مؤشرات سينابس واحدة من الإفراج عن الغلوتامات والابوجدافي في شرائح الدماغ الحادة من الفئران العادية وهنتنغتون

التصوير عالي الدقة من نقاط الاشتباك العصبي واحد التعبير عن جهاز استشعار الغلوتامات سريع يسمح للكشف عن عدم التطابق المحلي بين إطلاق المرسل والإقبال. في حالة المرض ، يمكن استخدام هذه الطريقة لتحديد نقاط الاشتباك العصبي المختلة. لتصحيح autofluorescence ، أولا ، ضع شريحة الدماغ من فأر الفائدة في غرفة التسجيل من مجهر فوتون واحد.

غمر الشريحة في السائل النخاعي الأوكسيجيني الاصطناعي واستخدام هدف غمر الماء 20x لتحديد موقع المخطط الظهري. إصلاح الشرائح مع شبكة النايلون على القيثارة البلاتين للحد من حركة الأنسجة، والتبديل إلى الهدف 63x المياه الغمر. باستخدام مرشح تمريرة عالية في 510 نانومتر، والحصول على صورة من الهياكل الإيجابية استشعار الفلورسنت والغلوتامات معا.

باستخدام مرشح تمريرة عالية في 600 نانومتر، والحصول على صورة ثانية من هياكل autofluorescent وحدها. لتحديد النطاق، استخدم الشدات الوسطية لـ 10 بكسلات ألمع و10 أحلك بكسلات لتوسيع نطاق الصور الحمراء والصفراء. ثم قم بإجراء طرح الصورة الصفراء ناقص أحمر ثم إعادة قياس الصورة المطروحة لإنشاء ملف TIFF 8 بت القياسية لتصور مناسب من bouton من الفائدة.

لإجراء البحث عن ألواح الاستجابة، تحتاج إلى ميكروبليت زجاجي مناسب للتحفيز الكهربائي. استخدام جرة ميكروبيبيت لإنتاج ماصات التحفيز من الشعيرات الدموية الزجاج بوروزيليكات مع أطراف تلميح الداخلية من حوالي ميكرومتر واحد. للتحقيق في العمل الإفراج التبعي المحتملة للغلوتامات من مجموعة من المرشحة boutons، حدد التكبير 63x ومرشح انبعاث نانومتر 510.

قم بتحميل الصورة المطروحة للسماح بوضع قطب تحفيز الزجاج بجوار دوالي فلوري، وتجنب القرب من محاور إضافية. في ما varicosities المرتبطة بتشعب الحد الأقصى أو التخصيص داخل جزء أعمق من الشريحة. وضع القطب التحفيز بالقرب من بوتون من الفائدة وإيقاف الضوء، كما يجب أن يتم تنفيذ التسجيلات في الظلام الظام.

ثم, تشغيل نظام تطبيق الحمام متعدد القنوات, مع قناة واحدة تقديم حل الحمام القياسية والقنوات الأخرى تقديم حاصرات اللازمة من القنوات أيون, الناقلين, أو مستقبلات الغشاء, بما في ذلك tetrototoxin لمنع توليد العمل المحتملة. التحكم في تدفق في موقع تسجيل وتشغيل محفز لتقديم البقول الحالية depolarizing من اثنين إلى 10 ميكرومبير إلى ماصة التحفيز. يتم تنشيط الإصدار الآن عن طريق تدفق الكالسيوم المباشر من خلال القنوات المسور الجهد.

لتصور الافراج عن الغلوتامات في إزالة، وذلك باستخدام المجهر X، محركات Y، وضع اختبار الغلوتامات استشعار إيجابية بوتون على مقربة من مركز viewfield. بعد إيقاف عملية الاستحواذ، انقر على الصورة مع زر الماوس الأيسر لتحديد X، موقف Y من مركز بوتون يستريح. سيتم عرض إحداثيات X و Y للمؤشر المجموعة.

باستخدام بيانات المعايرة، حساب إحداثيات الموقع حيث يجب إرسال شعاع الليزر لإثارة الفلورس الاستشعار الغلوتامات باستخدام الصيغ على النحو المشار إليه. لإنشاء تسلسل نقطة واحدة في برنامج التحكم بالليزر، حدد نقطة في مربع الإضافة إلى التسلسل في صفحة تسلسل برامج التحكم بالليزر وقم بتعيين التأخير في التشغيل واللتشغيل إلى الصفر، والتسلسل لتشغيله في TLL. ثم انقر فوق تسلسل البدء.

في برنامج التحكم بالكاميرا، حدد معلمات التصوير المناسبة وحدد بدء التشغيل الخارجي لوضع المشغل. انقر فوق أخذ إشارة في برنامج التحكم في الكاميرا. ثم، الشروع في البروتوكول التجريبي المنصوص عليها لجهاز الزناد، وتنفيذ تجربة بروتوكول التجريبية مع الجدول الزمني المناسب، بحيث الكاميرا سوف تحصل على 400 إطار مع تردد 2.48 كيلوهرتز خلال تجربة واحدة، مع 0.1 هرتز أو انخفاض تردد التكرار.

لتحديد نقاط الاشتباك العصبي المرضية، قم بتشغيل إجراءات الارتفاع وحساب شدة الفلورسينت، المتوسط والانحراف المعياري للمنطقة المختارة ذات الاهتمام عند الراحة. تحديد ومربع المنطقة التي تشغلها بكسل مع كثافة الفلوريس في بقية أكبر من المتوسط زائد ثلاثة انحرافات معيارية، وتحديد القطر الظاهري في ميكرون على افتراض شكل دائري من المنطقة عتبة فوق. رسم كثافة fluorescence ضد الزمن، والفرق بين قيمة كثافة الفلوريسين الفعلية وقيمة كثافة الفلوريسين في بقية مقسومة على قيمة كثافة الفلوريسين في بقية.

تحديد ذروة اتساع استجابة الفلوريسنس. تنفيذ تركيب أحادية الاضاءة لاضمحلال من ذروة الاستجابة fluorescence، وتحديد ثابت الوقت من الاضمحلال، TauD. لتقدير السعة القصوى في المشبك معين، حدد بكسل مع أعلى تغيير في كثافة الفلور، والذي هو أفضل مؤشر من تحميل الغلوتامات المقدمة إلى آلات إزالة المشبك.

يمكن استخدام التصوير المشبكى الواحد لتحديد فئتين من نقاط الاشتباك العصبي الكورتيكوستريا باستخدام معايير الحجم ونسبة النبض المقترنة. على فترات التحفيز من 20 إلى 50 مللي ثانية، تكون المحطات الطرفية الصغيرة بين الأطراف عرضة لاكتئاب النبض المقترن، في حين أظهرت محطات القناة الهرمية الأكبر تسهيلات نبض مقترنة. الاختبارات على السلوك الحركي التي أجريت على الفئران والفئران من النوع البري التي تعبر عن نمط ظاهري هنتنغتون ، تكشف عن وجود تشوهات إيجابية كبيرة بين النتائج التي تم الحصول عليها للمسير الكلي الذي يتم تشغيله في الحقل المفتوح ، والخطوة على الكمون.

وعلاوة على ذلك، يظهر تصوير الغلوتامات المشبك واحد أن أعراض هنتنغتون الفئران أظهرت عجزا في سرعة تسوس الغلوتامات juxtasynpatic كما ينعكس في قيم تاود من الردود الغلوتامات لتحفيز المشبك واحد. في الحيوانات من النوع البري ، لوحظ هذا الإطالة فقط بعد تطبيق مثبط انتقائي وغير قابل للنقل من امتصاص الغلوتامات. تقييم احتمال حدوث قيمة تاود معينة في شرائح من الفئران من النوع البري، والفئران التي تعبر عن أعراض مرض هنتنغتون، وكشف أنه في الحيوانات البرية من النوع، TauD لا يتجاوز أبدا 15 مللي ثانية.

في مرض هنتنغتون أعراض ومع ذلك، 40٪ من نقاط الاشتباك العصبي يحمل قيم تاود بين 16 و 58 مللي ثانية، على الرغم من وجود ميل للحد من كمية الغلوتامات صدر. لذلك، قد ينظر إلى تاود على أنه علامة بيولوجية لعلامات الاشتباك العصبي المختلة في مرض هنتنغتون، ويمكن استخدامها كذلك للتحقق من الانتعاش الوظيفي في التجارب التي تستهدف نقل الغلوتامات الفلكية. قد يساعد هذا البروتوكول لرصد الغلوتامات في نقاط الاشتباك العصبي الكورتيكوسترياال الفردية في توضيح دور نقص امتصاص الغلوتامات في التسبب في مرض التنكس العصبي.

التصوير المشبك واحد مفيد بشكل خاص لاستكشاف مواقع ما قبل السينوائية من نقاط الاشتباك العصبي مثير.