تحليل الغلوبولين المناعي G-Glycan بواسطة اللوني السائل فائق الأداء

يتم تأسيس تقنية كروماتوغرافيا فائقة الأداء السائل لتحليل دقيق للIgG n-glycan بسبب حساسيته ويبدو أن لديه القدرة على توفير معلومات محددة من الجليكان هذه الطريقة هي سهلة الاستخدام ولها عدد من مختلف التكلفة المنخفضة نسبيا من الزيادات، وإعادة إنتاج عالية القدرة على ايزومرات الجليكان. قياسات البروتين في البلازما يمكن أن تكون جذابة. في الطب.

يرتبط أيضا مع IgG في قاعدة الجليكوز ومثل هذا والبيولوجية التي تحتوي على السكان. أنت تعرف أن من حالة نجس يستخدم لاختبار IgG في الجليكانات. في الواقع، يمكن أن اختبار ن-الجليكانات من البروتين.

وهذا مطلوب في البروتين عبر ربط اثنين من حالة نقية يمكن تطبيقها على البروتين عملية أو التجريبية بسيطة نسبيا في حين أن عملية تجريبية تحتاج إلى أن تكون موحدة. العملية التجريبية من نهاية إلى نهاية تستغرق ثلاثة أيام للعمل، والخطوات التجريبية تحتاج إلى حفظها من أجل إتقان المهارات التجريبية. لتحضير العينات، قم بإذابة عينة البلازما المجمدة.

ثم، الطرد المركزي في 80 مرة G لمدة 10 دقائق. اتركي الطبق المتجانسة من البروتين G في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. نقل 100 ميكرومتر من العينة في كل بئر من لوحة جمع مليلتر.

إضافة الماء النقي جداً كعينة تحكم واحدة. تمييع العينات مع واحد X PBS بمقدار واحد إلى سبعة حجم من حيث نسبة الحجم. تنظيف 0.45 ميكرون البولي بروبلين البولي بروبلين مرشح لوحة مع 200 ميكرولترات من المياه النقية جدا.

كرر التنظيف مرتين إضافيتين. نقل العينات المخففة في لوحة التصفية، وتصفية العينات في لوحة الجماعية باستخدام مضخة فراغ مع الضغط في 266.6 إلى 399.9 باسكال. لتحضير الألواح المتجانسة من البروتين G، تخلص أولاً من مخزن التخزين المؤقت.

تنظيف لوحات متجانسة مع ملليلتر اثنين من المياه النقية جدا، واثنين من ملليلتر من برنامج تلفزيوني X واحد، ملليلتر واحد من حمض فليكدر 0.17 المول، ملليلتر اثنين من 10 X PBS، واثنين من ملليلتر من واحد X PBS بالتسلسل. إزالة السائل التالي باستخدام مضخة فراغ. باستخدام الأنابيب متعددة القنوات، نقل العينات المصفاة إلى لوحة بروتين G متجانسة لتجليد IgG والتنظيف.

ثم، إضافة ملليلتر اثنين من برنامج تلفزيوني X واحد لتنظيف لوحات متجانسة. إزالة برنامج تلفزيوني باستخدام مضخة فراغ، وتكرار التنظيف مرتين إضافية. Illute IgG مع ملليلتر واحد من حمض فليك 0.17 المول، وتصفية العينات في لوحة جمع بواسطة مضخة فراغ.

ثم، إضافة 170 ميكرولترات من بيكربونات أمونيوم واحد الوليار في لوحة جمع. الكشف عن تركيز IgG باستخدام مقياس طيف امتصاص في الطول الموجي الأمثل من 280 نانومتر. ضع IgG المستخرجة في فرن لتجف عند 60 درجة مئوية لمدة ثلاث ساعات.

تحديد الكمية التي يجب ملاحظتها حسب تركيزها كما هو موضح في المخطوطة، والحفاظ عليها في ناقص 80 درجة مئوية. جمع IgG المجففة، وتخزين المواد الكيميائية بما في ذلك 1.33٪SDS، وأربعة في المئة IgePal و 5٪ برنامج تلفزيوني في درجة حرارة الغرفة. إعداد إنزيم F indoglycosidase عن طريق تمييع 250 وحدة من انزيم مع 250 ميكرولترات من المياه النقية جدا.

لتحريف IgG، إضافة 30 ميكرولترات من 1.33٪ SDS ومزيج من دوامة. نقل العينة إلى فرن درجة 65 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. ثم، إزالته من الفرن، ونتركه يبرد لمدة 15 دقيقة.

إضافة 10 ميكرولترات من أربعة في المئة IgePal في نفس العينة، ووضعها على حاضنة تهتز لمدة خمس دقائق. إضافة 20 ميكرولترات من خمسة X PBS و 30 إلى 35 ميكرولترات من 0.1 هيدروكسيد الصوديوم الضرس لتنظيم pH إلى 8.0، ومزيج من دوامة. إضافة أربعة ميكروليترات من إنغغليكوسيداسي F إنزيم، ومزيج من دوامة.

ثم، احتضان لمدة 18 إلى 20 ساعة في حمام مائي 37 درجة مئوية. في اليوم التالي، ضع الزيكا في فرن عند 60 درجة مئوية لتجف لمدة ساعتين ونصف إلى ثلاث ساعات. حفظ الجليكانات الإفراج في ناقص 80 درجة مئوية حتى مزيد من القياس.

إعداد اثنين من الأحماض الأمينية وضع الكواشف مع 24.5 ميكرولتردات من DMSO, 10.5 ميكرولترات من حمض الخليك, 0.7 ملليغرام من اثنين من البنزيميد الأمينية, وستة ملليغرام من الصوديوم cyanoborohydride. بعد ذلك ، في غرفة مظلمة ، تسمية الجليكان بإضافة 35 ميكروليتر من اثنين من البنزين أمينيميد وضع الكواشف. نقل glcans المسمى إلى مذبذب لمدة خمس دقائق، ومن ثم، نقله إلى الفرن لمدة ثلاث ساعات في 65 درجة مئوية.

بعد ذلك، نقله إلى درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. وIgG ن- glycase، سنقوم تسمية مع من أجل أن يتم الكشف عنها من قبل الكشف الفلورسنت من حالة نجس. قبل معالجة 0.2 ميكرون GHP لوحة مرشح مع 200 ميكرولترات من 70٪ الإيثانول، 200 ميكرولترات من المياه النقية جدا، و 200 ميكرولترات من 96٪ الاسيتو نيتريل في أربع درجات مئوية.

ثم، وإزالة النفايات باستخدام مضخة فراغ. لتنقية اثنين من البنزيمات الأمينية المسمى الجليكان، إضافة 700 ميكرولترات من 100٪ الأسيتونتريل إلى العينة، ونقله إلى حاضنة تهتز لمدة خمس دقائق. أجهزة الطرد المركزي في 134 مرة G لمدة خمس دقائق في أربع درجات مئوية.

نقل supernatent إلى 0.2 ميكرون GHP لوحة مرشح لمدة دقيقتين، وإزالة الترشيح باستخدام الفراغ. غسل اثنين من benzimide الأمينية المسمى غليزان مع 200 ميكرولترات من 96٪ الأسيتونيتريل في أربع درجات مئوية، وإزالة الترشيح باستخدام مضخة فراغ خمس إلى ست مرات. Illute اثنين من البنزيميد الأمينية المسمى الجليكان مع 100 ميكرولترات من المياه النقية جدا ثلاث مرات.

نقل اثنين من البنزيميد الأمينية المسمى غليزان في فرن لتجف في 60 درجة مئوية لمدة ثلاث ساعات ونصف الساعة. حفظ تسمية ن-الجليكانز في ناقص 80 درجة مئوية حتى مزيد من القياس. أولاً، افتح البرنامج للتحكم في مراحل الهاتف المحمول.

غسل أدوات UPLC مع 50٪ المذيب B و 50٪ مذيب C بمعدل تدفق 0.2 ملليلتر في الدقيقة لمدة 30 دقيقة. ثم، يغسل مع 25٪ المذيب A و 75٪ المذيب B بمعدل تدفق 0.2 ملليلتر في الدقيقة لمدة 20 دقيقة. ثم، إضافة معدل تدفق 0.4 ملليلتر في الدقيقة الواحدة.

قم بحل الـ n-glycans المسمى مع 25 ميكروليتر من خليط من 100٪ أسيتونتريريل والمياه النقية جداً في حجم اثنين إلى وحدة واحدة بنسبة الحجم. ثم، الطرد المركزي في 134 مرات G لمدة خمس دقائق في أربع درجات مئوية، واستخدام أنبوب جاف لتحميل 10 ميكرولترات من supernatent في أجهزة UPLC. فصل الـ n-glycans المسمى بمعدل تدفق 0.4 ملليلتر في الدقيقة مع تدرج خطي من 75٪ إلى 62٪ الأسيتونتريل لمدة 25 دقيقة.

ثم، تنفيذ تحليل تشغيل من قبل العمود glycopeptide سلم المعايرة الدهسترة على UPLC في 60 درجة مئوية. الكشف عن ن-غليكان الفلورسنتين في الاقتباس X وأطوال موجية الانبعاثات من 330 نانومتر و 420 نانومتر، على التوالي. كما هو مبين في هذا الشكل، تم تحليل IgG ن-الجليكانات في 24 ذروة غليكان IgG الأولية على أساس موقف الذروة ووقت الاحتفاظ.

تتوفر هياكل n-glycan في 24 نوعًا من خلال الكشف عن القياس الطيفي الكتلي. إلى الـ asses تكرار واستقرار الأسلوب، تم اختبار العينة القياسية في نفس الوقت ست مرات. وأظهرت قمم الجليكان بنسب صغيرة نسبيا أخطاء قياس عالية من أكثر من 10٪ من معامل الاختلاف.

في قطعة ومهمة لتشكيل إلى تأسيسها من هيكل IgG ن جليكان، وخاصة لإنشاء محطة لذلك، بدلا من 3.3 IgG ن-غليكيس وجدت في أمر بالغ الأهمية في هذا أهمية IgG. من المعروف أن الجليكانات من أن تكون مختلفة. مع التطورات في الكولين بروتوميك، جنبا إلى جنب في الجليكان لاستكشاف المعلومات إلى هذا بحيث يمكن استخدامه كإمكانية لتشخيص اليوم.

بعد تطوير هذه التقنية، فإنه يوفر طريقة جديدة لاستكشاف