Name: عزل مقلة العين السليمة للحصول علي الانسجه السطحية البصرية المتكاملة للفحص النسيجي والمناعي (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 15 s
Description: تعلم عزل مقلة العين الفأرية مع الحفاظ على سلامة السطح البصري للفحص النسيجي والمناعي. تُستخدم هذه الطريقة لدراسة أمراض العين وتطورها بدقة عالية.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ويشكر المؤلفان البروفيسور رونغ جو علي القراءة الناقدة للمخطوطة ، وجميع أعضاء المختبر للحصول علي المساعدة التقنية. وقد دعم هذا العمل بمنح مقدمه من المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (NSFC: 31571077 ؛ بيجين ، الصين) ، مشروع مدينه قوانغتشو للابتكار في مجال العلوم والتكنولوجيات (201707020009 ؛ قوانغتشو ، مقاطعه قوانغدونغ ، الصين) ، "100 خطه الناس" من جامعه صن يات سين (8300-18821104 ؛ قوانغتشو ، مقاطعه قوانغدونغ ، الصين) ، والتمويل البحثي من مختبر الدولة مفتاح طب العيون في مركز تشونغشان للعيون (303060202400339 ؛ قوانغتشو ، مقاطعه قوانغدونغ ، الصين).

تمت الموافقة علي جميع الإجراءات التي تنطوي علي استخدام الفئران من قبل لجنه العناية بالماشية واستخدامها ، مركز تشونغشان للعيون ، وانضم إلى بيان ARVO لاستخدام الحيوانية في بحوث العيون والبصر.
1. تشريح مقلة العين مع سطح العينين سليمه والجفون
<ol><li>تشريح الراس.<ol>
<li>موت ببطء اليوم التالي للولادة 10 (P10) و P28 الفئران (انظر جدول المواد لسلالات الماوس) عن طريق خلع عنق الرحم ، وقطع راس الرقبة من قبل زوج من مقص حاد.</li>
		<li>الراس bisect مع زوج من مقص مستقيم علي طول خط الوسط السهمي بداية في العظم الجدارية rostrally إلى الأنف (الشكل 1ا ، ب). ملاحظه: عظم الجمجمة يصلب مع الشيخوخة الماوس ، وتوخي الحذر للحفاظ علي مقص قطع علي طول خط الوسط قدر الإمكان.</li>
		<li>ضع كل نصف الراس المقطوع في طبق بيتري نظيف ، واقطع الفك واللسان أولا باستخدام مقص حاد. حرر العصب البصري عن طريق تقطيعه من الدماغ قبل الموقع التصالب البصرية ، وأزاله جميع انسجه المخ بما في ذلك لمبة حاسة الشم تعلق علي جدار الجمجمة.</li>
		<li>الآن الانسجه المتبقية يجب ان يكون كل العظام الجمجمة/المدارية المرتبطة مقلة العين (الشكل 1ج ، د). غسل الجزء المتبقي مع برامج تلفزيونيه لتنظيف الدم والحطام الشعر.</li>
		<li>الانسجه بادئه مع 4 ٪ بارافورمالدهيد (PFA ، في المحلول الملحي الفوسفات مخزنه [بالفيديو] ، pH 7.4) في أنبوب مخروطي 50 mL في درجه حرارة الغرفة (RT) مع التناوب. الوقت التقريبي للتثبيت علي النحو التالي: ~ 10 دقيقه ل P0 إلى P7; ~ 20 دقيقه ل P8 إلى P28; و ~ 30 دقيقه ل P29 وكبار السن. ملاحظه: يوفر التثبيت المسبق صلابة الانسجه مما يجعل التشريح الناتج أسهل. بالاضافه إلى ذلك ، يتجنب التثبيت المسبق ترك الانسجه الطازجة غير ثابته لفتره طويلة قبل اكتمال التشريح. تحذير: PFA خطره ويجب التعامل معها بعناية.</li>
	</ol></li>
	<li>أزاله الجمجمة/العظام المدارية.<ol>
<li>بعد التثبيت ، بسرعة غسل الراس تشريحها في الاذاعه التلفزيونية ثلاث مرات لمزيد من القضاء علي الشعر المكسور والمثبتات من أجل المضي قدما في تشريح مزيد من. تحذير: يمكن ان يكون التعرض للتثبيتات اثناء التشريح ضارا بالصحة.</li>
		<li>ضع النسيج في طبق بيتري 10 سم ، وقطع الجمجمة إلى ثلاثه أجزاء علي طول الطائرات المشار اليها في الشكل 1D ، E. يتم إخفاء مقلة العين في المقبس في الجزء الأوسط من الجمجمة تحت ethmoid ، والعظام الاماميه والفك العلوي (الشكل 1د ، ه).</li>
		<li>استخدم زوجين من الملقط المستقيم رقم 4 لتقشير العظم الغربالي للكشف عن العظام الاماميه والفك العلوي بشكل كامل (الشكل 1و).</li>
		<li>تقسيم سطح الجمجمة جغرافيا (بما في ذلك الفك العلوي والعظام الاماميه) إلى 4 مناطق (الشكل 1و). ادخل طرف الملقط المنحني أفقيا في كل منطقه لأزاله العظم الفكي والامامي بالتتابع (الشكل 1و). ملاحظه: لا يمكن أزاله العظام الفك العلوي في وقت واحد. تشريح بصبر لهم قطعه من قطعه. العظم الجبهي متصل مباشره بمقلة العين من خلال الانسجه الضامة اللينة. توخي الحذر عند ازالته من مقلة العين لمنع تمدد مقلة العين والاضرار الملتحمة.</li>
		<li>بعد أزاله العظم الفكي الجزئي وجميع العظام الاماميه ، ستتعرض العظام الدمعية الاساسيه وعظم الجوغال (الشكل 1G). أزاله العظام اثنين والعضلات تحت الجلد المرتبطة والدهون المحيطة مقلة العين ، وتقليم مقلة العين مع الجفون المرفقة والجلد في كتله صغيره الشكل مربع للحد من حجم الانسجه وتسهيل توجيه الانسجه عند تضمين (الشكل 1 ح).</li>
		<li>وضع مقلة العين والانسجه المرتبطة بها مره أخرى إلى 4% PFA والاستمرار في إصلاح بين عشيه وضحيها في 4 ° c. النسيج ثابته يستطيع كنت حافظت ل علي الأقل واحده شهر في 4 [ك] في [ببس] مع أضافه من 0.02% [نان]3. بدلا من ذلك ، انتقل إلى التحليل النسيجي علي الفور. ملاحظه: إذا كان النسيج يحتاج إلى تخزين لفترات أطول ، فانه يمكن تخزينها بسهوله في 70 ٪ الايثانول.</li>
	</ol></li>
</ol>2. التحليل النسيجي
<ol><li>البارافين القسم والدم والخلايا الدموية و يوزين (H & E) تلطيخ<ol>
<li>اتبع البروتوكول القياسي الموصوف في مكان آخر9 لاجراء تضمين البارافين والتقسيم.</li>
	</ol>
</li>
	<li>مناعي (IHC)<ol>
<li>ديواكس أقسام البارافين مع اكسيلين وأعاده ترطيب الأقسام من خلال سلسله الكحول (100 ٪ ، 95 ٪ ، 80 ٪) في الماء المقطر (dH2س).</li>
		<li>اجراء استرداد مستضد عن طريق المعالجة بالموجات الدقيقة من الشرائح الانسجه في 0.01 M العازلة حامض الستريك (3 غرام من سترات الصوديوم ، 0.4 غرام من حمض الستريك في 1 لتر المقطر المزدوج H2س) في جره الشريحة الزجاجية مع انخفاض الطاقة (120 W). وينبغي ان يتم تسليم الطاقة بشكل متقطع لمجموع 5-10 دقيقه مع كل فاصل زمني يدوم حوالي 2 دقيقه. ملاحظه: الميكروويف عاليه الطاقة أو التدفئة متسقة تؤدي إلى انفصال أقسام الانسجه من الشريحة.</li>
		<li>اقتطاف الشرائح من جره زجاجيه ، ويمسح بعناية قباله السائل المتبقية المحيطة كل قسم باستخدام انسجه الوجه ووضعها علي رف الشريحة في مربع الانسجه. رسم مربع حول كل قسم مع قلم النسيجية للماء. مكان 100 μL من حجب العازلة (0.1 ٪ تريتون X-100 و 10 ٪ حمار المصل في 1x تلفزيوني) علي كل مربع ، واحتضان لمده 30 دقيقه في RT.</li>
		<li>أزاله بعناية حل الحجب مع فراغ ، أضافه الأجسام المضادة الاساسيه (انظر جدول المواد) مع التخفيف المطلوب في حظر العازلة ، والاستمرار في احتضان الشرائح في 4 درجه مئوية لمده 24 ساعة أو أكثر. ملاحظه: يختلف تركيز كل الأجسام المضادة الاساسيه المستخدمة في IHC ، ويحتاج إلى اختبارها في التجارب التجريبية.</li>
		<li>يغسل الشرائح الانسجه مع PBST (0.1 ٪ تريتون في الاذاعه التلفزيونية) ثلاث مرات ، لمده 10 دقيقه لكل منهما. كرر الخطوة 4.2.2 باستخدام الأجسام المضادة الثانوية (انظر جدول المواد) مع 4 ' ، 6-diamidino-2-فينيلانديول (dapi) استبدال المخزن المؤقت الحظر. الاستمرار في احتضان لمده 4 ساعات علي الأقل أو أكثر في درجه حرارة الغرفة (RT).</li>
		<li>أزاله الأجسام المضادة الثانوية ، وغسل أقسام الانسجه مع محلول PBST ثلاث مرات ، لمده 10 دقيقه لكل منهما ، ثم يغسل مع برامج تلفزيونيه نظيفه لمده 5 دقائق أخرى.</li>
		<li>امسح الأجزاء المتبقية من الانسجه المحيطة بالمقاطع التلفزيونية ، وجبل الشفتين علي الأقسام ذات التركيب المتوسط. أداء المجهر الفلورسنت للحصول علي الصور (انظر جدول المواد).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Swamynathan, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ocular+surface+development+and+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Ocular surface development and gene expression.</a> Journal of Ophthalmology. 2013, (2013).</li>
<li>Arita, R., Fukuoka, S., Morishige, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+Morphology+of+the+Lipid+Layer+of+the+Tear+Film%5BTitle%5D)+AND+%22Cornea%22%5BJournal%5D)">Functional Morphology of the Lipid Layer of the Tear Film.</a> Cornea. 36 Suppl 1, S60-S66 (2017).</li>
<li>Guo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ocular+surface+pathogenesis+associated+with+precocious+eyelid+opening+and+necrotic+autologous+tissue+in+mouse+with+disruption+of+Prickle+1+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Ocular surface pathogenesis associated with precocious eyelid opening and necrotic autologous tissue in mouse with disruption of Prickle 1 gene.</a> Experimental Eye Research. 180, 208-225 (2018).</li>
<li>Knop, E., Knop, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomy+and+immunology+of+the+ocular+surface%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Immunology+and+Allergy%22%5BJournal%5D)">Anatomy and immunology of the ocular surface.</a> Chemical Immunology and Allergy. 92, 36-49 (2007).</li>
<li>Mizoguchi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ocular+surface+alkali+injury+damages+meibomian+glands+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22The+Ocular+Surface%22%5BJournal%5D)">Ocular surface alkali injury damages meibomian glands in mice.</a> The Ocular Surface. 15 (4), 713-722 (2017).</li>
<li>Gipson, I. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Goblet+cells+of+the+conjunctiva%3A+A+review+of+recent+findings%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Goblet cells of the conjunctiva: A review of recent findings.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 54, 49-63 (2016).</li>
<li>Nowell, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+inflammation+imposes+aberrant+cell+fate+in+regenerating+epithelia+through+mechanotransduction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Chronic inflammation imposes aberrant cell fate in regenerating epithelia through mechanotransduction.</a> Nature Cell Biology. 18 (2), 168-180 (2016).</li>
<li>Nagata, M., Ohashi, Y., Ozawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+histochemical+study+of+the+development+of+premaxilla+and+maxilla+during+secondary+palate+formation+in+the+mouse+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Histology+and+Cytology%22%5BJournal%5D)">A histochemical study of the development of premaxilla and maxilla during secondary palate formation in the mouse embryo.</a> Archives of Histology and Cytology. 54 (3), 267-278 (1991).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+MEK+kinase+1+in+TGF-beta%2Factivin-induced+epithelium+movement+and+embryonic+eyelid+closure%5BTitle%5D)+AND+%22The+Embo+Journal%22%5BJournal%5D)">A role for MEK kinase 1 in TGF-beta/activin-induced epithelium movement and embryonic eyelid closure.</a> The Embo Journal. 22 (17), 4443-4454 (2003).</li>
<li>Sharov, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noggin+overexpression+inhibits+eyelid+opening+by+altering+epidermal+apoptosis+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Embo+Journal%22%5BJournal%5D)">Noggin overexpression inhibits eyelid opening by altering epidermal apoptosis and differentiation.</a> The Embo Journal. 22 (12), 2992-3003 (2003).</li>
<li>Setala, N. L., Metso, J., Jauhiainen, M., Sajantila, A., Holopainen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dry+eye+symptoms+are+increased+in+mice+deficient+in+phospholipid+transfer+protein+%28PLTP%29%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Dry eye symptoms are increased in mice deficient in phospholipid transfer protein (PLTP).</a> The American Journal of Pathology. 178 (5), 2058-2065 (2011).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mastermind-like+transcriptional+co-activator-mediated+Notch+signaling+is+indispensable+for+maintaining+conjunctival+epithelial+identity%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Mastermind-like transcriptional co-activator-mediated Notch signaling is indispensable for maintaining conjunctival epithelial identity.</a> Development. 140 (3), 594-605 (2013).</li>
<li>McCauley, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGFbeta+signaling+inhibits+goblet+cell+differentiation+via+SPDEF+in+conjunctival+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">TGFbeta signaling inhibits goblet cell differentiation via SPDEF in conjunctival epithelium.</a> Development. 141 (23), 4628-4639 (2014).</li>
<li>Guo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ocular+surface+pathogenesis+associated+with+precocious+eyelid+opening+and+necrotic+autologous+tissue+in+mouse+with+disruption+of+Prickle+1+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Ocular surface pathogenesis associated with precocious eyelid opening and necrotic autologous tissue in mouse with disruption of Prickle 1 gene.</a> Experimental Eye Research. 180, 208-225 (2019).</li>
</ol>

وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.

أحد التذكيرات الهامه لاعداد مقلة العين السليمة هو ان جميع العظام المدارية يجب ازالتها تماما ، وخاصه العظام الجوقة والدمعية ، والتي هي صغيره وتقع بالقرب من الجزء السفلي من تجويف العينين. اي عظام اليسار قد تعقد الانسجه التي تلت ذلك. في حاله عدم أزاله قطعه صغيره من العظم بالبالكامل من التشريح عن طريق الصدفة ، قد يتم انتقاؤها من كتله البارافين المضمنة باستخدام زوج من الشاربات. يجب ان تملا الحفرة التي خلفتها بالبارافين المذاب بعد هذه العملية.
وينبغي توخي الحذر الإضافي عند التعامل مع العدسة. القطع ا...

يتكون سطح العين من ورقه مستمرة من ظهاره الاقليميه بما في ذلك الملتحمة جفني ، والملتحمة بولبار والقرنية1. ترتبط العديد من الهياكل الغديه مع ظهاره سطح العين وتولد معا طبقه من فيلم المسيل للدموع حماية سطح القرنية من التجفيف والغزوات البيئية2. قد يؤدي تعطيل نظام التشغيل إلى قرنيه أو التهاب الملتحمة أو كليهما (قرنيه). كل من العوامل الوراثية والمهيجات البيئية أو تفاعلاتها تسهم في التعديلات المرضية من OS3,4. وتبعا لذلك ، استخدمت مجموعه متنوعة من النماذج الحيوانية المهندسة وراثيا والمستحثة ماديا أو كيميائيا لدراسة عمليات الامراض في نظام التشغيل البشري.
هيكل ووظيفة الماوس OS مماثله لتلك التي من البشر في نواح كثيره. كما ان مكونات الفيلم المسيل للدموع التي تفرزها الغدد البصرية متشابهة أيضا بين الفئران والبشر. وقد أجريت ثروة من الدراسات باستخدام نماذج الماوس لليات التوضيح من امراض الإنسان OS5,6,7. في كثير من المناسبات ، من الضروري تحليل التغيرات العالمية بدلا من التغييرات الجزيئية المحلية لنظام التشغيل للحصول علي معلومات شامله تحت نفس العلاج التجريبي. ولذلك ، هناك حاجه إلى اعداد عينه مع سلامه جيده لضمان كل جزء من نظام التشغيل ليتم تحليلها في وقت واحد.
الماوس نظام التشغيل المرتبطة باحكام مقلة العين التي كانت جزءا لا يتجزا من التجويف/المدار (كوب عظمي مصنوعة من عده عظام الجمجمة المختلفة) ويتصل به من خلال الانسجه الضامة رقيقه. هناك تحديات هائله لتشريح سطح العين كله دون الاضرار بالملتحمة جفني أو بصلي. وهذه التحديات تنحدر من: ' 1 ' ان نظام التشغيل لين ورقيق ومثبت علي الجفون ومقلة العين المنقولين ماديا ، التالي فهو معرض للتشويه والتلف ؛ و ' 2 ' الحيز المحدود بين العظام المدارية ومقلة العين يقيد عمليات التشريح. التحديات هي أكبر بكثير بالنسبة للماوس الكبار. في الفاره الجنينية ، والتحجر العظام المدارية ليست كامله والانسجه المحيطة هي فضفاضة نسبي8. يمكن أزاله الراس وتقسيمها ، ومن ثم تعرض مباشره لتثبيت بارافورمالدهيد (PFA) وتضمين9. وعلي النقيض من ذلك ، فان العظام المدارية الفارهة بعد الولادة والبالغة هي متحجرة تماما مع الانسجه المحيطة السميكة ، مما يجعل تغلغل المثبتات اقل كفاءه. وعلاوة علي ذلك ، العظام المدارية/الجمجمة من الصعب وهشه ، وكسر بسهوله عند التماس لهم في المركبات التضمين لينه مثل البارافين. سوف تمزق القطع المكسورة من العظام بالإجماع الانسجه القريبة مما ادي إلى المورفولوجية الانسجه السفلي.
كثير نشر دراسات غالبا يبدي متحيزة عين سطح, اي يمكن كنت كاف ل هم خاصه بحث أغراض10,11. وقد وجدت دراسة إجماليه للآداب دراسات قليله فقط تبين السطح الكامل للعين السليمة دون وصف مفصل لبروتوكولات التشريح12،13. في هذا البروتوكول ، قمنا بتفصيل طريقه تشريح للحصول علي سطح العين المتكامل بعد الولادة ، والتي تم فيها أزاله العظام المدارية والجمجمة بشكل منظم ، تاركه سطح العين البكر مع مقلة العينين والجفون ، وتقليل الاضرار المادية. درسنا كذلك الانسجه نظام التشغيل وأداء مناعي باستخدام أقسام الانسجه التي أعدت مع هذا البروتوكول.

<table><tbody><tr><td>1 وأقات. محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS)</td> <td>Transgen Biotech</td><td>FG701-01</td><td></td></tr><tr><td>50 مل أنبوب طرد مركزي</td><td>Corning</td><td>430829</td><td></td></tr><tr><td>شرائح مجهر لاصق مختلفة</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td><td>Invitrogen / Life Technologies</td><td>A12379</td><td>التركيز المقترح 1: 500 - 1,000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 Phalloidin</td><td>Invitrogen / Life Technologies</td><td>A12380</td><td>التركيز المقترح 1: 500 - 1,000</td></tr><tr><td>الجسم المضاد ل K12</td><td>Abcam</td><td>ab124975</td><td>التركيز المقترح 1: 1,000</td></tr><tr><td>الجسم المضاد ل K14</td><td>Abcam</td><td>ab7800</td><td>التركيز المقترح 1: 800</td></tr><tr><td>حامض الستريك</td> شريحة <td>غطاء مختلف</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td> ملقط منحني مختلف <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>أدوات</td> <td>الدقة العالمية14127</td><td></td></tr><tr><td>تشريح المجهر.</td><td>Olmpus</td><td>SZ61</td><td></td></tr><tr><td>الكحول الإيثيلي</td><td>مجهر الفلورسنت المختلف</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Zeiss</td><td>AxioImager.Z2</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount-G وسائل الإعلام المتصاعدة</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>مايكرو تشريح مقص مستقيم شفرة</td><td>عالمية أدوات دقيقة</td><td>503242</td><td></td></tr><tr><td>أفران الميكروويف</td><td>Galanz</td><td>سلالات الماوس P70D20TL-D4</td><td></td></tr><tr><td></td><td>C57 / BL6 و Sv129 مختلطة</td><td></td><td></td></tr><tr><td>الملقط المستقيم رقم 4</td><td>أدوات الدقة العالمية</td><td>501978-6</td><td></td></tr><tr><td>مصل الماعز</td><td>العادي مختلف</td><td></td><td></td></tr><tr><td>بارافورمالدهايد (PFA) مختلف</td><td></td><td></td> <td>إعداد حل 4٪ في 1 & ممرات ؛ PBS والفلتر مع 0.45 & mu ؛ م مرشح غشاء</td></tr><tr><td>الأنسجة طبق ثقافة الأنسجة</td><td>مختلف</td><td></td><td></td></tr><tr><td>سترات ثلاثي الصوديوم</td><td>مختلفة تريتون</td><td></td><td></td></tr><tr><td>X-100</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>SLBW6818</td><td></td></tr></tbody></table>

عزل مقلة العين السليمة للحصول علي الانسجه السطحية البصرية المتكاملة للفحص النسيجي والمناعي

Isolation of Intact Eyeball to Obtain Integral Ocular Surface Tissue for Histological Examination and Immunohistochemistry

سطح العين (نظام التشغيل) يتكون من ورقه الظهاريه مع ثلاثه أجزاء متصلة: الملتحمة جفني ، بولبار الملتحمة وظهاره القرنية. قد يؤدي تعطيل نظام التشغيل إلى قرنيه أو التهاب الملتحمة أو كليهما (قرنيه). في النماذج الحيوانية التجريبية مع بعض التعديلات الوراثية أو العمليات الاصطناعية ، فمن المفيد لفحص جميع أجزاء من ورقه الظهاريه OS لتقييم التغيرات المرضية النسبية لكل جزء في نفس الوقت. ومع ذلك ، فقد كان تشريح انسجه نظام التشغيل ككل دون تشويه أو ضرر تحديا ، ويرجع ذلك في المقام الأول إلى نعومه ونحافة نظام التشغيل المثبت علي الجفون المنقولة جسديا ومقلة العين. بالاضافه إلى ذلك ، فان ماخذ العين العميقة التي شكلتها الجمجمة الصلبة/العظام المدارية مشغولة تماما من قبل المقلة تاركه مساحة محدوده لتشغيل الأجزاء المتقطعة. ونتيجة لذلك ، فان التشريح المباشر لمقلة العين مع انسجه نظام التشغيل المرتبطة من جانب الوجه غالبا ما يؤدي إلى تلف الانسجه ، وخاصه الملتحمة الشاحبة والبولبار. في هذا البروتوكول ، وصفنا طريقه لأزاله الجمجمة والعظام المدارية بالتتابع من راس الماوس المقطوع ، تاركا الجفون وسطح العين والعدسة والشبكية تماما في قطعه واحده. تم الحفاظ علي سلامه ورقه نظام التشغيل بشكل جيد ويمكن فحصها من قبل الانسجه أو المناعة في قسم واحد.

تم توضيح عظام الجمجمة الرئيسية التي تم النظر اليها من وجات نظر مختلفه في الشكل 1ا-ه، مع ألوان التي تدل علي عظام مختلفه. استخدمنا أربعه أسابيع الحيوانية القديمة لإظهار عمليات تشريح. بعد التشريح الخطوات 1.1.1-1-1-3 والتثبيت المسبق قصيرة (الخطوة 1-1-4) ، وتظهر مقلة العين مع عظام الوجه المرتبطة بها في الشكل 1ه. مزيد من تقليم لأزاله الامامي (الأنف والفك العلوي) والخلفي (علي سبيل المثال ، الجدارية) ، ف...

هذا البروتوكول يصف طريقه لعزل مقلة العين الماوس مع جفن, سطح العينين, الأجزاء الاماميه والخلفية في موقف سليمه نسبيا.

Ocular surface (OS) consists of an epithelial sheet with three connected parts: palpebral conjunctiva, bulbar conjunctiva and corneal epithelium. ...

يركز مختبرنا على تطوير العين والأمراض. يصف هذا البروتوكول طريقة لإزالة الجمجمة والعظام المدارية بشكل متسلسل من رأس الماوس تشريح. ترك الجفون، سطح العين، العدسة، والشبكية معا في قطعة واحدة. وسيفيد البروتوكول أطباء العيون المهتمين بالطبّاقات البصرية. أنا ديانيل قوه، لأقول لهذه التقنية مع صراع المرجح عند محاولة تجنب الضرر من مقلة العين، في حين تشريح عظام الوجه. والميزة الرئيسية لهذه المسألة تشريح هو أن سلامة ورقة سطح العين الظهارية يتم الحفاظ عليها بشكل جيد ويمكن فحص أجزاء مختلفة من سطح العين عن طريق الأنسجة أو المناعة في قسم واحد واحد. تأكد من قطع جميع العظام الصغيرة والحطام من الأنسجة الرخوة. السبب, فإنه يسبب علامات ندبة على قسم الأنسجة خلاف ذلك. بعد القتل الرحيم الماوس، واستخدام زوج من مقص مستقيم لقطع الرأس وتقطيعه على طول خط الوسط القوس بداية في العظام داخل البارياً إلى الأنف. ضع كل نصف الرأس المقطّع في طبق بتري نظيف واستخدم مقصًا حادًا لقطع الفك واللسان. حرّر العصب البصري بقطعه عن الدماغ قبل موقع chiasm البصري. وإزالة جميع أنسجة المخ بما في ذلك لمبة الشم، والتي تعلق على جدار الجمجمة. الآن كل الأنسجة المتبقية يجب أن يكون كل من الجمجمة والعظام المدارية المرتبطة مقلة العين. غسل الأجزاء المتبقية مع برنامج تلفزيوني لتنظيف أي من الدم والحطام الشعر. إصلاح ما قبل الأنسجة عن طريق وضعها في أنبوب 50 ملليلتر تحتوي على 4٪ شبهformaldehyde وتناوب عليها في درجة حرارة الغرفة. بعد التبّارع كاملة، وغسل الرأس تشريح بسرعة في برنامج تلفزيوني ثلاث مرات لمواصلة القضاء على الشعر المكسور والمثبتات. وضع الأنسجة في طبق بتري 10 سم وقطع الجمجمة إلى ثلاثة أجزاء على طول الطائرات المشار إليها في الشكل واحد من بروتوكول النص. يتم إخفاء مقلة العين والمقبس في الجزء الأوسط من الجمجمة تحت عظام الإتشميلة وعظام الفك العلوي. استخدام اثنين من أزواج من عدد أربعة ملقط على التوالي لتقشر قبالة العظام ethmoid وفضح تماما العظام الأمامية وماكسيلاري. ثم، تقسيم جغرافيا سطح الجمجمة إلى أربع مناطق. أدخل طرف ملقط منحني أفقيا في كل منطقة لإزالة العظام الفكية والعظام الأمامية بالتسلسل. بعد ذلك، سيتم كشف عظام اللادمية والزلاجة الكامنة. إزالة عظمتين والعضلات والدهون تحت الجلد المرتبطة بها المحيطة مقلة العين. تقليم مقلة العين مع الجفون المرفقة والجلد في كتلة صغيرة، على شكل مربع للحد من حجم الأنسجة وتسهيل توجيه الأنسجة عند تضمين. ضع مقلة العين والأنسجة المرتبطة بها مرة أخرى إلى 4٪ شبهformaldehyde والاستمرار في إصلاح بين عشية وضحاها في 4

isolation-intact-eyeball-to-obtain-integral-ocular-surface-tissue-for

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

في هذا الفيديو ، سوف نقوم شرح كيفية عزل الخلايا الجذعية من الظهارة الشبكية الهدبية للعين الماوس وتنمو لهم في مجالات الثقافة لتشكيل نسيلي الشبكية. المجالات التي يتم عزل تمتلك خصائص أساسية للخلايا الجذعية : الذات وتجديد multipotentiality.

عزل الخلايا الجذعية من شبكية العين بالعين ماوس

وتصف الورقة تقنية مبسطة لاستئصال القرنية وسلب أنسجة شبكية العين من الكرة الأرضية من الجهات المانحة جثي الإنسان. ووصف هذه التقنية هنا ستساعد على استئصال الأنسجة ذات نوعية جيدة لاستخدامها في زراعة الأعضاء، وأغراض الجراحية أو البحث دون الإضرار الأنسجة الأخرى من الكرة الأرضية العين.

أسلوب مبسط لل<em&gt; في الموقع</em&gt; استئصال القرنية ونزع الأحشاء من نسيج شبكي من الكرة الأرضية العين البشرية

يوضح هذا الفيديو طريقة للحث على التهاب سطح العين وخلل الغدة الميبومية في نموذج الفئران. يؤدي تحفيز الجهاز المناعي للفأر باستخدام مادة مناعية وإعادة التحفيز لاحقا بنفس الجين المناعي إلى تعزيز التهاب سطح العين ، مما يؤدي إلى انسداد إفراز غدة ميبوميان من خلال aggNETs التي تنتجها العدلات ويؤدي إلى مرض جفاف العين.

طريقة للحث على التهاب سطح العين في نموذج الفئران

الهدف من هذا البروتوكول هو إظهار تقنية فعالة لعزل اللب الزجاجي الكامل والسليم والقشرة من عيون الخنازير بعد الوفاة.

زجاجي كله فكاهة تشريح لتحليل Vitreodynamic

يتكون سطح العين الطبيعي المكشوف من القرنية والملتحمة. الخلايا الظهارية، وخلايا الكأس والخلايا المناعية موجودة في الملتحمة. هنا، يتم وصف غير الغازية، وتقنية الخلايا الانطباع باستخدام جهاز علم الانطباع والتدفق الخلوي لتحليل الخلايا المناعية في الملتحمة.

وهناك طريقة غير الغازية لعزل والنمط الظاهري الخلايا من الملتحمة

الهدف من هذا البروتوكول هو توصيف نموذج جديد للتنكس العصبي الزرق على أساس الكي الحراري 360 درجة للضفيرة الوعائية الحوفية ، مما يؤدي إلى ارتفاع ضغط الدم العيني تحت الحاد.

الكي الكامل الدائرة للضفيرة الوعائية الداكنة حول القزحية للزرق المستحث جراحيا في القوارض

تقدم هذه الورقة بروتوكولا للتشريح الدقيق للعين في القوارض. تتضمن العملية استئصال مقلة العين جنبا إلى جنب مع الغشاء النيكتيتي (أي الجفن الثالث). ثم يتبع ذلك فصل كؤوس العين الخلفية والأمامية.

التشريح المجهري لعين القوارض

يحدد هذا البروتوكول إجراءات الحصول على الخلايا الظهارية الصبغية الأولية للشبكية (RPE) واستزراعها من عيون الخنازير من مصادر محلية. تعمل هذه الخلايا كبديل عالي الجودة للخلايا الجذعية وهي مناسبة لأبحاث الشبكية في المختبر .

عزل الخلايا الظهارية الصبغية الشبكية الأولية للنمذجة في المختبر

تصف هذه المخطوطة بروتوكولا مفصلا لعزل خلايا مولر الدبقية في شبكية العين عن عيون الفئران. يبدأ البروتوكول باستئصال وتشريح عيون الفأر ، يليه عزل خلايا مولر وبذرها وزراعتها.

عزل خلايا مولر الدبقية الدبقية لشبكية الفأر الأولية

يعد التقسيم الإجمالي الشامل والموحد للكرات الأرضية غير الورمية أمرا مهما للحصول على أقسام نسيجية مرضية عالية الجودة قابلة للتكرار. وترد هنا مبادئ توجيهية لتقدير الكرات الأرضية غير الورمية للبالغين والجنين. يتم عرض ومناقشة خيارات مختلفة لتقسيم الكرة الأرضية ، بما في ذلك معايير اتخاذ القرارات على أساس الحالة.

إجمالي الكرات الأرضية غير الورمية ، بما في ذلك عيون الجنين

تقدم هذه الدراسة منهجية لتوصيل العلاجات إلى شبكية العين والأعصاب البصرية للفئران البالغة. بالإضافة إلى ذلك ، يتم تقديم طريقة فريدة لاسترجاع الأنسجة لمجموعة من أعلى إلى أسفل من العصب البصري وشبكية العين في الفئران البالغة.

التوصيل العلاجي للعين واسترجاع الأنسجة المتقدم في الفئران البالغة

تعلم عزل مقلة العين الفأرية مع الحفاظ على سلامة السطح البصري للفحص النسيجي والمناعي. تُستخدم هذه الطريقة لدراسة أمراض العين وتطورها بدقة عالية.

عزل مقلة العين السليمة للحصول علي الانسجه السطحية البصرية المتكاملة للفحص النسيجي والمناعي

استكشف المزيد من الفيديوهات