نموذج تعبير كيميائي خارج الرحم لاختبار توظيف الضامة في فيفو
سبتمبر 25, 2019
لاختبار تأثير chemokine على تجنيد الضامة في الجسم الحي، تم استخدام جبل كامل في الموقع التهجين للكشف عن التعبير خارج الرحم من chemokine، واستخدمت تلطيخ المناعة لتسمية الضامة. تم استخدام التصوير الحي للمراقبة في الوقت الحقيقي لهجرة الضامة.
البروتوكول الموصوف هنا يسمح لنا بالتحقيق في وظيفة chemokine وسلوك الضامة في الجسم الحي. وتستند معظم النماذج التجريبية الموجودة من chemotaxis الخلية على تجارب الخلايا في المختبر. ولكن التجارب في المختبر في بعض الأحيان بسيطة جداً لنميث البيئة المعقدة في الجسم الحي.
أيضا، فإنها قد لا تمثل القدرة على العلاج الكيميائي في الجسم الحي. هذه الأساليب تستخدم ميزة محددة من الأسماك حمار وحشي لمراقبة سلوك الخلية مباشرة، وهو أمر صعب بالنسبة للفئران. ابدأ بتوليد 10A interleukin-34 الانشاءات المعدلة وراثيا.
حقن FABP-10A إنترلوكين-34 يبني في مرحلة واحدة خلية Tg (mpeg1:GFP) المعدلة وراثيا وأجنة الأسماك من نوع البرية جنبا إلى جنب مع MRNA transposase. رفع وجمع الأجنة وفقا لتعليمات المخطوطات. ثم، إصلاح لهم مع 4٪ شبهformaldehyde بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية أو لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة.
بعد التثبيت، وغسل الأجنة مع PBST ثلاث مرات لمدة خمس دقائق لكل غسل. يجفف الأجنة بشكل منفصل مع 50٪ من الميثانول في PBST ، يليه 100٪ من الميثانول ، ثم يتغير إلى ميثانول جديد بنسبة 100٪، ويخزنها عند درجة حرارة سالبة 20 درجة مئوية لمدة ساعتين على الأقل. عندما تكون جاهزة للتهجين التحقيق، إعادة هيدرات الأجنة بشكل منفصل في 50٪ الميثانول في PBST.
ثم، وغسلها مع PBST ثلاث مرات لمدة خمس دقائق لكل غسل. اهضم الأجنة بالبروتينات K في PBST في درجة حرارة الغرفة. ثم، والتخلص من حل الهضم، وتكرار التثبيت مع 4٪ شبهformaldehyde لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
بعد التثبيت، وغسل الأجنة مرتين مع PBST لمدة 10 دقيقة لكل غسل. تنفيذ prehybridization مع العازلة التهجين ساخنة في 65 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة على الأقل. ثم، سخني مسبار إنترلوكين-34 إلى 65 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
إعادة تدوير العازلة التهجين في أنبوب الأصلي وتنفيذ التهجين مع مسبار مسخن في 65 درجة مئوية بين عشية وضحاها. في اليوم التالي، قم بغسل الأجنة بنسبة 50٪ و2X SSCT متبوعة بـ 2X SSCT ثم 0.2x SSCT عند 65 درجة مئوية. كرر كل غسل ثلاث مرات مع 20 دقيقة لكل غسل.
ثم، غسل الأجنة ثلاث مرات مع PBST لمدة خمس دقائق لكل غسل. منع العينات مع 600 ملليلتر من العازلة حظر لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. ثم، إضافة 400 ميكرولترات من المضادة للأجسام المضادة للحفر digoxigenin حل واحتضان الأجنة في أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها.
في اليوم التالي، قم بإزالة الجسم المضاد وغسل الأجنة ست مرات مع PBST لمدة 20 دقيقة لكل غسل. بعد الغسيل الأخير، شطف كل عينة مع 30 ميكرولترات من 1X بالإضافة إلى diluent التضخيم لمدة خمس دقائق. احتضان العينات في محلول الثيامين الفلوروفور لمدة خمس إلى 15 دقيقة في الظلام.
تمديد فترة الحضانة إلى 30 دقيقة إذا كانت الإشارات ضعيفة. ثم، غسل الأجنة مع PBST ثلاث مرات لمدة 10 دقائق لكل غسل. واحتضانهم مع الأجسام المضادة الأولية في أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها.
في اليوم التالي، يغسل الأجنة خمس مرات مع PBST لمدة 30 دقيقة لكل غسل، واحتضان لهم مع الأجسام المضادة الثانوية في أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها. في اليوم التالي، وغسل الأجنة ثلاث مرات في PBST لمدة 10 دقائق لكل غسل، وتخزينها في 70٪ الجلسرين في الظلام في أربع درجات مئوية أو سلبية 20 درجة مئوية لفترة أطول. قبل التصوير، استخدم مجهر الفلوريسين لتحديد الأجنة الإيجابية المزدوجة الحمراء وGFP.
لتركيب الأسماك، واستخدام حمام معدني لتسخين ملليلتر واحد من 1٪ ذوبان agarose منخفضة إلى أكثر من 90 درجة مئوية. ثم، تبريده لدرجة حرارة الجسم ومزيج في 50 ميكرولترات من 0.2٪ tricaine. نقل الأجنة تخدير إلى طبق صغير مثبت مع شريحة غطاء على الجزء السفلي.
إزالة المياه المحيطة بها وإسقاط ببطء agarose ذوبان منخفضة على الأجنة. تعيين بعناية موقف الأسماك قبل أن تتوطد agarose، والحفاظ على منطقة الكبد قريبة من الشريحة الغطاء. بمجرد أن تتوطد agarose ، وتغطي بعناية مع طبقة أخرى من agarose لتعزيز ذلك.
ضع الطبق على طاولة الناقل المجهر confocal، وتغطية الأسماك مع حل E2 مع tricaine، وبدء التصوير. لتشغيل المجهر confocal، افتح برنامج Zen Black 2.3 وانقر فوق تحديد موقع، ثم الحضانة، ثم قم بتعيين درجة الحرارة إلى 29 درجة مئوية. انقر على قائمة الامتلاك وحدد وضع المسح الضوئي المطلوب وأشعة الليزر في قائمة الإعداد الذكية.
ثم حدد Z-المكدس والموضع. انقر على قائمة المصمم التجريبية وحدد تمكين تجربة كتلة متعددة في الكتلة الأولى للعثور على العينة تحت التكبير منخفضة. ثم قم بالتبديل إلى التكبير العالي والسماح للمنطقة الملاحظة في وسط المجال المرئي.
تعيين الموقع وZ-المكدس المعلومات. ثم حدد كثافة الليزر المناسبة، وطبقات المسح الضوئي، وسرعة التصوير. مرة واحدة يتم إعداد كافة الكتل، تعيين العدد المناسب من الحلقات وبدء التسجيل.
تم استخدام هذا البروتوكول لحقن إنترلوكين-34 الكبد محددة على التعبير plasmid في أجنة الأسماك المعدلة وراثيا، الذي تم تصنيف الضامة مع GFP. واستخدمت الفلورية الكاملة في التهجين الموضعي والمناعة لتحليل التعبير عن interleukin-34 وطبقة الضامة المسماة على GFP. تم تحليل أرقام خلايا الضامة كمياً في منطقة الأجنة التي تم حقنها وبناءها.
تم استخدام التصوير الحي لمراقبة الضامة مباشرة ، وصفت الخضراء ، وتمرير الكبد من الأسماك التحكم والهجرة إلى كبد interleukin - 34 على التعبير عن الأسماك. وتشمل الخطوات الهامة لهذا البروتوكول اختيار خط تحويلي مناسب لتسمية خلية الاهتمام. والأنسجة المناسبة لتصوير التعبير عن الجين المعدلة وراثيا وكذلك نافذة زمنية الملاحظة المناسبة.
يمكن تطبيق هذه التقنية لدراسة وظيفة العلاج الكيميائي الأخرى على سلوك الخلايا الأخرى ، مثل الخلايا التائية والعدلات في الجسم الحي.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تبحث هذه الدراسة في دور مادة الكيموكين في جذب الخلايا الضامة باستخدام نماذج حية. تشمل الطرق المستخدمة التهجين الموضعي الكامل والتصوير الحي لملاحظة سلوك الخلايا الضامة في الوقت الفعلي.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- علم المناعة
- بيولوجيا الخلية
الخلفية
- تعتمد النماذج الحالية لكيمياء الخلايا غالباً على التجارب المختبرية.
- قد تبسط النماذج المختبرية البيئة الحية المعقدة.
- الملاحظة المباشرة لسلوك الخلية صعبة في نماذج الثدييات التقليدية.
- توفر الأسماك الزردية ميزة فريدة لدراسة هجرة الخلايا في الجسم الحي.
هدف الدراسة
- استكشاف وظيفة مادة كيموكين معينة.
- تحليل سلوك الخلايا الضامة في كائن حي.
- تحسين فهم كيمياء الخلايا في بيئة أكثر تمثيلاً.
الطرق المستخدمة
- التهجين الموضعي الكامل لكشف مادة الكيموكين.
- الصباغة المناعية لتمييز الخلايا الضامة.
- التصوير الحي لملاحظة هجرة الخلايا الضامة في الوقت الفعلي.
- استخدام الأسماك الزردية ككائن حي نموذجي.
النتائج الرئيسية
- الكشف الناجح عن تعبير مادة الكيموكين في الجسم الحي.
- كشف التصوير في الوقت الفعلي عن أنماط هجرة ديناميكية للخلايا الضامة.
- تشير النتائج إلى أن مادة الكيموكين تلعب دوراً مهماً في جذب الخلايا الضامة.
- أظهرت مزايا استخدام الأسماك الزردية لمثل هذه الدراسات.
الاستنتاجات
- تسلط الدراسة الضوء على أهمية النماذج الحية لفهم كيمياء الخلايا.
- قد تفيد النتائج في البحوث المستقبلية حول الاستجابات المناعية.
- يمكن استخدام الأسماك الزردية لتعزيز دراسة سلوك الخلايا في بيئة معقدة.
الأسئلة المتداولة
Executive Industry Relevance
Direct in vivo modeling of chemokine-driven macrophage recruitment addresses a critical gap in translational immunology by enabling quantitative, real-time analysis of cell migration within a physiologically relevant context. This zebrafish-based workflow supports predictive confidence in target validation and de-risks early discovery decisions by providing robust, quantitative outputs on immune cell behavior. The approach enhances portfolio triage by clarifying the functional impact of chemokine modulation in a living system.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables functional interrogation of chemokine targets in a live vertebrate system.
- Supports biological de-risking by revealing in vivo cell migration dynamics.
- Provides quantitative evidence for target engagement and pathway relevance.
- Facilitates predictive confidence in advancing chemokine-modulating assets.
Screening & Assay Development
- Establishes validated, fluorescently labeled macrophage models for downstream screening.
- Delivers reproducible, quantitative readouts of cell recruitment and localization.
- Supports assay standardization for compound evaluation targeting chemotaxis pathways.
- Enables scalable imaging workflows for comparative analysis across conditions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vivo cell migration data with disease-relevant immune mechanisms.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation of chemokine function.
- Supports risk-adjusted advancement by linking mechanistic findings to translational endpoints.
- Facilitates biomarker identification for immune cell recruitment in disease models.
Pipeline & Workflow Integration
This ectopic chemokine expression model integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling hypothesis-driven testing of immune cell recruitment in vivo, supporting both target validation and lead identification stages.
- Discovery Biology: Quantifies macrophage migration in response to chemokine overexpression, clarifying pathway function.
- Screening: Provides standardized, reproducible imaging and cell counting outputs for assay development.
- Analytics: Enables statistical comparison of cell numbers and localization between experimental groups.
- Translational Research: Bridges mechanistic insights to disease-relevant immune responses in vertebrate models.
- Enterprise Reuse: Adaptable to other chemokines and immune cell types for broader portfolio application.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in chemokine target validation and reduces mechanistic ambiguity.
- Operational Value: Delivers standardized, scalable, and reproducible in vivo imaging workflows.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and enhances capital efficiency by clarifying biological risk early.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of immune-modulating candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in zebrafish transgenesis and live imaging techniques.
- Demands access to confocal microscopy and quantitative image analysis infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization of labeling, imaging, and quantification protocols.
- Adaptable to other immune cell types and chemokines with appropriate transgenic lines.
- Dependent on precise timing and tissue selection for optimal observation windows.
