خلايا لكل ملليمتر من التركيز المتوسط في أنابيب الrifuge الفردية ميليلتر.

بيليه الخلايا عن طريق الطرد المركزي، وpirate بعناية جميع ما عدا آخر 15 إلى 25 ميكرولترات من السوبر من كل عينة الخلية. المقبل، resuspend كل بيليه في 250 ميكرولترات من مزيل C من مجموعة صبغ الفلورسنت، وماصات بلطف تعليق الخلية لضمان تشتت كامل. أضف 250 ميكرولترات من 20 ميكرومولار PKH67 أعدت حديثا إلى أنبوب ECFCs.

أضف 250 ميكرولترات من 12 ميكرومولار PKH26 إلى أنبوب MSCs. اخلط على الفور كلا التعليقات الخلوية. بعد خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة مع اهتزاز، محمية من الضوء، ووقف عملية تلطيخ مع حضانة دقيقة واحدة في 0.5 ملليلتر من FBS لكل أنبوب.

في نهاية الحضانة ، وجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي ، وإزالة بعناية supernatant ، تليها اثنين من يغسل في ملليلتر من المتوسط الكامل الطازجة في غسل. ثم قم بتعليق الخلايا في المتوسط على التوالي في أنابيب 15 ملليلتر. لتوليد الزفيرويد، بعد غسل الثانية، أولا تمييع تعليق الخلية في التركيز المناسب من الخلايا البطانية متوسطة MV2 مكملة مع 20٪ الميثيل حل السليولوز و 5٪ تركيز مصل البقر الجنين.

بعد ذلك، أضف كل تعليق خلية إلى خزان مستطيل بوليسترين معقمة. استخدام ماصة متعددة القنوات لإضافة ما يقرب من 125 ميكرولتر قطرات من الخلايا على غلاف لوحة ثقافة 150 ملليمتر. عندما يتم إضافة جميع الخلايا، عكس الغطاء على الجزء السفلي من طبق يحتوي على 15 ملليلتر من برنامج تلفزيوني، ووضع لوحات في حاضنة ثقافة الخلية لمدة 24 ساعة.

في اليوم التالي ، شطف أغطية الطبق بخمسة ملليلتر من PBS في أنبوب واحد 50 ملليلتر لكل طبق. شطف الأغطية مع خمسة ملليلتر إضافية من برنامج تلفزيوني لجمع أي spheroids المتبقية، و بيليه spheroids عن طريق الطرد المركزي. تجاهل بعناية كل ما عدا الماضي 100 إلى 200 ميكرولترات من عظمى، والاستفادة بلطف على جدار الأنبوب بحيث يتم تعليق تنف بحرية في كبرى المتبقية.

إضافة حجم مناسب من الخلايا البطانية نمو المتوسطة MV2 MV2 تستكمل مع 5٪ مصل الأبقار الجنينية و 40٪ ميثيل السليلوز حل لكل أنبوب لإعادة تعليق السفيرودات في 100 spheroids لكل ملليلتر من التركيز المتوسط. استخدام طرف ماصة ملليلتر واحد إلى قطرها ثلاثة إلى خمسة ملليمترات لخلط بلطف تعليق spheroid. استخدم ماص جديد عريض النصائح، ملليلتر واحد لخلط محلول التعليق الكروي مع هلام الكولاجين من النوع الأول المُحيّد بنسبة واحد إلى واحد على الجليد.

أضف 900 ميكرولترات من كل محلول هلام كولاجين معطّل من الرغوة في آبار طبق 24-well التي تم تسخينها مسبقًا. السماح للتعليق البلمرة لمدة 30 دقيقة في حاضنة ثقافة الخلية، قبل تغطية spheroids مع 100 microliters من الخلايا البطانية متوسطة النمو MV2 تكملها 2.5٪ FBS و 50 نانوغرام لكل ملليلتر من VEGF إلى spheroids ECFC فقط والمتوسطة تستكمل مع FBS فقط إلى MSC وECFC-plus-MSC spheroids. ثم ضع كل لوحة في مسجل خلية في الوقت الحقيقي مثبتة في حاضنة ثقافة الخلية ، والتركيز بشكل عشوائي على خمسة إلى 10 spheroids في التكبير 10x لمراقبة تشكيل تنبت من كل spheroid المسمى الفلوريسين كل ساعة لمدة 24 ساعة.

لتحديد كمية الزفيرة ، قم باستيراد ملفات الصور إلى ImageJ ، وقياس عدد وطول البراعم التي تعبر عن إشارة الفلورسنت المناسبة من خمس سفرويد مختارة عشوائيًا لكل مجموعة تجريبية. بالنسبة لـ spheroids ECFC-plus-MSC، يكون عدد البراعم وطول البراعم التراكمي أعلى بكثير مقارنة ببراعم البراعم الخاصة بـ ECFC فقط في جميع النقاط الزمنية. لا تتشكل براعم البراعم الخاصة بـ MSCs فقط ولكنها توضح ترحيل فردي لـ MSC خارج spheroids.

إن وضع علامات على ECFC مع صبغة فلورسنت خضراء و MSC مع صبغة الفلورسنت الحمراء قبل الجمع لتوليد spheroids ECFC-plus-MSC يوضح أن هياكل البراعم بوساطة ECFC مغطاة بـ MSCs ، مما يشير إلى أن MSCs مجتمعة تعمل كخلايا سفانية أثناء تكوين البراعم ، مما يعزز استقرار براعم ومتانة من خلال الارتباط الضيق بين خليتين من الخلايا الوعائية. تظهر دعامات ECFC-plus-MSC المعالجة مسبقًا بمثبطات تولد الأوعية الدموية عددًا قليلًا من البراعم وطول براعم تراكمي بطريقة تعتمد على الجرعة مقارنة بـ تتحكم في spheroids ECFC-plus-MSC. وفي التجارب الموازية، تظهر الدعامات التي تستخدمها ECFC فقط المعالجة المسبقة بالمثبطات متبوعة بالتحفيز مع VEGF انخفاض عدد البراعم الناجم عن عامل النمو وطول البراعم التراكمي بطريقة تعتمد على الجرعة.

وتجدر الإشارة إلى أن هناك حاجة إلى تركيز أعلى من مثبطات تولد الأوعية الدموية لمنع spheroids ECFC-plus-MSC مقارنة مع spheroids ECFC فقط. يتم تثبيط نمو الورم بشكل كبير في الحيوانات المعالجة مثبطات تولد الأوعية الدموية عالية الجرعة مقارنة مع كل من الحيوانات المعالجة بالتحكم والحيوانات المعالجة مثبطات تولد الأوعيةي منخفضة في نموذج فأر الورم xenograft الإنسان. وكان تركيز البلازما من bevacizumab في الفئران عالية المعالجة جرعة 568 زائد أو ناقص 40.62 ميكروغرام لكل ملليلتر، الذي كان أقرب إلى قيمة IC50 من bevacizumab لتثبيط طول براعم تراكمي في spheroids ECFC-plus-MSC بدلا من spheroids ECFC فقط.

وهذا يشير إلى أن نظام spheroid المشترك في الاستزراع ECFC-plus-MSC مناسب للتنبؤ بتركيزات البلازما الفعالة قبل إجراء دراسة حيوانية. استخدام طرف واسع، واحد مل ماصة لخلط بلطف الرغوة أثناء وجودهم في هلام الكولاجين على الجليد مهم لحماية سلامة الرغوة. يمكننا تعديل هذا النظام لإدخال أنواع الخلايا الأخرى مثل الخلايا المناعية وغيرها من المصفوفات خارج الخلية للتحقيق في التحدث عبر المصفوفة الخلية أثناء تولد الأوعية.