وصف مجاميع البروتين الفردية عن طريق الفحص النانوي بالأشعة تحت الحمراء والفحص المجهري للقوة الذرية

الأساليب القائمة على المجهرية القوة الذرية تجعل من الممكن لتوصيف العمليات الجزيئية الحيوية على نطاق نانو مع الكيميائية المورفولوجية أو القرار الهيكلي، وفتح أخيرا نافذة أمامية جديدة للمراقبة على علم الأحياء. تمكن طرق الجزيء المفرد من البحث عن أنظمة غير متجانسة للغاية ، وهي ميزة ذات صلة خاصة بفهم تجميع البروتين. من خلال الجمع بين جزيئات واحدة مع النهج الظهر، يمكننا الحصول على معلومات أساسية حول سلوك البروتينات، وصلاتها مع الأمراض البشرية وتصميم التدخلات الدوائية التي يمكن أن تكون ناجحة.

وعلاوة على ذلك، يمكن تطبيق هذه الطريقة بنجاح لدراسة الخصائص الكيميائية والهيكلية للمواد الأحيائية لأغراض توصيل المخدرات، والتطبيقات، وغيرها من الأغراض التكنولوجية الحيوية. قد يكون من الصعب في البداية لتعيين المعلمات AFM الصحيح لدقة عالية وأنه من السهل إعداد AFM الخاص بك في حين قياس المجاميع الخاص بك الفبريل. قبل 30 دقيقة من التصوير AFM، قم بتشغيل نظام AFM وانقر فوق الإعداد والمسبار.

في إطار تغيير التحقيق، انقر فوق التالي لإعداد مرحلة التركيز Z. إيقاف تشغيل مفتاح شعاع AFM إذا كان على وفتح أقفال dovetail. قطع الرأس من النظام وفي إطار التغيير التحقيق، انقر فوق التالي.

جبل AFM cantilever على حامل التحقيق. توصيل الرأس إلى النظام وقفل الأقفال التيلات. بدوره على مفتاح شعاع الليزر AFM وفي نافذة تغيير التحقيق، انقر فوق التالي.

في النافذة المنبثقة، انقر فوق لا إذا لم يتغير نوع cantilever وضبط المقابض المحاذاة البصرية للعثور على cantilever. ضبط التركيز على cantilever وانقر فوق المقبل. في النافذة المنبثقة، انقر فوق نعم إذا كان التركيز على الـ cantilever.

استخدام مقابض شعاع الليزر الكشف عن الموقع شعاع الليزر في نهاية cantilever. استخدام المقابض شعاع الليزر منحرفة لتحقيق أقصى قدر من إشارة مجموع تقاس بواسطة رباعي الصمام الثنائي الصورة أربعة إلى ما لا يقل عن أكثر من فولت واحد. في نافذة تغيير التحقيق، انقر فوق التالي ثم أغلق.

بعد انتظار 15 دقيقة ل cantilever للوصول إلى الاستقرار الحراري، وإعادة ضبط موقف شعاع الليزر منحرفة على الصمام الثنائي الصورة الحساسة الموقف إذا لزم الأمر. انقر فوق NCM الاجتياح، حدد السعة المطلوبة من التذبذب، انقر فوق مرحلة الاستخدام وانقر فوق السيارات. لحن cantilever قريبة من الحد الأقصى من الرنين الأول الحر للتذبذب إلى ما يقرب من 300 كيلو هرتز ل cantilever مع ثابت الربيع من 40 نيوتن لكل متر.

ضع العينة على حامل العينة. انقر فوق منطقة المسح الضوئي وتعيين الدقة إلى ما بين 256 في 256 و 1024 من قبل 1024 بكسل ثم قم بتعيين حجم المسح الضوئي ورقم بكسل. تعيين معدل المسح الضوئي إلى 0.3 إلى هرتز واحد لمنطقة مسح واحد تلو واحد إلى خمسة في خمسة ميكرومتر مربع.

التركيز على عرض بصري على عينة وانقر على نهج لنهج عينة. بعد ذلك، انقر فوق رفع 100 ميكرومتر لرفع طرف AFM 100 ميكرومتر فوق سطح العينة وانقر فوق توسيع الصورة البصرية للعينة. انقر فوق شريط المرحلة التركيز لتركيز العرض على سطح العينة واستخدام الأسهم للتحرك في المنطقة من عينة من الفائدة.

انقر على النهج لإشراك سطح وانقر فوق خط المسح الضوئي لمعرفة ما إذا كان الطرف هو متابعة السطح جيدا. اضبط نقطة الضبط حسب الضرورة. ثم انقر فوق المسح الضوئي لبدء تصوير سطح العينة، مع الحفاظ على نظام ثابت من تغيير المرحلة لا يتجاوز دلتا 20 أثناء التصوير لتجنب قوة تصوير كبيرة والحفاظ على الاتساق بين العينات المستقلة.

بالنسبة للتصوير الضوئي النانوي بالأشعة تحت الحمراء، قبل 30 إلى 60 دقيقة من التحليل، قم بتشغيل نظام AFM IR وأشعة الليزر IR. فتح بنيت في البرنامج للسيطرة على الصك وانقر فوق ملف وجديدة لفتح ملف جديد نانو IR. انقر على تهيئة لبدء نظام AFM IR وفتح غطاء الصك.

جبل مسبار سيليكون مطلي بالذهب مع دائرة نصف قطرها الاسمية من 30 نانومتر وثابت الربيع من 0.2 نيوتن لكل متر على نظام الأشعة تحت الحمراء AFM لقياس العينة في وضع الاتصال. انقر فوق تحميل في القسم مسبار AFM والقادم. استخدام التركيز على السهام التحقيق لتركيز الكاميرا على cantilever واستخدام تلميح لتقاطع لوضع مرمى في نهاية cantilever.

تدوير المقابض السيطرة على موقف ليزر الكشف عن موقع الليزر في نهاية cantilever. تدوير المقابض الليزر للكشف عن وتعظيم المبلغ الذي يقاس بواسطة رباعي الصمام الثنائي الصورة إلى قيمة أكبر من ثلاثة فولت. تدوير مقبض انحراف لضبط انحراف cantilever إلى ناقص فولت واحد وانقر فوق التالي.

ثم أغلق غطاء الصك. استخدام التركيز على السهام التحقيق لتركيز الكاميرا على العينة وتلميح لتقاطع السهام للتحرك في المنطقة ذات الاهتمام من العينة. انقر فوق التالي والمشاركة.

في نافذة المجهر، حدد الارتفاع للمورفولوجيا، السعة اثنين لامتصاص الأشعة تحت الحمراء وتردد PLL لرسم خريطة غيض لعينة الرنين الاتصال. في قسم الفحص AFM، قم بتعيين المعلمات كما هو موضح للتصوير AFM وانقر على المسح الضوئي للحصول على خريطة مورفولوجيا. عند الانتهاء من رسم مورفولوجيا، في نافذة المجهر، انقر فوق مخطط الارتفاع لوضع المسبار في أعلى تجميع واحد.

في قسم نانو IR، انقر فوق بدء IR لإلقاء الضوء على العينة باستخدام الليزر IR. لتركيز الليزر تحت الحمراء على كانتليفر، انقر فوق تحسين وأدخل 1655 سنتيمترًا للرقم الموجي. انقر فوق إضافة والمسح الضوئي لتحديد موضع الليزر الأشعة تحت الحمراء وانقر فوق التحديث واتفقنا لمحاذاة موقفها مع cantilever.

في المقطع عام، أدخل عدد الموجة الذي يتوقع امتصاص عالية في الحقل النسبي وإلغاء تنشيط خيار عامل تصفية تمرير الشريط. انقر فوق بدء IR ثم تحقق من قراءة العداد و FFT من استجابة cantilever. في إطار FFT، قم بتحريك المؤشر الأخضر لقراءة تردد الرنين لـ cantilever.

وهناك قيمة نموذجية من FFT من صدى cantilevers حوالي 200 كيلوهيرتز. أدخل قيمة تردد الرنين المولدة في القسم العام في حقل مركز التردد واستخدم نافذة تردد 50 كيلوهيرتز. انقر فوق الليزر نبض نافذة لحن لتحديد وضع الرنين المعزز وتعيين معدل نبض 222 كيلوهيرتز، ومجموعة لحن من 50 كيلو هرتز ودورة عمل ليزر من 5٪ انقر الحصول على لاكتساح معدل النبض من الليزر.

استخدام المؤشر لضبط نبض الليزر إلى تردد الاستجابة الميكانيكية للتمدد الحراري للعينة امتصاص ضوء الأشعة تحت الحمراء. ثم حدد المرحلة تأمين حلقة لمراقبة صدى الاتصال بين العينة والتلميح وانقر فوق صفر. بالنسبة للخصائص الكيميائية الأخرى على مقياس النانو، تتبع رنين الاتصال أثناء اكتساب الأطياف لضمان عدم تأثر طيف العينة بالانهاك والتليين.

حدد تمكين لتتبع العينة لتلميح صدى الاتصال وحدد مكسباً لا يتجزأ من 0.5 ومكسب نسبي من 10 ثم انقر فوق موافق. في نافذة تحسين، انقر فوق الطول الموجي والمسح لتحديد موقع ليزر الأشعة تحت الحمراء لثلاثة ترقيم الموجي على الأقل المقابلة لنطاقات الامتصاص الرئيسية للعينة ولرقم موجي واحد على الأقل لكل رقاقة من الليزر. انقر فوق أدوات ، معايرة الخلفية الأشعة تحت الحمراء والجديدة ، وتعيين عدد الموجة إلى ما بين 1200 و 1800 سنتيمتر. تعيين الخلفيات إلى متوسط إلى واحد، ودورة العمل من 5٪، وسرعة الاجتياح إلى 100 سم مربع.

انقر فوق الحصول على لقياس خلفية الليزر الأشعة تحت الحمراء لتطبيع الأطياف موضعية مقياس النانو قياس، حفظ الملف وإغلاق النافذة. في إعدادات أطياف الأشعة تحت الحمراء، حدد دقة طيف الأشعة تحت الحمراء بين سنتيمتر وأربعة سنتيمترات وعدد من المتوسطات المشتركة التي لا تقل عن 64 مرة. ثم انقر فوق الحصول على لقياس نانو مقياس نطاق IR المترجمة في نطاق البروتين.

للحصول على خريطة كيميائية تم حلها بمقياس نانو، حدد 1655 سنتيمترًا والتصوير بالأشعة تحت الحمراء وانقر على المسح الضوئي في نافذة المسح الضوئي AFM. عند اكتمال التعيين، قم بحفظ القياسات. ثم استخدام بنيت في برنامج معالجة الصور AFM لتحليل الخرائط المكتسبة من مورفولوجيا، الرنين الاتصال والكيمياء والأطياف المترجمة مقياس نانو.

وهي خطوة حاسمة للحصول على حل أحادية خالصة للغاية حيث أن وجود الأنواع المجمعة قد يؤدي إلى سوء استنساخ الحركية وإدخال القطع الأثرية في القياسات الخاصة بك. ومن العوامل الأساسية لنجاح دراسة العينات البيولوجية التي لديها تباين عال هو وضع الركائز الصلبة الصحيحة. يمكن استغلال ترسب رذاذ microfluidic بدلا من واحد يدوي من أجل الحفاظ على بنية العينة وعدم تجانس.

تمهد هذه الطرق الطريق لكشف البنية الكيميائية وخصائص الجزيئات الحيوية الفردية وتفاعلاتها في البيئة السائلة الفسيولوجية والأصلية.