Name: قياس نشاط الكيتيناز في العينات البيولوجية (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 3 s
Description: اكتشف طريقة بسيطة لقياس نشاط الكيتيناز في العينات البيولوجية مثل سائل غسل القصبات الهوائية والمصل. تُحسّن هذه التقنية من قيمة الكيتيناز كعلامة تشخيصية وعلاجية لأمراض مثل مرض غوشيه.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

وقد تم دعم هذا البحث من قبل جمعية الرئة الأمريكية والجمعية الأمريكية للصدر جوائز LS. الكتاب يريدون بصدق أن أشكر الدكتور جاك إلياس والدكتور تشون جون لي لتوفير سلالات الماوس المعدلة وراثيا.

وقد أجريت جميع الإجراءات الحيوانية بموجب بروتوكول وافق عليه المركز في كلية الطب بجامعة ييل.
1. مجموعة عينة الماوس
<ol><li>
التخدير
	<ol>
<li>تخدير الفئران باستخدام الكيتامين والإكسلازين (100 ملغ/كغ من الكيتامين و10 ملغ/كغ من إكسلازين).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
جمع عينات الدم
	<ol>
<li>تأكد من عمق التخدير بعدم الاستجابة لقرصة اصبع القدم.</li>
		<li>فتح تجويف الصدر جراحيا لفضح القلب.</li>
		<li>أدخل إبرة 26.5 غرام في البطين الأيسر وجمع الدم في حقنة. ملاحظة: عادة، يمكن حصاد حوالي 0.5-1 مل من الدم من فأر صحي 20-25 غرام.</li>
		<li>جمع الدم في أنابيب الهيبارية، لجمع البلازما، أو أنابيب غير الهيبارية لجمع المصل.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
مجموعة من سائل غسل القصبات الهوائية (BAL)
	<ol>
<li>لجمع BAL، وجعل قطع عمودي على الرقبة لفضح القصبة الهوائية.</li>
		<li>قم باستئصال القصبة الهوائية بقسطرة 22 G وتأمينها بقوة باستخدام سلسلة من أجل منع التسرب من أنف الماوس.</li>
		<li>حقن ببطء اثنين من aliquots من محلول الفوسفات المعقمة المخزنة بالوقود (PBS، 0.75 مل لكل منهما) في الرئتين عن طريق القصبة الهوائية واسترداد مرة أخرى.</li>
		<li>تجمع aliquots والحفاظ على الجليد لمزيد من التحليل.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
معالجة العينات البيولوجية.
	<ol>
<li>عينة الدم: إما طازجة (البلازما) أو بعد السماح التخثر لمدة 4 ح (المصل)، الطرد المركزي في 600 × ز لمدة 10 دقائق. خذ supernatant وإما تجميد للتخزين أو استخدامها للتجربة.</li>
		<li>BAL: الطرد المركزي العينة في 350 × ز لمدة 5 دقائق. خذ supernatant وإما تجميد للتخزين أو استخدامها للتجربة.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. تشيتيناسي أسي
ملاحظة: العلم وراء اختبار بسيط نسبيا. يتم شق الركيزة غير الفلورية بواسطة الكيتيناز النشط الأنزيمية لإنتاج منتج فلورسنت، والذي يقاس بعد ذلك كعلامة غير مباشرة لنشاط الكيتيناز. الكيتيناسيس داخل العينات كسر الركيزة 4-ميثيلومبيالريل-د-N، N'-diacetylchitobiose موجودة في المخزن المؤقت McIlvain 1X. يتم إطلاق جزيء الفلورسنت 4-ميثيلومبيالميريل. من خلال قياس الفلورة الكلي لكل بئر، نحصل على قياس دقيق للكيتيناز النشط في كل عينة. لأن انهيار الكيتين عن طريق الكيتينا هو رد فعل مائي، وقف العازلة، خليط من 0.3 M الجلايسين وهيدروكسين (12.0 غرام / لتر في درجة الحموضة 10.6)، ينتهي انهيار الكيتين عن طريق خلق بيئة أساسية جدا للإنزيم للعمل.
<ol><li>
إعداد الركائز والمعايير والحلول.
	<ol>
<li>جهزوا مخزن (ماكيلفين) المؤقت يتكون المخزن المؤقت McIlvain من 0.1 M سيترات و 0.2 M الفوسفات عند درجة الحموضة من 5.2. تمييع بنسبة 1:1 ل1x McIlvain العازلة.</li>
		<li>حل كل من 4-ميثيلومبيالميريل-د-N، ن-diacetylchitobiose و 4-ميثيلومبيالريلريل ß-D-N، N'، N"-triacetylchitotriose في 1X McIlvain العازلة إلى تركيز 500 درجة مئوية لكل منهما. ملاحظة: يمكن تخزين محلول المخزون عند -20 درجة مئوية لمزيد من الاستخدامات؛ أفضل المخزنة في aliquots.</li>
		<li>حل القياسية، 4-methylumbelliferone، إلى تركيز 0.1 mM في وقف العازلة (خليط من 0.3 M الجلايسين وهيدروكسيد الصوديوم (12.0 غرام / لتر في درجة الحموضة 10.6)) لإنشاء الحل القياسية منحنى الأسهم.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
إنشاء لوحة الحل العمل.
	<ol>
<li>الجمع بين 1X McIlvain العازلة والشيتين الركيزة 4-ميثيلومبيالميريل-D-N، N'-diacetylchitobiose لخلق حل العمل. لكل 10 عينات، مزيج 100 درجة مئوية من الركيزة مع 2.17 مل من 1X McIlvain العازلة. انظر الجدول 1 للاطلاع على حسابات إضافية استناداً إلى حجم العينة. ملاحظة: استخدام 4-ميثيلومبيلميريل ß-D-N، N'، N"-triacetylchitotriose للعينات البشرية. في حين أن كلا الركائز يمكن أن تكون مشعبة إما من قبل إنزيمات الإنسان أو الماوس، وقد تم تعيينها إما لعينات الإنسان أو الماوس على أساس كفاءة الانقسام6.</li>
		<li>ماصة 95 درجة مئوية من حل العمل في كل بئر من لوحة 96 جيدا.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
إضافة عينات من العينات الحيوية إلى حل العمل.
	<ol>
<li>بعد ذلك، أضف 5 ميكرولتر من عينة الاختبار (الدم/BAL/lysate الأنسجة/السوائل البيولوجية الأخرى) إلى كل بئر.</li>
		<li>امزج العينة في حل العمل للحصول على نتائج أكثر دقة وموثوقية. ملاحظة: وينبغي تشغيل العينات في التكرارات/الثلاثية مع إيلاء اهتمام خاص للآثار المحتملة على الحافة. يجب أن تكون جميع العينات قبل تسخينها لتقليل تأثير الحافة. كما ينطوي على فحص رد فعل بين الكيتينافية في العينة والركيزة في حل العمل، فمن الأفضل للعمل بسرعة نسبيا لتقليل الفرق في الوقت بين عندما يتم مطلي العينة الأولى ومطلي العينة الأخيرة. ينصح ماصة متعددة القنوات.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
الحضانة عند 37 درجة مئوية
	<ol>
<li>يُغطّى الطبق ويُرجّ لفترة وجيزة (5 ق).</li>
		<li>حضانة لوحة في 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. وهذا يسمح لرد الفعل الأنزيمي أن يحدث.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
إعداد المنحنى القياسي.
	<ol>
<li>في حين أن العينات هي الحضانة، وإعداد تخفيف تسلسلي من 4-methylumbelliferone، وهو معيار غالبا ما تستخدم في تحديد الفلورمتري من نشاط الإنزيم.</li>
		<li>تخفيف مخزون الحل القياسي في وقف العازلة إلى تركيز 5 μM.</li>
		<li>إجراء سلسلة من التخفيفات على النحو المبين في الجدول 2. إضافة المكونات في المبلغ المشار إليه ومزيج جيدا. ملاحظة: يساعد المنحنى القياسي على ضمان سقوط العينات المقاسة في النطاق الخطي للمنحنى القياسي.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
إيقاف رد الفعل مع وقف العازلة.
	<ol>
<li>إضافة 200 درجة مئوية من وقف العازلة إلى كل بئر لوقف رد الفعل.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
لوحة المعايير.
	<ol>
<li>إضافة 300 درجة مئوية من كل معيار لكل بئر في التكرارات على نفس اللوحة.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
قراءة لوحة باستخدام قارئ الفلورومتري.
	<ol>
<li>قراءة لوحة في الإثارة من 360 نانومتر, وانبعاث 455 نانومتر.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3- تحليل البيانات
<ol><li>
طرح الفراغات
	<ol>
<li>متوسط قيم التخفيفات القياسية المكررة التي ليس لها 4-ميثيلبيليفييرون. طرح هذه القيمة من كافة القيم المسجلة الأخرى.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
تأخذ متوسط من التكرارات التقنية ورسم المعايير.
	<ol>
<li>متوسط القراءتين لكل تركيز ورسم بياني متوسط القراءة حسب التركيز. ملاحظة: يجب أن تبدو المؤامرة الناتجة خطية ولها قيمة R2 قريبة من 1. إذا لم يكن كذلك، قد يكون من الضروري إعادة المعايير وإعادة قراءة لوحة لضمان جودة تحليل البيانات.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
توحيد قيم القراءة.
	<ol>
<li>إنشاء خط مناسب لبيانات المعايير المرسومة. تقسيم قراءة العينات حسب ميل الخط الأنسب.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
مقارنة القيم من مجموعة التحكم ومجموعة المتغيرات.
	<ol>
<li>استخدم اختبار t أو ANOVA لأكثر من مجموعتين لتحديد ما إذا كان الفرق بين المجموعات مهم إحصائيًا. القيم سوف تأخذ وحدات nmol / مل · ح.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Hamid, R., Khan, M. A., Ahmad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chitinases%3A+An+update%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacy+and+Bioallied+Sciences%22%5BJournal%5D)">Chitinases: An update.</a> Journal of Pharmacy and Bioallied Sciences. 5 (1), 21-29 (2013).</li>
<li>Sharma, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+and+Role+of+Chitotriosidase+during+Lung+Infection+with+Klebsiella+pneumoniae%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Regulation and Role of Chitotriosidase during Lung Infection with Klebsiella pneumoniae.</a> Journal of Immunology. 201 (2), 615-626 (2018).</li>
<li>Kanneganti, M., Kamba, A., Mizoguchi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+chitotriosidase+%28chitinase+1%29+under+normal+and+disease+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Epithelial+Biology+%26+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Role of chitotriosidase (chitinase 1) under normal and disease conditions.</a> Journal of Epithelial Biology & Pharmacology. 5, Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3579558/">http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3579558/</a> 1-9 (2012).</li>
<li>Lee, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Chitin+and+Chitinase%2FChitinase-Like+Proteins+in+Inflammation%2C+Tissue+Remodeling%2C+and+Injury%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Role of Chitin and Chitinase/Chitinase-Like Proteins in Inflammation, Tissue Remodeling, and Injury.</a> Annual Review of Physiology. (73), 479-501 (2011).</li>
<li>Jeuniaux, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chitinase%3A+An+Addition+to+the+List+of+Hydrolases+in+the+Digestive+Tract+of+Vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Chitinase: An Addition to the List of Hydrolases in the Digestive Tract of Vertebrates.</a> Nature. 192 (4798), 135-136 (1961).</li>
<li>Boot, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+Novel+Acidic+Mammalian+Chitinase+Distinct+from+Chitotriosidase%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Identification of a Novel Acidic Mammalian Chitinase Distinct from Chitotriosidase.</a> Journal of Biological Chemistry. 276 (9), 6770-6778 (2000).</li>
<li>Arndt, S., Hobbs, A., Sinclaire, I., Lane, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chitotriosidase+Deficiency%3A+A+Mutation+Update+in+an+African+Population%5BTitle%5D)+AND+%22JIMD+Reports%22%5BJournal%5D)">Chitotriosidase Deficiency: A Mutation Update in an African Population.</a> JIMD Reports. 10, 11-16 (2013).</li>
<li>Di Rosa, M., Malaguarnera, G., De Gregorio, C., Drago, F., Malaguarnera, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+CHI3L-1+and+CHIT-1+Expression+in+Differentiated+and+Polarized+Macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Inflammation%22%5BJournal%5D)">Evaluation of CHI3L-1 and CHIT-1 Expression in Differentiated and Polarized Macrophages.</a> Inflammation. 36 (2), 482-492 (2013).</li>
<li>Wiesner, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chitin+Recognition+via+Chitotriosidase+Promotes+Pathologic+Type-2+Helper+T+Cell+Responses+to+Cryptococcal+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Chitin Recognition via Chitotriosidase Promotes Pathologic Type-2 Helper T Cell Responses to Cryptococcal Infection.</a> PLOS Pathogens. 11 (3), e1004701(2015).</li>
<li>Elmonem, M. A., vanden Heuvel, L. P., Levtchenko, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunomodulatory+Effects+of+Chitotriosidase+Enzyme%5BTitle%5D)+AND+%22Enzyme+Research%22%5BJournal%5D)">Immunomodulatory Effects of Chitotriosidase Enzyme.</a> Enzyme Research. 2016, 1-9 (2016).</li>
<li>Ferrari, A. R., Gaber, Y., Fraaije, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fast%2C+sensitive+and+easy+colorimetric+assay+for+chitinase+and+cellulase+activity+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Biofuels%22%5BJournal%5D)">A fast, sensitive and easy colorimetric assay for chitinase and cellulase activity detection.</a> Biotechnol Biofuels. 7 (37), 1-8 (2014).</li>
<li>Schales, O., Schales, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+method+for+the+determination+of+glucose+in+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Am+Fed+Clin+Res%22%5BJournal%5D)">Simple method for the determination of glucose in blood.</a> Proc Am Fed Clin Res. 2, Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20275623">http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20275623</a> 78(1945).</li>
<li>Zarei, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Chitinase+with+Antifungal+Activity+from+a+Native+Serratia+Marcescens+B4A%5BTitle%5D)+AND+%22Brazilian+Journal+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Characterization of Chitinase with Antifungal Activity from a Native Serratia Marcescens B4A.</a> Brazilian Journal of Microbiology. 42 (297), 1017-1029 (2011).</li>
<li>Zhu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acidic+Mammalian+Chitinase+in+Asthmatic+Th2+Inflammation+and+IL-13+Pathway+Activation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Acidic Mammalian Chitinase in Asthmatic Th2 Inflammation and IL-13 Pathway Activation.</a> Science. 304 (5677), 1678-1682 (2004).</li>
<li>Hollak, C. E., van Weely, S., van Oers, M. H., Aerts, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marked+elevation+of+plasma+chitotriosidase+activity.+A+novel+hallmark+of+Gaucher+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Marked elevation of plasma chitotriosidase activity. A novel hallmark of Gaucher disease.</a> Journal of Clinical Investigation. 93 (3), 1288-1292 (1994).</li>
<li>Musumeci, M., Malaguarnera, L., Simpore, J., Barone, R., Whalen, M., Musumeci, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chitotriosidase+activity+in+colostrum+from+African+and+Caucasian+women%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry+and+Laboratory%22%5BJournal%5D)">Chitotriosidase activity in colostrum from African and Caucasian women.</a> Clinical Chemistry and Laboratory. 43 (2), 198-201 (2005).</li>
<li>Maddens, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chitinase-like+Proteins+are+Candidate+Biomarkers+for+Sepsis-induced+Acute+Kidney+Injury%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Chitinase-like Proteins are Candidate Biomarkers for Sepsis-induced Acute Kidney Injury.</a> Mol Cell Proteomics. 11, 1-13 (2012).</li>
<li>Hector, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chitinase+activation+in+patients+with+fungus-associated+cystic+fibrosis+lung+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Allergy+and+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Chitinase activation in patients with fungus-associated cystic fibrosis lung disease.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 138 (4), 1183-1189 (2016).</li>
<li>Hall, A. J., Morroll, S., Tighe, P., Götz, F., Falcone, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+chitotriosidase+is+expressed+in+the+eye+and+lacrimal+gland+and+has+an+antimicrobial+spectrum+different+from+lysozyme%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+and+Infection%22%5BJournal%5D)">Human chitotriosidase is expressed in the eye and lacrimal gland and has an antimicrobial spectrum different from lysozyme.</a> Microbes and Infection. 10 (1), 69-78 (2008).</li>
<li>Kim, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AMCase+is+a+crucial+regulator+of+type+2+immune+responses+to+inhaled+house+dust+mites%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">AMCase is a crucial regulator of type 2 immune responses to inhaled house dust mites.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (22), e2891-e2899 (2015).</li>
<li>Olkhovych, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chitotriosidase+activity+as+additional+biomarker+in+the+diagnosis+of+lysosomal+storage+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Ukrainian+Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Chitotriosidase activity as additional biomarker in the diagnosis of lysosomal storage diseases.</a> Ukrainian Biochemical Journal. 88 (1), 69-78 (2016).</li>
<li>Bouayadi, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease%3A+An+Underdiagnosed+Pathology+in+the+Eastern+Moroccan+Population%5BTitle%5D)+AND+%22eJIFCC%22%5BJournal%5D)">Disease: An Underdiagnosed Pathology in the Eastern Moroccan Population.</a> eJIFCC. 30 (1), 82-87 (2019).</li>
<li>Tasci, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+of+serum+chitotriosidase+activity+in+early+treatment+of+patients+with+active+tuberculosis+and+a+negative+sputum+smear%5BTitle%5D)+AND+%22Therapeutics+and+Clinical+Risk+Management%22%5BJournal%5D)">Efficacy of serum chitotriosidase activity in early treatment of patients with active tuberculosis and a negative sputum smear.</a> Therapeutics and Clinical Risk Management. 8, 369-372 (2012).</li>
<li>Barone, R., Simporé, J., Malaguarnera, L., Pignatelli, S., Musumeci, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+chitotriosidase+activity+in+acute+Plasmodium+falciparum+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22Clinica+Chimica+Acta%22%5BJournal%5D)">Plasma chitotriosidase activity in acute Plasmodium falciparum malaria.</a> Clinica Chimica Acta. 331 (1-2), 79-85 (2003).</li>
<li>Kitamoto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chitinase+inhibition+promotes+atherosclerosis+in+hyperlipidemic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Chitinase inhibition promotes atherosclerosis in hyperlipidemic mice.</a> American Journal of Pathology. 183 (1), 313-325 (2013).</li>
<li>Kzhyshkowska, J., Gratchev, A., Goerdt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Chitinases+and+Chitinase-Like+Proteins+as+Indicators+for+Infl+Ammation+and+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Biomark+Insights%22%5BJournal%5D)">Human Chitinases and Chitinase-Like Proteins as Indicators for Infl Ammation and Cancer.</a> Biomark Insights. 2, 128-146 (2007).</li>
</ol>

وقد برز نشاط الكيتينازي كعلامة حيوية هامة للتنبؤ بخطورة المرض، وتطور المرض، والفعالية العلاجية ووجود مسببات أمراض محددة18. على الرغم من أن العديد من النظريات المفترضة منذ فترة طويلة حول دور الكيتينالم لم يتم إثباتها تجريبيا19، قدمت دراسات جديدة رؤى هامة في دور الكيتينا والكيتينا مثل البروتينات في مختلف الأمراض2، 9،20.
البروتوكول الموصوف هنا هو وسيلة بسي...

الكيتين هو ثاني أكثر السكاريد وفرة على الأرض بعد السليلوز، وهو بمثابة مكون هيكلي رئيسي لمجموعة متنوعة من الكائنات الحية بما في ذلك الهيكل الخارجي للحشرات والفطريات والخميرة والطحالب. بعض الفقاريات لديها أيضا الكيتين1. الكيتيناسيس هي عائلة من الإنزيمات التي هي قادرة على كسر الكيتين ويتم حفظها بشكل كبير في جميع أنحاء التطور في الأنواع التي تتراوح بين البكتيريا والثدييات2،3. بالإضافة إلى الكيتيناسيس ، الثدييات لديها أيضا البروتينات الشبيهة الكيتينازي التي تشبه الكيتيناسيس في قدرتها على ربط الكيتين ولكنها تختلف من حيث أنها تفتقر إلى القدرة الأنزيمية على شق الكيتين4.
على الرغم من أن الكيتين والكيتيناقد قد تمت دراستهما منذ فترة طويلة - مع التحقيقات التي يعود تاريخها إلى أوائل عام 1900 - كان التركيز الرئيسي على دورها في الحشرات واللافقاريات الأخرى. في الواقع، لم يكن حتى 1960s عندما تم العثور على الفقاريات أن يكون الكيتينا على الإطلاق. باستخدام إجراء بفحص قائم على الشيتوية، تبين أن الكيتيناس موجود في الجهاز الهضمي لعدد من الفقاريات بما في ذلك السحالي والطيور السوداء - وهي ملاحظة يفترض أنها ترجع إلى استهلاك الكائنات التي تحتوي على الكيتين مثل الحشرات5 .
الثدييات لها شكلان نشطان من الكيتيناز الأنزيمية: الكيتيناز الثدييات الحمضية (AMCase؛ المعروف أيضا باسم CHIT2 وCHIA) وchitotriosidase (CHIT1)4. كل من هذه البروتينات قادرة على تحلل الكيتين. ومع ذلك، CHIT1 هو أكثر نشاطا الأنزيمية في البشر، حيث تقريبا كل من نشاط الكيتيناز مشتق من CHIT1. 4 في الفئران، كل من Chit1 وAMCase تسهم على قدم المساواة تقريبا في النشاط الكيتينازي العام6. من ناحية أخرى، البروتينات الشبيهة الكيتيناز تفتقر إلى نشاط الكيتيناز.
تفرز Chit1 أساسا من قبل الضامة وغالبا ما تعتبر استجابة مناعية لمسببات الأمراض التي تحتوي على الكيتين7. وقد ثبت أيضا أن الإنزيم تشارك في نضج الخلايا الأحادية في كل من M1 و M2 الأنواع الفرعية الضامة، حتى من دون وجود الكيتين الركيزة8. وعلاوة على ذلك، فإنه قد تشارك أيضا في نضج الخلايا المناعية الأخرى بما في ذلك T مساعد نوع 2 (Th2) الخلايا والحمضات - كما تبين أن يكون الحال في عدوى الرئة cryptococcal9. وتشير هذه الدراسات إلى دور معقد من الكيتيناسيس في الجهاز المناعي.
في السنوات الأخيرة، تم العثور على مستويات Chit1 لتكون بمثابة علامة حيوية هامة للتقدم لأكثر من 40 أمراض بشرية مختلفة بما في ذلك أمراض التخزين الليسوسومية، والأمراض المعدية، وأمراض الجهاز التنفسي، وأمراض الغدد الصماء، والقلب والأوعية الدموية الأمراض، والأمراض العصبية، وغيرها (استعرض10). في العديد من هذه الأمراض، ومستويات Chit1 هي توقع قوي لشدة المرض والفعالية العلاجية10.
كما اكتسبت الكيتينا سمعة كعلامة حيوية للعديد من الحالات الطبية بما في ذلك مرض Gaucher، وقد وضعت أدوات واختبارات لتسهيل اختبار وجود الكيتيناز. وتشمل الأساليب القديمة إجراء Schales، بروتوكول تكييفها من اختبار الجلوكوز في الدم، وطريقة حمض الدينتيروساليك 3،5 (DNS). ومع ذلك، فإن هذه الأساليب غالبا ما تكون حساسة للوقت وصعبة من الناحية التقنية11. يتطلب الإجراء لكلا الاختبارين الحد من المواد المؤكسدة غير العضوية، الفيريسيد في حالة إجراء Schales على سبيل المثال، مما يؤدي إلى تغيير اللون الذي لا يمكن قياسه إلا من حيث الطيف. بالإضافة إلى ذلك، كلا الاختبارين ينطوي على التدفئة أو خطوة الغليان التي تستغرق وقتا طويلا وضرورية للون لتطوير12،13.
وصف هنا هو اختبار الفلورة سريعة وبسيطة لتحديد مستويات الكيتينازي في عينات الثدييات14،15. اثنين من العينات المستخدمة هنا تشمل المصل وسوائل غسل القصبات الهوائية (BAL)؛ كما تم قياس نشاط الكيتيناز في عينات حليب الثدي والبول، ويمكن إجراء هذه التقنية في هذا النوع من العينات وكذلك في أي سائل بيولوجي آخر16،17.

<table><tbody><tr><td>4-methylumbelliferone</td><td>Sigma</td><td>M1381</td><td>Standard: يشيع استخدامها في فحوصات القياس الدقيق لتحديد نشاط الإنزيم</td></tr><tr><td>4MU-GlcNAc2</td><td>Sigma</td><td>M9763</td><td>ركيزة الكيتيناز الفلورية للاستخدام في عينات الفئران</td></tr><tr><td>4MU-GlcNAc3</td><td>Sigma</td><td>M5639</td><td>ركيزة الكيتيناز الفلورية للاستخدام في العينات البشرية</td></tr><tr><td>حامض الستريك أحادي الهيدرات</td><td></td><td></td><td>للاستخدام في McIlvain Buffer</td></tr><tr><td>Glycine</td><td></td><td></td><td>للاستخدام في Stop Buffer بتركيز 0.3 M</td></tr><tr><td>Na2HPO4xH2O</td><td></td><td></td><td>للاستخدام في McIlvain Buffer</td></tr><tr><td>NaOH</td><td></td><td></td><td>للاستخدام في Stop Buffer بتركيز 12 جم / لتر</td></tr><tr><td>لوحة الرؤية: غير معقمة ، غير معالجة سوداء 96 لوحة بئر</td><td>4titude</td><td>4ti-0224</td><td></td></tr></tbody></table>

قياس نشاط الكيتيناز في العينات البيولوجية

Measurement of Chitinase Activity in Biological Samples

الكيتيناسيس هي الإنزيمات التي تلتشق الكيتين. حتى في غياب الكيتين، الثدييات لديها كميات كبيرة من الكيتيناالموجودة في الجسم بما في ذلك في خط الأساس. لا يعرف الدور الدقيق للكيتيناز، ولكن كان يعتقد أن تلعب دورا هاما في الهضم والدفاع المضيف ضد المواد الغذائية التي تحتوي على الكيتين ومسببات الأمراض، على التوالي. وقد أظهرت الأعمال الأخيرة، بما في ذلك عملنا، دورا هاما من البروتينات مثل الكيتيناز والكيتينا في الحصانة المضيفة وأمراض الحساسية. الأهم من ذلك، أنشطة الكيتيناز بمثابة علامات حيوية هامة لشدة المرض في مجموعة واسعة من الأمراض بما في ذلك الأمراض الالتهابية من النوع 2 مثل الربو والتليف الرئوي. وبالمثل، فإن المرضى الذين يعانون من اضطرابات وراثية مثل مرض Gaucher قد ارتفعت بشكل ملحوظ مستويات الكيتيناز، والتي لا ترتبط فقط مع شدة المرض ولكن أيضا بمثابة علامة حيوية موثوق بها للفعالية العلاجية. يصف البروتوكول الموضح هنا طريقة بسيطة وسريعة ومباشرة لقياس نشاط الكيتيناز في BAL أو عينات المصل من الفئران ويمكن تكييفها على نطاق واسع مع البشر والكائنات الحية النموذجية الأخرى بسبب الطبيعة المحفوظة للغاية للإنزيمات.

النتائج المبينة هنا هي من دراسة قياس نشاط الكيتينازي في المصل وعينات BAL من النوع البري (C57BL/6) وChit1 الفئران المعدلة وراثيا (على خلفية C57BL/6) أن overexpress الجين Chit1 على المروج الدوكسيسيكلين. وتظهر بياناتنا أن كلا من عينات المصل وBAL لها نشاط الكيتيناز القابل للكشف عند خط الأساس 698.2 ± 189.9 نمول/مل·ح و 485.7 ± 114 نمول/مل·ح، على التوالي. أدى الإفراط في التعبير عن جين Chit1 باستخدام الدوكسيسيكلين في مياه الشرب لمدة 4 أسابيع إلى ارتفاع نشاط الكيتيناز الذي لوحظ في كل من BAL (4,575 ± 673.8 نمول/مل·ح، ع = 0.003) وا...

المعروضة هنا هي طريقة بسيطة لقياس نشاط الكيتيناز في السوائل البيولوجية مثل غسل القصبات الهوائية أو المصل.

Chitinases are the enzymes that cleave chitin. Even in the absence of chitin, mammalians have significant amounts of chitinases present in the body ...

هذه الطريقة تسمح بطريقة أكثر فعالية لتحديد كمية نشاط الكيتينز في العينات البيولوجية. وقد ثبت أن نشاط Chitinase بمثابة علامة جيدة للتشخيص والفعالية العلاجية في العديد من الظروف والأمراض. كانت الطرق السابقة لقياس نشاط الشيتينز تستغرق وقتًا طويلاً وغالبًا ما يصعب تنفيذها ، وكلاهما من المشاكل التي تم حلها من خلال الفحص الموضح هنا.هذه التقنية سوف تساعد على تحقيق الكيتيناس المحتملة لديها كعلامة التشخيص والعلاج من خلال جعل من السهل قياس نشاط الشيتيناز؛ على سبيل المثال، يمكن استخدامه لرصد علاج مرض غوشر لأنه ثبت أن نشاط الشيتيناز ينخفض أثناء العلاج الفعال. تبدأ من خلال إعداد ركائز، والمعايير، والحلول للتشكيل. إعداد 1x McIlvain العازلة وفقا لاتجاهات المخطوطة واستخدامها لتخفيف ركائز الكيتين إلى 500 ميكرومولار لكل من.حل 4-ميثيلوميبيليفرون, المعيار, إلى تركيز 0.1 ميليمولار في توقف العازلة لإنشاء حل الأسهم منحنى القياسية. لكل 10 عينات، مزيج 2.17 ملليلتر من 1x McIlvain العازلة مع 100 ميكرولترات من الركيزة كيتين لخلق حل العمل، ثم ماص 95 ميكرولترات من حل العمل في كل بئر من لوحة 96 جيدا. إضافة خمسة ميكرولترات من عينة الاختبار إلى كل بئر ومزجها في حل العمل.غطي الطبق واهزه لمدة خمس ثوان، ثم يحضن الصفيحة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة للسماح بانغام التفاعل الأنزيمي. وفي الوقت نفسه، تمييع محلول المخزون من 4-ميثيلوميبيليفرون لجعل حل معيار العمل خمسة micromolar وخلق منحنى قياسي من خلال إعداد سلسلة من dilutions وفقا للمخطوطة. تبدأ مع تركيز خمسة ميكرومولار ومزيج كل تخفيف جيدا.بعد الحضانة، إضافة 200 ميكرولترات من توقف العازلة إلى كل بئر لوقف رد الفعل. أضف 300 ميكروليتر مكررة من كل معيار إلى نفس اللوحة، ثم اقرأ اللوحة بإثارة 360 نانومتر وانبعاث 455 نانومتر. وقد استخدم هذا البروتوكول بنجاح لقياس نشاط الشيتيناز في القصبات الهوائية وسائل المصل من النوع البري وشيتوريوسيداسي الإفراط في التعبير عن الفئران المعدلة وراثيا.تؤكد التشايس أن الإفراط في التعبير عن جين CHIT-1 في الفئران يؤدي إلى زيادة نشاط الشيتينز. واستخدم منحنى قياسي لتحديد الكيتينز استنادا إلى الفلور من العينات. أهم شيء أن نتذكر عند محاولة لأول مرة البروتوكول هو إضافة عينات بأسرع وكفاءة ممكن في حين لا يزال خلط شامل.عند البدء لأول مرة، قد يكون من المفيد القيام بعدد أقل من العينات لكل تشغيل لضمان الدقة في القياسات، وذلك بسبب فترة حضانة أقصر.

measurement-of-chitinase-activity-in-biological-samples

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

علم المناعة والعدوى

وصفنا منخفضة التكلفة ، وأسلوب إنتاجية عالية للكشف عن النشاط endoglucanase الفطرية...

ارتفاع المناولة فحص النشاط Endoglucanase الفطرية في القولونية</em

يوضح هذا الفيديو فحصا لفحص الإنزيمات الفعالة في تحطيم السكريات المعقدة في الكتلة الحيوية النباتية باستخدام الكتلة الحيوية الملونة غير القابلة للذوبان أو ICB. تقوم الإنزيمات بتحلل ICB لإطلاق السكريات قليلة السكاريد المرتبطة بالصبغة القابلة للذوبان ، ويتم تقييم نشاط الإنزيم عن طريق التحليل اللوني لمنتج التفاعل.

فحص الإنزيم القائم على الكتلة الحيوية الكروموجينيك غير القابل للذوبان: اختبار لتقييم نشاط التحلل للإنزيمات المهينة للكتلة الحيوية النباتية

يوضح هذا الفيديو القياس في المختبر لنشاط الإنزيم ل α-galactosidase A وحمض α-glucosidase في العينات باستخدام ركائز 4-Methylumbelliferyl الاصطناعية.

القياس في المختبر لنشاط إنزيم α-Galactosidase A وحمض α-جلوكوزيداز

هنا ، نقدم بروتوكولات لفحص وتوصيف الإنزيمات بسرعة للنشاط المضاد للميكروبات. يستخدم مقايسة انتشار الشرائح الدقيقة ومقايسة إطلاق الصبغة ركائز بكتيرية مستهدفة لتقييم النشاط الأنزيمي النوعي والكمي.

فحوصات النوعية والكمية للكشف وتوصيف مضادات الميكروبات البروتين

يتم وصف مقايسة عالية الإنتاجية لفحص الإنزيم. تتكون مجموعة الفحص الجاهزة للاستخدام متعددة الإرسال هذه من ركائز Chromogenic Polymer Hydrogel (CPH) المختارة مسبقا وركائز الكتلةB الهرومولينية Cالمعقدة I (ICB). الإنزيمات المستهدفة هي الإنزيمات الداخلية والبروتياز المتحلل للسكاريد.

فحص الإنتاجية العالية من الكربوهيدرات المهينة الانزيمات عن طريق رواية غير قابل للذوبان اللونية الركيزة الفحص أطقم

نصف بروتوكولا أساسيا لقياس نشاط ATPase في المختبر. يمكن تحسين هذا البروتوكول بناء على مستوى النشاط والمتطلبات الخاصة ب ATPase منقى معين.

قياس<em&gt; في المختبر</em&gt; أتباز آخر لالأنزيمية توصيف

هنا، يمكننا وصف بروتوكول الكروماتين إيمونوبريسيبيتيشن من هيستونيس المعدلة من مهدها الخميرة Saccharomyces cerevisiae. إيمونوبريسيبيتاتيد الحمض النووي بعد ذلك تستخدم ل PCR الكمي لاستجواب بوفرة والتعريب من التعديلات هيستون بوستترانسلاشونال في جميع أنحاء الجينوم.

إيمونوبريسيبيتيشن الكروماتين (رقاقة) من "التعديلات هستون" من Saccharomyces cerevisiae

نحن نصف طريقة معدلة تعتمد على أجار مصممة لقياس الآثار المضادة للفطريات للمنتجات المشتقة من النباتات. يمكن تقييم المساهمات المتقلبة وغير المتقلبة في النشاط المضاد للفطريات من خلال هذا البروتوكول. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن قياس الفعالية ضد الفطريات في المراحل التنموية الرئيسية في إعداد تجريبي واحد.

قياس النشاط المتطاير وغير المتطاير المضاد للفطريات لمنتجات التحكم الحيوي

يصف هذا البروتوكول طريقة للحصول على بيانات كمية عن النشاط المضاد للفطريات للببتيدات والمركبات الأخرى ، مثل العوامل المضادة للفطريات ذات الجزيئات الصغيرة ، ضد المبيضات البيض. إن استخدامه للكثافة الضوئية بدلا من حساب وحدات تشكيل المستعمرات لتحديد تثبيط النمو يوفر الوقت والموارد.

تحديد النشاط المضاد للفطريات للببتيدات ضد المبيضات البيض

في هذه الورقة ، يتم تقديم طرق السمية البيئية الموحدة لتقييم المؤشرات الحيوية في أنواع الأنوران الاستوائية الجديدة. على وجه التحديد ، توضح هذه الورقة بالتفصيل العديد من المنهجيات على نطاقات مختلفة من تقييم السموم البيئية ، مثل المستويات الجينية والخلوية النسيجية والكيميائية الحيوية والمورفولوجية والفردية.

منهجيات السموم البيئية لتقييم المؤشرات الحيوية على نطاقات مختلفة في الأنوران الاستوائية الجديدة

اكتشف طريقة بسيطة لقياس نشاط الكيتيناز في العينات البيولوجية مثل سائل غسل القصبات الهوائية والمصل. تُحسّن هذه التقنية من قيمة الكيتيناز كعلامة تشخيصية وعلاجية لأمراض مثل مرض غوشيه.

قياس نشاط الكيتيناز في العينات البيولوجية

استكشف المزيد من الفيديوهات