طريقة عالية الإنتاجية في الموقع لتقدير البليدي النووي الكبدي في الفئران
أبريل 19, 2020
نحن نقدم طريقة قوية وفعالة من حيث التكلفة ومرنة لقياس التغيرات في عدد الكبد وploidy النووية داخل عينات الأنسجة الثابتة / cryopreserved التي لا تتطلب قياس خلايا التدفق. نهجنا يوفر توقيع عينة قوية على نطاق واسع من علم خلايا الكبد مثالية لتتبع تطور إصابات الكبد والمرض.
هذه الطريقة تمكن المستخدم من توليد لمحة عن محتوى الحمض النووي الكبد من أقسام الأنسجة 2D لدراسة تطوير الكبد، والتجدد، والأمراض المزمنة. ويمكن تطبيق هذا النهج الإنتاجية العالية الآلي على جميع أقسام أنسجة الكبد 2D، وتوفير قراءات معايرة داخليا من ploidy النووية لجميع نويات الكبد الدائرية بسيطة. وترتبط التغيرات في ploidy النووية الكبدية مع الشيخوخة, أمراض الكبد المزمنة, والسرطان.
هذه التقنية توفر وسيلة بسيطة لملف ploidy النووية في عينات الكبد ثابتة أو cryopreserved. في الموقع طرق التنميط ploidy لديها إمكانات كبيرة كالبحوث والأدوات السريرية لتتبع تطور أمراض الكبد لأنها لا تتطلب إزالة التصنيف العنصري الأنسجة أو الوصول إلى المواد الجديدة. بعد حصاد العينة أنسجة الكبد مورين, تضمين فصوص الكبد في درجة حرارة قطع الأمثل مملوءة المبردة وضع القالب على الفور على الجليد الجاف لضمان التجميد السريع.
للحصول على شرائح من عينة الفصوص الكبد المجمدة، مقطع العينة بسمك ستة ميكرومتر، ووضع شريحة مطلية بالبولي أميد المغلفة على كل عينة لمدة خمس ثوان للسماح لكل عينة عصا الشريحة. عندما يتم جمع جميع الشرائح ، والسماح للعينات لتكلس لمدة ثلاث إلى خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة قبل immunolabeling. في نهاية التوازن، وإصلاح أقسام الأنسجة في غطاء الدخان مع ملليلتر واحد من 4٪ شبهفورمالدهيد في برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
في نهاية التثبيت ، شطف الشرائح مع ثلاث يغسل ثلاث دقائق في برنامج تلفزيوني مع التحريض لطيف. بعد الغسيل الأخير، جفف المنطقة المحيطة بكل قسم من الأنسجة واستخدم قلمًا محمّلًا لرسم دائرة حول كل عينة. ل Permeabilize العينات، وعلاج المقاطع مع السطح 0.5٪ غير الأيونية في برنامج تلفزيوني لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
في نهاية الحضانة، وغسل العينات لمدة ثلاث دقائق في برنامج تلفزيوني مرتين مع التحريض لطيف كما هو موضح قبل منع الربط غير محددة مع محلول المصفاة من 1٪ البوم البقرية، 5٪ مصل الحصان، و 0.2٪ السطح غير الأيونيك في برنامج تلفزيوني لمدة ساعة واحدة على الأقل في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، احتضان الشرائح مع الأجسام المضادة HHF4-ألفا المخففة في عازلة منع بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية في غرفة تلطيخ رطبة محمية من الضوء. في صباح اليوم التالي ، وغسل الشرائح أربع مرات في برنامج تلفزيوني مع التحريض لطيف قبل الحضانة مع الجسم المضاد الثانوي الفلوري المناسب وHoechst المخفف في تصفية 1 ٪ البوم البقرية و 0.2 ٪ غير الأيونيك السطحي في برنامج تلفزيوني لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة في غرفة تلطيخ رطبة محمية من الضوء.
في نهاية الحضانة، وغسل الشرائح أربع مرات كما هو موضح، تليها اثنين من يغسل ثلاث دقائق في الماء المقطر مزدوجة مع الانفعالات لطيف. بعد الغسيل الأخير، قم بتركيب العينات مع قطرتين من الفلوريسنس المتصاعد المتوسط على غطاء، وطبق ضغط لطيف عند الضرورة للقضاء على أي فقاعات. ثم، تحقق من الشرائح باستخدام المجهر الفلوري التقليدي لضمان التثبيت الجيد والمناعة.
للحصول على صورة الفلوريسنس، قم بتعيين المعلمات على منصة تصوير عالية المحتوى للحصول على صور الفلورسينس باستخدام الإثارة المناسبة للفلوروفوريس المستخدمة. ثم مسح العينات للحصول على صور كافية للحصول على تغطية كاملة من قسم الأنسجة. في نهاية المسح، ضبط المعلمات تجزئة النووية من البرنامج لضمان أن يتم عزل النوى على النحو الأمثل وتعديل كثافة عتبة لضمان البوابات الأمثل من خلايا الكبد الإيجابية HNF4-ألفا وHNF4-ألفا السلبية غير parenchymal الخلايا.
بالنسبة للكمية النووية، تعيين المنطقة النووية في ميكرومتر مربع على أساس تلطيخ Hoechst، وكثافة هويشست النووية الرئيسية، وعامل استطالة النووية، ومؤشر التقريب النووي المتوسط، وحالة HNF4-alpha، وإحداثيات X النووية، Y على أساس مركز الثقل. لإجراء تحليل ploidy النووية hepatocyte، أولا تحميل وتثبيت برنامج تحليل الكم ploidy. في MATLAB، انتقل إلى علامة التبويب التطبيق من قطاع الأدوات وانقر فوق تثبيت التطبيق.
افتح برنامج تثبيت تطبيق Ploidy ML. ستظهر رسالة لتأكيد التثبيت الناجح. في كل ملف تحليل البيانات، وتشمل ورقة يطلق عليها، قياسات الخلية، التي تحتوي على جميع البيانات المطلوبة لتحليل ploidy المنصوص عليها في الأعمدة كما هو مبين.
بالنسبة لكل حالة تجريبية، قم بتوفير مجموعة بيانات تحكم سيتم استخدامها لحساب الرقابة الداخلية لمعايرة ploidy النووية من اثنين إلى أربعة N. للنسخ المتماثلة البيولوجية، قم بتخزين كل جدول بيانات في المجلد الخاص به، وتسمية بادئات المجلد بشكل متزايد. بعد ذلك، إطلاق تطبيق Ploidy.
ستظهر واجهة المستخدم الرسومية للتطبيق Ploidy. انقر فوق الزر المسار إلى التحكم البيانات للانتقال إلى المجلد الذي توجد فيه النسخ المتماثل لبيانات عنصر التحكم. ثم يظهر مسار البيانات هذا في الواجهة.
في بادئة المجلد، اكتب الاسم الذي سيتم إعطاؤه لملفات الإخراج. انقر فوق الزر مسار إلى بيانات أخرى وانتقل إلى المجلد الذي توجد فيه النسخ المتماثلة البيانات المقارنة. ثم يظهر مسار البيانات هذا في الواجهة.
ثم انقر فوق تشغيل. عند اكتمال التحليل، سيقرأ شريط المعلومات تحليل "اكتمال". بعد التميّز المناعي، من المهم التحقق من جميع الشرائح بواسطة المجهر المفلوري التقليدي للتأكد من أنه تم الحصول على تثبيت وتلطيخ جيد.
يمكن أن يشير تشويه أو طمس صبغة Hoechst إلى عدم كفاية التثبيت أو تحلل العينة قبل التثبيت. وينبغي تحسين بارامترات العزل النووي وبارامترات عتبة HNF4-alpha بعناية قبل التحليل التلقائي للصور بحيث تعكس على نطاق واسع النمط البصري للمناعة التي لوحظت عن طريق المجهر المفلور. بعد تحليل الصورة، ينبغي أن تعكس البيانات الأعداد المتزايدة من الخلايا غير البارينشية والحد الصغير، ولكن الكبير، في أرقام النوى الإيجابية HNF4-alpha داخل الكبد مع إصابة DDC.
في الكبد التحكم الصحي, ما يقرب من 63٪ من النوى الإيجابية HNF4-ألفا يحمل morphometry دائري بسيط. وينبغي أن تعكس المقارنة بين اللواطي النووية النسبية بين مجموعات التحكم ومجموعات المعالجة المعالجة من DDC خسارة كبيرة في 2C و 4C من كريات الكبد مع الإصابة مع زيادة أعداد الخلايا الأكبر من 8C. يمكن استجواب المعلومات الموضعية النسبية لكل مجموعة فرعية من ploidy عن طريق استرداد الموقع 2D من مجموعات فرعية كبدية معينة ضمن برنامج تحليل الصور عالي المحتوى.
يمكن إجراء التلقيح المناعي مع أجسام مضادة إضافية ، مثل Ki-67 ، لتقييم تكرار الخلية ويمكن استجواب بيانات القياس المورفين النووي الكبدي لمزيد من الاستجواب لتكملة التحليل ploidy. يصف ملف تعريف ploidy على نطاق الأنسجة التي تم إنشاؤها بواسطة هذه الطريقة الحد الأدنى من محتوى الحمض النووي لجميع نوات الكبد الدائرية ، ولكنه لا يميز بين الخلايا أحادية النوى والخلايا الكبدية binuclear. ويمكن أن تكون الطريقة قد تكييفها لحساب المعلمات مثل محيط الخلية، لتسهيل تحديد الخلايا الثنائية وتوفير قراءات إضافية من ploidy الخلوية.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تقدم هذه المقالة طريقة قوية ومرنة لقياس التغيرات في عدد الخلايا الكبدية والتضاعف النووي في عينات أنسجة الكبد الثابتة أو المجمدة. يوفر هذا النهج توقيعًا قويًا لعلم الخلايا الكبدية، وهو ضروري لتتبع إصابة الكبد وتقدم المرض.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلوم
- علم الأعصاب
- علم الأحياء
- أمراض الكبد
الخلفية
- التضاعف النووي لخلايا الكبد مهم لفهم تطور الكبد والأمراض.
- التغيرات في التضاعف النووي مرتبطة بالشيخوخة وأمراض الكبد المزمنة والسرطان.
- غالبًا ما تتطلب الطرق التقليدية قياس التدفق الخلوي وعينات الأنسجة الطازجة.
- تتيح هذه الطريقة دراسة التضاعف النووي دون الحاجة إلى فصل الأنسجة.
هدف الدراسة
- تطوير طريقة لدراسة محتوى الحمض النووي النووي للخلايا الكبدية في أقسام الأنسجة ثنائية الأبعاد.
- توفير نهج عالي الإنتاجية يمكن تطبيقه على مختلف عينات أنسجة الكبد.
- تسهيل تتبع تقدم أمراض الكبد في البيئات البحثية والسريرية.
الطرق المستخدمة
- تحليل تلقائي عالي الإنتاجية لأقسام أنسجة الكبد ثنائية الأبعاد.
- قراءة داخلية معايرّة للتضاعف النووي للنواة الخلوية الدائرية.
- تجميد سريع لعينات الكبد باستخدام وسط درجة حرارة القطع الأمثل.
- دراسة التضاعف النووي في الموقع دون الحاجة إلى مادة طازجة.
النتائج الرئيسية
- توفر الطريقة ملفًا موثوقًا للتضاعف النووي لخلايا الكبد.
- يمكن تطبيقها على عينات الكبد الثابتة أو المجمدة.
- تظهر إمكانية تتبع تقدم أمراض الكبد.
- تقدم وسيلة بسيطة لتقييم التغيرات في التضاعف النووي المرتبطة بحالات مختلفة.
الاستنتاجات
- تعتبر هذه الطريقة أداة قيمة للباحثين الذين يدرسون أمراض الكبد.
- تعزز القدرة على مراقبة إصابة الكبد والمرض بمرور الوقت.
- قد تمتد التطبيقات المستقبلية إلى التشخيص السريري ومراقبة العلاج.
الأسئلة المتداولة
Executive Industry Relevance
This method enables high-throughput, spatially resolved quantification of hepatocyte nuclear ploidy from fixed or cryopreserved liver tissue, supporting target validation in liver disease models. By preserving tissue architecture and avoiding disaggregation bias, it provides internally calibrated, reproducible readouts of polyploidization events linked to disease progression. The approach enhances predictive confidence in preclinical studies by linking nuclear DNA content changes to pathophysiological states without requiring fresh tissue or flow cytometry.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by correlating hepatocyte nuclear ploidy shifts with liver injury, regeneration, and disease models.
- Operational Value: Supports biological de-risking through internal calibration using control datasets, reducing variability in ploidy measurements across experiments.
- Predictive Value: Facilitates portfolio triage by identifying dose- or genotype-dependent increases in >8C hepatocyte nuclei as a biomarker of pathological polyploidization.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, imaging-based readouts of nuclear area, Hoechst intensity, elongation, roundness, and HNF4-alpha status for high-content screening applications.
- Operational Value: Enables assay standardization via optimized nuclear segmentation and threshold gating parameters, improving reproducibility across users and sites.
- Scalability: Compatible with standard high-content imaging platforms, allowing scalable analysis of numerous tissue sections without specialized equipment.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Preserves spatial information, enabling retrieval of 2D locations of specific ploidy subsets (e.g., 2C, 4C, >8C) within liver lobules for regional disease correlation.
- Preclinical Model Relevance: Detects significant loss of 2C/4C nuclei and increase in >8C cells following DDC injury, mirroring clinical observations in chronic liver disease and cancer.
- Risk-Adjusted Advancement: Provides a mechanistic readout to support go/no-go decisions by quantifying polyploidization as a feature of maladaptive repair or neoplastic transformation.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through preclinical profiling, offering a reusable platform for assessing liver cytology in disease models.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by linking changes in hepatocyte nuclear DNA content to pathway modulation in injury and cancer models.
- Screening: Delivers assay-ready, standardized outputs through automated image acquisition and segmentation, enabling reliable compound or genetic perturbation evaluation.
- Analytics: Generates ploidy profiles based on Hoechst staining and HNF4-alpha status, providing quantitative comparisons between control and treated conditions.
- Translational Research: Maintains histological context, allowing correlation of ploidy shifts with fibrosis, inflammation, or tumorigenic regions in liver sections.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized, transferable capability for ploidy profiling across multiple liver disease models and therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in hepatocyte ploidy changes during disease progression.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized fixation, staining, and imaging protocols compatible with frozen tissue archives.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making by providing early, spatially resolved biomarkers of liver pathology, reducing late-stage attrition.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on their ability to modulate pathological polyploidization in preclinical models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in immunohistochemistry, fluorescence microscopy, and high-content image analysis software.
- Dependent on access to cryostat, fluorescence microscope or high-content imaging system, and MATLAB-based ploidy quantification tool.
- Necessitates cross-team standardization of nuclear segmentation and HNF4-alpha threshold settings to ensure consistent gating across datasets.
- Adaptation considerations include adjusting parameters for non-circular nuclei or binuclear hepatocytes to improve specificity in certain models.
- Practical limitations include inability to distinguish mononuclear from binuclear hepatocytes and reliance on optimal circular morphometry for accurate ploidy estimation.
