عزل الكريات البيض عن حليب الثدي البشري للاستخدام في فحص الفيغوسية الخلوية المعتمدة على الأجسام المضادة لأهداف فيروس نقص المناعة البشرية

لقد طورنا طريقة صارمة لعزل الخلايا من حليب الثدي البشري لدراسة البلعة الخلوية المعتمدة على الأجسام المضادة ، أو ADCP ، عن طريق برامعات حليب الثدي ضد أهداف فيروس نقص المناعة البشرية. هذه التقنية تسهل عزل خلايا حليب الأم بسرعة وسهولة نسبيا لتقييم قدرة السكان الكريات البيض على أداء ADCP. إثبات الإجراء سيكون أليسا فوكس، فني من مختبري.

بعد اختيار مستضد الهدف ذات الصلة، واستخدام مجموعة تجارية لبيوتينيل البروتين من الفائدة وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. و تودع العينة الحيوية في الغرفة العليا لعمود الدوران. أضف برنامج PBS ما يصل إلى 400 ميكروليتر وسقف الغرفة قبل إدخال العمود في أنبوب جمع للطرد المركزي.

بعد التخلص من تدفق من خلال، إضافة برنامج تلفزيوني إلى 400 ميكرولترات للطرد المركزي الثاني. تجاهل التدفق من خلال، إضافة برنامج تلفزيوني إلى 400 ميكرولترات، وقياس تركيز البروتين بواسطة مقياس الطيفي لتقارن البروتين الحيوي إلى ميكرومتر microspheres. احتضان ستة ميكروغرام من البروتين مع 12 ميكرولتر من الخرز الأسهم في 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني لكل لوحة من الخرز مترافق في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين، مع دوامة لطيف كل 20 دقيقة.

في نهاية الحضانة، بيليه الخرز البروتين مترافق بواسطة الطرد المركزي والتخلص من اجور. بعد دوامة لطيف، resuspend البروتين في 1200 ميكرولترات من 0.1٪ BSA في برنامج تلفزيوني، وغسل الأنبوب عن طريق الطرد المركزي مرتين أكثر كما هو موضح للتو. بعد الغسيل الأخير، resuspend بيليه في 1200 microliters في برنامج تلفزيوني بالإضافة إلى BSA.

لإعداد لوحات ADCP فحص، أولا إعداد 12 المخففات ميكرولتر من الأجسام المضادة، أو المصل المناعي من الفائدة، في 2٪ BSA في برنامج تلفزيوني في أسفل جولة 96 لوحة جيدا. إضافة 10 ميكرولترات من البروتين الخرز مترافق في بئر إلى لوحة لمدة ساعتين حضانة في 37 درجة مئوية. في نهاية الحضانة ، إضافة 200 microliters من برنامج تلفزيوني زائد BSA.

بعد الحصول على حليب الثدي البشري من النساء المرضعات صحية التعبير عن استخدام مضخة، في غضون أربع ساعات من التعبير فصل محتويات الحليب عن طريق الطرد المركزي وتصب بعناية قبالة الحليب الخالي من الدسم والدهون، وترك بيليه الخلية دون عائق. امسح داخل الأنبوب بمسح خال من الوبر لإزالة جميع الدهون من جدار الأنبوب وإضافة 10 ملليلترات من PBS بالإضافة إلى HSA. Resuspend بيليه مع الأنابيب لطيف لتجنب تنشيط الخلية في موت الخلايا، ونقل تعليق الخلية إلى أنبوب 15 ملليلتر للطرد المركزي.

بعد غسل الثانية في برنامج تلفزيوني بالإضافة إلى HSA كما أظهرت للتو، resuspend بلطف الخلايا في 1-2 ملليلتر من برنامج تلفزيوني جديد بالإضافة إلى HSA للعد. لADCP الفحص، عكس بسرعة لوحة ADCP أعدت لdedeantant supernatant بعد الطرد المركزي النهائي وإضافة خمس مرات 10 في خلايا حليب الثدي المعزولة حديثا الرابعة في 200 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني زائد BSA لمدة ساعتين حضانة في 37 درجة مئوية. في نهاية الحضانة، الطرد المركزي الخلايا وغسل الكريات مرتين في 200 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني جديد كما هو موضح.

بعد الغسيل الأخير، وصمة عار الخلايا مع 0.5 ميكروغرام لكل ملليلتر من وصمة عار قابلة للإصلاح 450 في البئر في 50 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، وحمايتها من الضوء. في نهاية الحضانة، بيليه الخلايا لاثنين من يغسل في برنامج تلفزيوني جديد كما هو موضح، وصمة عار الخلايا لعلامات الكريات البيض من الفائدة لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، محمية من الضوء. في نهاية الحضانة، وجمع الطرد المركزي الخلايا، وغسل الخلايا مرتين في 200 ميكرولترات من 1٪ BSA زائد برنامج تلفزيوني لكل غسل.

بعد الغسيل الأخير، قم بإصلاح الكريات في 200 ميكرولترات بنسبة 0.5٪ الفورمالديهايد لكل بئر لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، محمية من الضوء. لتحليل تدفق الخلايا عينات الخلية، تعيين تدفق مقياس الخلايا مجهزة قارئ لوحة عالية الإنتاجية لسحب 175 ميكرولترات من العينة وجمع 5000 خلية في بئر. تنفيذ الغواينغ الأولي للقضاء على doublets والحطام على مبعثر إلى الأمام مقابل الجانب مبعثر مؤامرة.

استخدام الجانب مبعثر مقابل مؤامرة وصمة عار قابلة للحياة للقضاء على الخلايا الميتة. واستخدام الجانب مبعثر مقابل مؤامرة CD45 للتمييز بين الفئات الكريات البيض الرئيسية. لجميع الخلايا الإيجابية CD45، أو لكل مجموعة فرعية الكريات البيض من الفائدة، وقياس نشاط البلعميات الخلوية تعتمد على الأجسام المضادة عن طريق الغوط مع علامة على الخلايا الإيجابية حبة في الرسم البياني من قناة الفلوروفور المناسبة للخرزات المقترنة.

ثم حساب الأجسام المضادة تعتمد على درجات البلعميات الخلوية كما متوسط كثافة الفلوريسنس من الخلايا الإيجابية حبة بنسبة من مجموع CD45 بالإضافة إلى الخلايا في السكان إيجابية. هنا، يتم عرض استراتيجية البوابات لإزالة doublets، والحطام، والخلايا الميتة. بين واحد إلى 12٪ من مجموع الخلايا الحية هي عادة CD45 الكريات البيض إيجابية مع معظم الجانب المزعومة مبعثر منخفضة إلى وسيطة CD45 monocytes منخفضة تظهر لتكون السلائف، أو الخلايا غير ناضجة، على أساس تشتت الجانب مقابل CD45 الغات.

يتم تعريف الحبيبات المزعومة على أنها الجانب مبعثر عالية، الخلايا المتوسطة CD45. قياس نشاط ADCP من خلايا حليب الثدي المعزولة حديثا باستخدام جسم مضاد أحادي النسيلة البشرية محددة فيروس نقص المناعة البشرية في شهر واحد بعد الولادة يكشف عن أن العلاج مع مثبطات أكتين Cytochalasin D أو مستقبلات Fc منع الأجسام المضادة قبل الحضانة مع مضادات ملزمة الخرز مقرن نتائج في نشاط ADCP في أو أقل التي لوحظت في وجود الأجسام المضادة السيطرة. درجة ADCP تحديد مجموع الخلايا الإيجابية CD45 هو عادة ما بين 25 إلى 35 أضعاف فوق مستويات الخلفية, تعريف باستخدام التحكم السلبي, المضادة للانكلوم المضادة للانثرة الخبيثة.

كل عينة حليب الثدي هي فريدة من نوعها وبعض الكريات قد يكون من الصعب أن نرى. وبالإضافة إلى ذلك، فإن مجموعات الكريات البيض، وبالتالي درجات ADCP، قد تختلف اختلافاً هائلاً من عينة إلى أخرى.