العلاج المناعي بالتبني من خلايا iNKT في الجلوكوز-6-الفوسفات Isomerase (G6PI) الناجمة عن الفئران RA

يصف البروتوكول أسلوبًا لإنشاء نموذج RA. معدل نجاحها هو أكثر من 93 في المئة والأمراض لها هو يعتمد على الخلايا التائية، والخلايا B، والمناعة الفطرية، والذي يسمح للباحثين لدراسة أفضل للأمراض من RA من منظور مناعي عالمي. ثم نستخدم خلايا INKT مع تأثيرات المناعة لعلاجها.

خلايا INKT لها تأثير جيد على العلاج من خلال في إدخال الجسم الحي التي توفر الدعم الأساسي للبيانات للتطبيق السريري للخلايا INKT وتنفجر حقا قيمة التطبيق السريري للخلايا INKT. أكبر ميزة من هذه التكنولوجيا هو أنه من السهل أن تعمل وسهلة لنسخ. وسوف يكون إثبات الإجراء تشن شنغدي، قاو شيانغ، وتشانغ جينغنان، طالب الدراسات العليا من مختبري.

للبدء، تزن 1.75 ملليغرام من كل من HGPI325 إلى 339 وGGPI469 إلى 483 شظايا وتذوب في 5.25 ملليلتر من 4 درجات مئوية ثلاثة مائية مقطرة. حل كامل فرويند 'sDjuvant في حمام الماء 50 درجة مئوية. ارسم 5.25 ملليلتر في أنبوب طرد مركزي آخر 10 ملليلتر وبرّده للاستخدام.

وضع خليط من حل HG6PI وكامل Freund في حل Adjuvant في وحدة استحلاب الاصطناعي مع اثنين من الحقن الزجاجية، متصلة. في حمام الثلج، ودفع حقنة في سرعة ثابتة وتواتر من عشر إلى عشرين مرة في الدقيقة الواحدة مستحلب تماما محلول ببتيد خليط واستكمال حل فرويند في Adjuvant. ثم، والحفاظ على قطرات مستحلب في الماء لمدة عشر دقائق.

المقبل، حقن 150 ميكرولترات من HG6PIs مستحلب في جذر ذيل الماوس تحت الجلد. على الفور وبعد 48 ساعة، حقن 200 ملليغرام من السم السعال الديكي في الماوس intraperineally. الآن، حقن العادية DBA1 الماوس intraperineally دون gausser في جرعة من 0.1 ملليغرام لكل كيلوغرام من وزن الجسم.

بعد ثلاثة أيام من النمذجة ، وبعد التخدير ، وعزل الطحال من الماوس. إعداد تعليق خلية واحدة عن طريق قطع وطحن الطحال في غربال شبكة 200. اغسل تعليق الخلية مع برنامج تلفزيوني.

أجهزة الطرد المركزي في 200 مرة ز لمدة خمس دقائق والتخلص من الفائق. إعادة تعليق الخلايا مع ملليلتر واحد من محلول أنسجة الدم كله. إضافة ثلاثة ملليلترات من الفوفوفية الفارمة المتوسطة.

ثم الطرد المركزي الخلايا لمدة 20 دقيقة في 300 مرة ز في درجة حرارة الغرفة. لتنقية خلايا INKT، resuspend 10 إلى الخلايا السابعة مع 100 ميكرولترات من أربع درجات مئوية PBS، إضافة 10 ميكرولتر من ألفا غاوسر تحميل CD1 tetramer PE واحتضان لهم في 4 درجات مئوية لمدة خمس عشرة دقيقة في الظلام. غسل الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني وإعادة تعليقها في 80 ميكرولترس من برنامج تلفزيوني.

إضافة 20 ميكرولترات من الميكروبات المضادة للPE واحتضانها في أربع درجات مئوية لمدة عشرين دقيقة في الظلام. غسلها مرتين مع برنامج تلفزيوني وإعادة تعليق الخلايا مع 500 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني. ضع عمود الفرز في المجال المغناطيسي لمزّر MACS وشطفه بـ 500 ميكرولترات من PBS.

إضافة تعليق الخلية المعدة إلى عمود الفرز، وجمع تدفق من خلال، وشطف ثلاث مرات مع المخزن المؤقت برنامج تلفزيوني. إزالة المجال المغناطيسي وإضافة ملليلتر واحد من المخزن المؤقت PBS إلى عمود الفرز. دفع بسرعة المكبس في ضغط مستمر لدفع الخلايا المسمى في أنبوب جمع.

والحصول على خلايا INKT المنقىة. عد مع عداد خلية تلقائي. لتحديد النمط الظاهري للخلية INKT، أولاً، خذ مرة واحدة عشرة إلى الخلايا السادسة من خلايا INKT المنقية وإعادة وضعها في 50 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني.

إضافة 0.5 ميكرولترات من ألفا غاوسر PE CD1 tetramer، أو 10 ميكرولترات من FITC TCR بيتا في أنبوب التحكم إيجابية واحدة. إضافة 0.5 ميكرولترات من ألفا غاوسر PE CD1 tetramer، إضافة 10 ميكرولترات من FITC TCR بيتا في أنبوب عينة. احتضانهم في أربع درجات مئوية لمدة ثلاثين دقيقة في الظلام.

بعد ذلك، قم بغسل الخلايا في برنامج تلفزيوني ثم الطرد المركزي بمعدل 200 مرة في g لمدة خمس دقائق. تجاهل supernatant وإضافة ملليلتر واحد من حل عمل التثبيت FoxP3. و حضن الخلايا لمدة 45 دقيقة بأربع درجات مئوية في الظلام

ثم، إضافة ملليلتر واحد من 1x حل العمل permeabilization والطرد المركزي الخلايا في 500 مرة ز في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. تجاهل المُندفع. إضافة ميكرولتر واحد من AlexaFluor 647 ماوس لمكافحة PLZF وميكر واحد من PerCP Cy5.5 ماوس مضاد للتبيت واحتضان لمدة ثلاثين دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام.

بعد ذلك، إضافة اثنين من ميكرولترات من حل العمل العازلة permeabilization والطرد المركزي في 200 مرة ز لمدة خمس دقائق للتنظيف. تجاهل المُندفع. إعادة تعليق الخلايا في 500 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني وقياس عن طريق تدفق القياسات.

في هذه الدراسة، بالمقارنة مع مجموعة التحكم، بدأت أصابع مجموعة نموذج RA لإظهار تورم أحمر بعد النمذجة مع تفاقم تدريجي. في 14 يوما، وتورم أحمر في مفصل الكاحل ذروتها تليها الإغاثة التدريجي. تظهر النتائج المرضية أن درجة تسلل الخلايا الالتهابية في أنسجة الكاحل الزليلية للفئران نموذج RA كانت مختلفة في مراحل مختلفة.

حدث التهاب الذروة في اليوم 14 آخر النمذجة. في المجموعة النموذجية RA، زادت مستويات المصل من السيتوكينات الموالية للالتهابات بشكل كبير 11 يوما و 14 يوما بعد النمذجة. في حين انخفض السيتوكينات المضادة للالتهابات بشكل كبير.

هذا الرقم يظهر أن معدل INKT2 في الفئران العادية كان حوالي خمسة في المئة. وكان معدل INK2 حوالي 82 في المئة بعد في تحريض الجسم الحي. وكان معدل INK2 أكثر من 92 في المئة بعد تنقية أجهزة ماكينتوش.

هنا نعرض طريقة مستحلب بوليبتيد الرئيسية التي نراها في جمهورية أرمينيا. يتم الاحتفاظ قطرات مستحلب في الماء لمدة 10 دقائق. النتائج تتفرق هذا البروتوكول هو وظيفة إضافية جديدة لعلاج خلايا NKT RA التي تم رفعها.

التي يمكن تطبيقها نحو العلاج المناعي الخلوي أو أمراض المناعة الذاتية الأخرى والأورام. هذا النموذج يمكن أن تحفز الانتشار الشامل للخلايا CD4 T وNKT العجز في الخلايا في المرضى RA, الذي يضع الأساس لدراسة متعمقة للمسارات المناعية RA. في هذا البروتوكول، يتم حقن السم السعال الديكي interperitoneally أثناء النمذجة.

يرجى ارتداء الملابس التجريبية والقفازات التي يمكن التخلص منها. وتحمل جميع معايير العملية وذلك لمنع طعنة التهابات.