فحص وتحديد الببتيدات الصغيرة التي تستهدف عامل نمو الخلايا الليفية Receptor2 باستخدام مكتبه الببتيد العرض Phage

بالمقارنة مع الأساليب الأخرى، هذا البروتوكول هو أسهل لمعرفة الخصوم جديدة، ناهضات، والتعديلات allosteric كما ونوعيا دون معرفة هيكل هيدرو تمييع وتشكيل البروتين المستهدف. هذا البروتوكول هو عالية الكفاءة، وسهلة للتعامل، والاقتصادية، والمتاحة تجاريا. الجمع بين هذا الأسلوب الفرز الإنتاجية العالية مع تحليل مركز تكنولوجيا المعلومات، يمكن الحصول على الببتيدات الصغيرة الوظيفية كما ونوعيا.

وسوف يكون إثبات الإجراء يينغ تشاو ووانغ تشيانغ، طلاب الدراسات العليا من مختبرنا. لبدء هذا الإجراء، وإعداد حل من FGFR2 في العازلة طلاء بتركيز 10 ميكروغرام لكل ملليلتر. إضافة ملليلتر واحد من الحل إلى طبق 35 سم مربع ودوامة مرارا وتكرارا حتى السطح الرطب تماما.

احتضان بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية مع اهتزاز. في اليوم التالي، صب قبالة حل الطلاء وإضافة حل مانع المعدة. احتضان في أربع درجات مئوية لمدة ساعة واحدة على الأقل، ثم تجاهل محلول الحجب وغسل لوحة بسرعة ست مرات مع TBST مع التأكد من أن الطبق لا تجف.

إعادة إنشاء مكتبة phage الأصلي في ملليلتر واحد من TBST وإضافة هذا إلى الطبق المغلفة. صخرة بلطف لوحة على شاكر في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين. بعد ذلك، تجاهل المابير وغسل الطبق 10 مرات مع TBST.

Elute phage ملزمة عن طريق إضافة ملليلتر واحد من 0.2 المولى الجليسين HCL إلى الطبق وهزاز بلطف في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. نقل eluent إلى أنبوب microcentuge تعقيم وتحييد مع 100 ميكرولترات من واحد المول تريس-HCL في 9.1 pH. أولاً، قم بتعبئة لوحات LB و IPTG X-Gal المعدة عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة على الأقل قبل الاستخدام.

باستخدام نصائح ماصة مع خراطيش تصفية، وإعداد 100 ميكرولترات من 10 ضعفا من التخفيف من الوميض في LB. بعد أن تصل ثقافة E.coli المعدة إلى مرحلة منتصف السجل ، استغن 200 ميكرولترات من الثقافة إلى أنابيب microcentuge معقمة واحدة لكل تخفيف eluent. لبدء العدوى، إضافة 50 ميكرولترات من كل تخفيف إلى الأنابيب التي تحتوي على ثقافة الإشريكية القولونية. دوامة بسرعة واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق.

ثم استخدام الطلاء العصي لمعطف لوحات LB و IPTG X-GAL مع 90 ميكرولترات من هذا الخليط. بعد خمس دقائق، عكس اللوحات واحتضانها بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية. عد اللويحات عندما تظهر.

للبدء، تمييع ثقافة بين عشية وضحاها في 20 ملليلتر من LB في قارورة Erlenmeyer 250 ملليلتر. إضافة eluent unamplified واحتضان في 37 درجة مئوية مع اهتزاز قوية لمدة 4-1/2 ساعات. بعد ذلك، الطرد المركزي في 12،000 مرات G وأربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق.

نقل المُنَتَكّل إلى أنبوب جديد. أجهزة الطرد المركزي مرة أخرى باستخدام نفس الشروط والتخلص من بيليه. نقل 80٪ العليا من عظمى إلى أنبوب جديد وإضافته إلى حجم 1/6th من 20٪ البولي ايثيلين جلايكول و 2.5 كلوريد الصوديوم المولر.

السماح phage للعجلة بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية. في اليوم التالي، الطرد المركزي الفاج المُعجَّل في 12,000 مرة G وأربع درجات مئوية لمدة 15 دقيقة. تخلص من المُتفوّك والطرد المركزي مرة أخرى باستخدام نفس الشروط.

استخدام ماصة لإزالة فائقة المتبقية. Resuspend بيليه في ملليلتر واحد من TBS ونقل سوبرانت إلى أنبوب microcentrifuge. جهاز طرد مركزي في 12،000 مرة G وأربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق.

نقل سوبرنات إلى أنبوب الطرد الدقيق الطازج ويترسب مرة أخرى بإضافة 1/6 حجم من 20٪ البولي ايثيلين جلايكول و 2.5 كلوريد الصوديوم المولار. احتضان على الجليد لمدة 15 إلى 60 دقيقة. بعد ذلك، الطرد المركزي في 12،000 مرة G وأربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق.

تخلص من المُتفوّك والطرد المركزي مرة أخرى باستخدام نفس الشروط. استخدام ماصة لإزالة فائقة المتبقية. إعادة تعليق بيليه في 200 ميكرولترات من TBS والطرد المركزي لمدة دقيقة إضافية لإزالة الشوائب.

ثم نقل سوبرنات إلى أنبوب جديد microcentuge للحصول على eluent تضخيمها. في هذه الدراسة، يتم الاحتفاظ بعدد المدخلات phage دون تغيير في حين يتم تقليل تركيز الطلاء من بروتين FGFR2 تدريجيا. وتشير نتائج الـ phage titer إلى أن عدد الففاج المتعافى يزداد تدريجياً وأن هناك زيادة بمقدار 65 ضعفاً بعد ثلاث جولات مقارنة بالجولة الأولى.

ثم يتم إجراء تجربة مركز هتك لقياس تقارب الببتيد الصغير إلى FGFR2. وتشير النتائج إلى أن الببتيد SP1 لديه تقارب عالية نحو FGFR2. وتبين هذه البيانات كفاءة بروتوكول الفرز.

للتحقيق في النشاط البيولوجي للببتيد SP1 ، يتم إجراء مقايسة انتشار ليفي باستخدام مجموعة CCK-8. BALB/C3T3 هي محتضنة مع الببتيد SP1 بتركيزات مختلفة. وتشير النتائج إلى أن ببتيد SP1 يقمع نمو الخلايا.

التلوث بالـ(فاغ) من النوع البري يجب تجنبه هنا تأكد من استخدام نصائح الماصات المقاومة للهباء الجوي. في حين أن النمو من خلال الحصول على phage التضخيم.

ويمكن أيضا أن تستخدم هذه العملية في فحص الببتيدات الصغيرة التي ترتبط الكربوهيدرات, الخلايا الثقافية, والأنسجة. يمكن أن تكون هذه الببتيدات تضخيمًا إضافيًا على التشخيص والمستهدف