وضع العلامات المناعية للفخاخ خارج الخلية البشرية ومورين العدلات في الأنسجة البارافين جزءا لا يتجزأ
September 10th, 2019
الفخاخ خارج الخلية العدلات (NETs) هي هياكل ثلاثية الأبعاد ولدت من قبل المحببات العدلات حفز. وقد أصبح من الواضح في السنوات الأخيرة أن الـ NETs تشارك في مجموعة واسعة من الأمراض. وقد يكون للكشف عن الـ NETs في الأنسجة أهمية تشخيصية، ولذلك يلزم وضع بروتوكولات موحدة لوضع العلامات على مكونات الشبكة.
اليوم نود أن تظهر لك المتغيرات من بروتوكول استرجاع المستضد الناجم عن الحرارة المشتركة. فهو يجمع بين فوائد انخفاض درجة الحرارة لمستضد العدلات و القيمة العليا للدرجة العليا المطلوبة للهستونات. هذه التقنية تسمح لدراسة NETs، الفخاخ العدلات خارج الخلية، في أنسجة البارافين سواء من الماوس أو الرجال.
كما أنه يعتبر لدراسة المواد المحفوظة أو الدراسة الاستعادية. أولاً، ضع الشرائح المعدة في رفوف وغمرها في الوسائط المستخدمة للجفاف والمقاصة بترتيب عكسي لمدة خمس دقائق لكل منها. بعد ذلك، سخني حمام مائي مع صفيحة ساخنة يتم التحكم فيها بدرجة حرارة إلى 70 درجة مئوية.
وضع جرة مليئة الحرارة الناجمة عن عازلة استرجاع epitope و 10٪ الجلسرين في حمام الماء. عندما يصل المخزن المؤقت إلى 70 درجة مئوية، ضع الحامل مع الشرائح في جرة العازلة. احتضان الشرائح في 70 درجة مئوية لمدة 120 دقيقة.
بعد ذلك، إزالة جرة من حمام الماء، والسماح لها تبرد إلى درجة حرارة الغرفة. شطف المقاطع المبردة ثلاث مرات مع الماء المتأين ومرة واحدة مع TBS. باستخدام ورق تصفية تدحرجت أو مسحة القطن، وإزالة بعناية أي سائل بين الأقسام على الشرائح، مع التأكد من ترك المقاطع رطبة.
ثم، استخدم قلم حاجز مُزَمّم لإنشاء حاجز حول كل قسم. احتضان القسم في منع العازلة في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة لمنع الربط غير محدد. تمييع الأجسام المضادة الأساسية في سد العازلة بتركيز واحد ميكروغرام لكل ملليلتر.
قم بإزالة المخزن المؤقت للحجب من الشرائح، وأضف الأجسام المضادة الأولية المخففة، مع التأكد من استخدام وحدة تخزين كافية لمنع التجفيف. أغلق الحاوية الرطبة، وحضنها بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة. في اليوم التالي، اغسل الأقسام ثلاث مرات بـ TBS مع كل غسل يدوم خمس دقائق.
إعداد حل عمل من الأجسام المضادة الثانوية في العازلة حظر. تغطية أقسام الأنسجة مع حل الأجسام المضادة الثانوية، ونقل الشرائح إلى وعاء رطبة. ختم الحاوية الرطبة، واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة.
بعد ذلك، قم بغسل الأقسام ثلاث مرات باستخدام TBS وممر واحد في الماء مع كل غسل يدوم خمس دقائق. تغطية المقاطع غسلها مع المتوسطة المتصاعدة، وتطبيق الزجاج غطاء مع تجنب تشكيل فقاعة. بعد أن تتوطد الوسيلة المتصاعدة ، استخدم مجهرًا confocal أو مجهرًا واسع النطاق مع مرشحات تمرير النطاق المناسبة لتحليل الفلوروسة المناعية.
لرقمنة المقاطع كاملة باستخدام ماسح الشرائح، تعيين كثافة الفلوريسينس باستخدام عناصر التحكم السلبية والإيجابية. باستخدام تلطيخ العدلات elastase، والعثور على المناطق الغنية العدلات والتكبير في تلك المناطق للتحقق مما إذا كانت إشارة العدلات elastase هي الحبيبية أو خارج الخلية. إذا كانت الإشارة خارج الخلية وتداخلت مع كل من تلطيخ الحجر والحمض النووي، تم الحصول على الفخاخ العدلية خارج الخلية.
في هذه الدراسة، يتم الكشف عن مكونات NET بنجاح في الأنسجة المضمنة البارافين، سواء من أصل الإنسان والمورين. إذا كان سمك أقسام الأنسجة يتراوح بين اثنين إلى ثلاثة ميكرومتر، يمكن تحليلها عن طريق المجهر واسع المجال باستخدام أهداف 10x أو 20x. لتقييم تلطيخ بشكل صحيح، تمت معالجة كل من العينات السلبية والإيجابية.
يظهر قسم تمثيلي من أنسجة التهاب الزائدة الدودية البشري الأنسجة الملطخة لNE، H2B، وهويشت 33342. الصور على اليسار هي من منطقة من القسم تحتوي على NETs، في حين أن الصور على اليمين هي من منطقة مختلفة من نفس القسم الذي يحتوي على العديد من العدلات ولكن لا NETs. المناطق مع تشكيل صافي ضخمة يمكن بسهولة يمكن العثور عليها حتى في التكبير منخفضة منذ جميع مكونات NET الثلاثة في كثير من الأحيان في هياكل خارج الخلية.
يظهر هذا في تراكب القنوات الثلاث كألياف بيضاء خارج الخلية يمكن قياسها كمياً باستخدام برنامج تحليل الصور لإنشاء تراكب أرجواني باستخدام وحدات بكسل من إشارات متداخلة تكون إيجابية للخضرة والأحمر والأزرق. للحصول على دقة أعلى ، يجب استخدام المجاهر confocal أو المجاهر واسعة المجال مع deconvolution لتقليل الضبابية خارج التركيز. إسقاط الحد الأقصى من كومة confocal من منطقة غنية صافي من نفس العينة التهاب الزائدة الدودية الإنسان يظهر أن NE وجدت في حبيبات ولكن أيضا وفيرة خارج الخلية حيث أنه يتقن مع H2B ومع الحمض النووي.
ينتج عن التكلس خارج الخلية مزيج من الألوان الأبيض. يمكن مرة أخرى أن تستخدم بكسل إيجابية للخضراء والأحمر والأزرق لإنشاء تراكب أرجواني تقديم NETs. وهناك تفاصيل تمثيلية لقسم مركزي من رئة فأرة مصابة بالسل الميكوبتريا يقدم مثالا آخر على التكلس الكولوكافي لجميع مكونات الشبكة الثلاثة التي تكون مرئية بوضوح كمساحات بيضاء بين العدلات التي يمكن استخدامها لإنشاء طبقة أرجوانية تشير إلى NETs.
أثناء إجراء التلطيخ، يجب أن لا تقع المقاطع الجافة لأن هذا سوف يسبب تلطيخ كاذبة إيجابية أو خلفية عالية. وقد يساعد تحليل المواد المحفوظة في فهم أثر تكنولوجيات المعلومات والاتصالات في الأمراض. لأن أنسجة البارافين يمكن أن يكون لها خلفية ضخمة، من المهم أن يكون لها سيطرة إيجابية وسلبية التي يمكنك التمييز بين تلطيخ الخاص بك والخلفية.
وينبغي إجراء الديواكسينغ والجفاف تحت غطاء أبخرة. تأكد من ارتداء القفازات ومعطف المختبر الخاص بك.
نظرة عامة
تناقش هذه المقالة اكتشاف مصائد العدلات خارج الخلوية (NETs) في الأنسجة المثبتة بالبارافين باستخدام بروتوكول لاسترجاع المستضد المحدث بالحرارة. يسلط الدراسة الضوء على أهمية الطرق المعيارية لتحديد NETs، والتي ترتبط بأمراض مختلفة.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- علم المناعة
- علم الأنسجة
الخلفية
- مصائد العدلات خارج الخلوية (NETs) هي هياكل تشكلها العدلات.
- تلعب NETs دورًا في مجموعة متنوعة من الأمراض.
- البروتوكولات المعيارية لكشف NETs ضرورية للأغراض التشخيصية.
- استرجاع المستضد المحدث بالحرارة هو تقنية تُستخدم لدراسة NETs في الأنسجة.
غرض الدراسة
- لإظهار بروتوكول لكشف NETs في الأنسجة المثبتة بالبارافين.
- لتوفير طريقة يمكن تطبيقها على كل من الأنسجة البشرية والفأرية.
- لتسهيل تحليل المواد المؤرشفة للدراسات الرجعية.
الطرق المستخدمة
- استرجاع الإبي توب المحدث بالحرارة عند 70 درجة مئوية.
- تحضين المخزنة لمنع الارتباط غير المحدد.
- استخدام الأجسام المضادة الأولية والثانوية لفحص المناعة الفلوري.
- التحليل المجهري لاكتشاف وتحديد NETs.
النتائج الرئيسية
- تم اكتشاف مكونات NET بنجاح في كل من الأنسجة البشرية والفأرية.
- تمت ملاحظة تواجد الإيلاستين العدلاتي، والهستونات، والحمض النووي بشكل متزامن.
- كانت NETs قابلة للتعرف كألياف خارج خلوية بيضاء في صور الميكروسكوب.
- كانت الضوابط الإيجابية والسلبية ضرورية لتقييم دقيق.
الاستنتاجات
- توفر الدراسة طريقة موثوقة لاكتشاف NETs في الأنسجة المؤرشفة.
- قد يوفر فهم NETs رؤى حول دورها في الأمراض.
- البروتوكولات المعيارية ضرورية للحصول على نتائج متسقة في أبحاث NET.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Reliable detection of neutrophil extracellular traps (NETs) in paraffin-embedded tissue enables mechanistic de-risking and target validation in inflammation and immune-mediated disease models. Standardized immunofluorescence protocols support predictive confidence for translational research and retrospective analysis of archived clinical specimens. This capability strengthens portfolio decisions by clarifying NET involvement in disease pathology and therapeutic response.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of NET-driven mechanisms in disease-relevant tissue contexts.
- Supports functional target validation by confirming NET presence and localization.
- Facilitates mechanistic de-risking for immune-modulating therapeutic hypotheses.
Screening & Assay Development
- Prepares validated tissue systems for downstream quantitative immunofluorescence analysis.
- Standardizes detection of NET components using reproducible antibody-based workflows.
- Enables robust comparison of NET formation across experimental and control conditions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns NET detection with disease-relevant biomarkers in human and murine models.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation using archived or prospective samples.
- Informs risk-adjusted advancement by quantifying NET burden in pathological tissues.
Pipeline & Workflow Integration
This immunofluorescence protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum, enabling retrospective and prospective analysis of NETs in paraffin-embedded tissues.
- Discovery Biology: Provides quantitative evidence for NET involvement in disease mechanisms.
- Screening: Delivers reproducible, multiplexed readouts for NET component colocalization.
- Analytics: Supports image-based quantification and statistical comparison of NET-positive areas.
- Translational Research: Bridges preclinical and clinical research by enabling analysis of archived human and animal tissues.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized workflow applicable across multiple disease models and tissue archives.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in immune pathology studies.
- Operational Value: Delivers standardized, scalable, and reproducible immunofluorescence workflows for NET detection.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital allocation by clarifying NET-driven disease mechanisms.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of immune-modulating assets based on tissue-level NET analysis.
Implementation Considerations
- Requires expertise in immunofluorescence microscopy and antibody validation.
- Needs access to confocal or wide-field microscopy with appropriate filters and image analysis software.
- Demands rigorous use of positive and negative controls to ensure specificity and reproducibility.
- Must adapt protocol parameters for different tissue types and archived sample conditions.
- Careful hydration and handling are critical to avoid false positives and high background signals.
