إنشاء الثقافات المشتركة القائمة علي خليه واحده بطريقه قطعيه مع رقاقه ميكروفلويدريك
سبتمبر 27, 2019
يصف هذا التقرير أسلوبا قائما علي الرقاقات الصغيرة لاعداد تجربه ثقافة خليه واحده يمكن فيها تحقيق الاقتران العالي الكفاءة والتحليل المجهري للخلايا المفردة المتعددة.
من الضروري الجمع بين فعالية فعالية التقاط الكفاءة مع دينامية مراقبة صورة الخلية الحية لفهم تأثير تفاعل الخلية الخلية على سلوك الخلية. هذا الأنبوب يمكن التقاط بكفاءة عالية متعددة خلايا واحدة في غرفة أكبر، وتوفير قاعدة الثقافات الكافية، لتتبع دينامية من عدة السلوكيات التفاعل خلية واحدة. ابدأ بإعداد جهاز PDMS.
ضع قالب رقاقة في طبق وزنها مع 100 ميكرولترات من ثلاثي الكلوروسلين في مجفف وتطبيق فراغ لمدة 15 دقيقة. وقف الفراغ وملوحة قالب رقاقة في مجفف في 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة على الأقل. اخلطي قاعدة PDMS وعامل المعالجة PDMS بنسبة عشرة إلى واحد ، ثم صب ما مجموعه 20 جرامًا من الخليط على قالب الرقاقة في طبق طوله 15 سنتيمترًا.
ضع الطبق الذي يبلغ طوله 15 سنتيمترًا في مجففات وطبق فراغًا لمدة دقيقة ونصف. ثم إزالة الطبق من مجفف والقضاء على فقاعات الهواء المتبقية في PDMS مع غاز النيتروجين. علاج PDMS عن طريق وضع الطبق في فرن في 65 درجة مئوية لمدة ساعتين إلى أربع ساعات.
عند الانتهاء، إزالة النسخة المتماثلة PDMS من قالب رقاقة، ولكمة مدخل 1.5 ملليمتر و 0.5 ملليمتر منفذ على PDMS. قم بتنظيف النسخة المتماثلة PDMS و سطح الشريحة مع الشريط القابل للإزالة. علاج السطح مع البلازما الأكسجين.
ثم محاذاة النسخة المتماثلة PDMS مع الشريحة يدوياً وجعلها في اتصال مع بعضها البعض. اترك شريحة PDMS في الفرن 65 درجة مئوية ليوم واحد. في اليوم التالي، غمر جهاز PDMS في حاوية مليئة بـ PBS.
وضعه في مجفف، وتطبيق فراغ لمدة 15 دقيقة. نقل الجهاز إلى غطاء محرك السيارة ثقافة الخلية وتعقيمه مع ضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة 30 دقيقة. استبدل العازلة جهاز PDMS مع المتوسطة واحتضانه في أربع درجات مئوية ليوم واحد.
عندما تحقق الخلايا 70 إلى 80٪ التقاء، وإزالة المتوسطة الثقافة وغسلها بلطف ثلاث مرات مع خمسة ملليلتر من برنامج تلفزيوني. أضف ملليلتر واحد من متوسط DMEM/F-12 يحتوي على صبغة فلورية صغيرة واحدة إلى خلايا WNT5B sh4 وpLKO-GFP، واحتضانها لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد الحضانة، وغسل بلطف الخلايا ثلاث مرات مع خمسة ملليلتر من برنامج تلفزيوني عقيمة، وإزالة برنامج تلفزيوني، وإضافة ملليلتر اثنين من 0.25٪تريبسين-EDTA.
احتضان الخلايا لمدة أربع دقائق في درجة حرارة الغرفة، ثم الاستفادة بلطف طبق الثقافة لتعزيز مفرزة الخلية. إضافة أربعة ملليلتر من DMEM / F-12 المتوسطة لتفريق WNT5B sh4 وخلايا PLKO-GFP، ونقل الخلايا إلى أنبوب 15 ملليلتر والطرد المركزي لهم في 300 xg لمدة ثلاث دقائق. إزالة فائقة وبلطف إعادة تعليق بيليه الخلية في ملليلتر واحد من متوسطة DMEM /F-12.
إعداد ملليلتر واحد من تعليق الخلية بتركيز من ثلاثة أضعاف عشر إلى خمس خلايا لكل ملليلتر والاحتفاظ بها على الجليد لمنع تجميع الخلايا. توصيل أنبوب البوليتيترافلورو ايثيلين بين منفذ الجهاز ومضخة الحقنة. إزالة المتوسطة، وإضافة ميكرولتر واحد من تعليق الخلية المعدة في مدخل جهاز PDMS.
بعد ذلك، قم بتحميل تعليق الخلية في الجهاز باستخدام مضخة حقنة بمعدل تدفق 0.3 ميكرولترات في الدقيقة. أضف ميكرولتر واحد من متوسط DMEM/F-12 في مدخل الجهاز، ثم قم بتحميل الوسيط في الجهاز باستخدام مضخة حقنة. تحميل 0.3 ميكرولترات من DMEM/F12 المتوسطة في الجهاز مع مضخة حقنة بمعدل تدفق 10 ميكرولترات في الدقيقة الواحدة.
بعد تحميل الخلايا، وإزالة الأنبوب، وختم مدخل ومأخذ مع الشريط polyolefin لإنشاء نظام ثقافة مغلقة. نقل جهاز PDMS إلى طبق ثقافة 10 سنتيمترا وإضافة 10 ملليلتر من برنامج تلفزيوني عقيمة حول الجهاز لتجنب تبخر المتوسطة. نقل طبق الثقافة إلى حاضنة لثقافة خلية واحدة ثلاثية.
يحتوي جهاز PDMS على بنية ثلاثية الطبقات مع موقع التقاط يتصل بغرفة الثقافة وقناة الالتفاف. يسمح الاختلاف في مقاومة التدفق بين غرفة الثقافة وقناة الالتفافية الخلية بالتدفق إلى موضع الالتقاط، مما يؤدي إلى مرور الخلية التالية عبر قناة الالتفافية إلى موقع الالتقاط التالي. يتم استخدام خطوة الارتجاع لتحرير الخلية من موقع الالتقاط وإرسالها إلى غرفة الثقافة.
تم تقييم كفاءة التقاط الخلايا لهذا البروتوكول على ثلاثة أنواع مختلفة من الخلايا. الخلايا البطانية اللمفاوية البشرية، أو LECs، الإنسان سرطان الخلايا الحرشفية عن طريق الفم T2.6 الخلايا التي تعبر عن WNT5B محددة رنا دبوس الشعر القصير، وخلايا مكافحة ناقلات pLKO-GFP. وكانت كفاءة التقاط الخلية الواحدة للخلايا الثلاث المُثبتة حوالي 71٪ بالنسبة لـ LECs، و74٪ لخلايا WNT5B sh4، و78٪ لخلايا pLKO-GFP.
وكان ثلاثية خلية واحدة التقاط الكفاءة 48 ٪ يمكن استخدام هذه الطريقة لعدة خلية واحدة الثقافات المشتركة من الخلايا البطانية اللمفاوية والخلايا السرطانية الحرشفية ، ويمكن ملاحظة انتشار الخلية ومورفولوجيا تحت المجهر. من المهم التأكد من أن تعليق الخلايا المعدة لديها مجاميع الخلية الحد الأدنى، لأن مجاميع الخلية ليس فقط تقليل كفاءة الاقتران واحد، ولكن يمكن أيضا تسد القنوات الصغيرة. التفاعل بين الخلايا الخلوية بين الخلايا الفردية يلعب دوراً هاماً في التحكم في سلوكيات الخلية.
يمكن أن توفر طريقتنا أداة فعالة لمساعدة الباحثين على دراسة التفاعل بين الخلايا والخلية على مستوى خلية واحدة ، مما قد يؤدي إلى اكتشاف آليات جديدة لا يمكن الحصول عليها بسهولة من الدراسات السكانية.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
يصف هذا التقرير طريقة قائمة على شريحة ميكروفلويدية لإعداد تجربة زراعة خلية واحدة يمكن من خلالها تحقيق الاقتران عالي الكفاءة والتحليل المجهري لخلايا مفردة متعددة. تتيح الطريقة التتبع الديناميكي للتفاعلات بين الخلايا لفهم السلوكيات الخلوية بشكل أفضل.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلوم
- الميكروفلويدية
- زراعة الخلايا
- التفاعلات بين الخلايا
الخلفية
- فهم سلوكيات الخلايا أمر بالغ الأهمية للعديد من الدراسات البيولوجية.
- التفاعلات بين الخلايا تؤثر بشكل كبير على الوظائف الخلوية.
- هناك حاجة لتقنيات الملاحظة الديناميكية للتحليل في الوقت الحقيقي.
- يمكن أن تعزز الأجهزة الميكروفلويدية من كفاءة التقاط الخلايا المفردة.
هدف الدراسة
- تطوير طريقة للاقتران الفعال للخلايا المفردة.
- تمكين التحليل المجهري للتفاعلات الخلوية.
- تسهيل التتبع الديناميكي لسلوكيات الخلية المفردة.
الطرق المستخدمة
- إعداد جهاز PDMS لزراعة الخلايا.
- استخدام ثلاثي كلورو سيلان لعملية تمليح قوالب الرقائق.
- مزج قاعدة PDMS وعامل المعالجة لتصنيع الجهاز.
- التتبع الديناميكي للتفاعلات الخلوية في حجرة أكبر.
النتائج الرئيسية
- تتيح الطريقة كفاءة عالية في التقاط الخلايا المفردة المتعددة.
- يوفر التتبع الديناميكي رؤى حول سلوكيات التفاعل بين الخلايا.
- يكشف التحليل المجهري عن نتائج مهمة حول التفاعلات الخلوية.
- يعزز الإعداد الميكروفلويدي التحكم في التجربة والملاحظة.
الخلاصات
- الطريقة القائمة على الشريحة الميكروفلويدية فعالة لزراعة الخلايا المفردة.
- تمكن من التحليل المفصل للتفاعلات والسلوكيات الخلوية.
- يمكن أن يتقدم هذا النهج البحث في علم الأحياء الخلوية.
الأسئلة المتداولة
Executive Industry Relevance
This microfluidic platform addresses a key limitation in conventional co-culture systems by enabling deterministic single-cell pairing and real-time tracking of intercellular interactions. By overcoming population averaging effects, it provides mechanistic insights into heterogeneous cell behaviors relevant to cancer biology and stromal-tumor crosstalk. The approach supports early discovery workflows where precise cellular resolution improves target validation and de-risks translational hypotheses.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses at single-cell resolution, clarifying pathway-specific interactions between lymphatic endothelial and cancer cells.
- Operational Value: Reduces mechanistic ambiguity by isolating individual cell behaviors obscured in bulk co-culture assays.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream compound screening by establishing reproducible single-cell co-culture conditions.
- Operational Value: Enhances assay standardization through deterministic cell capture (~46% efficiency) and minimized reagent consumption via microfluidic confinement.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports disease-relevant modeling of oral squamous cell carcinoma-stromal interactions, enabling biomarker-aligned observations of migration and proliferation.
- Operational Value: Facilitates continuity from discovery to preclinical validation by maintaining phenotypic fidelity under controlled intercellular communication.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery pipelines by providing quantitative, single-cell-resolution data that informs lead identification and preclinical decision-making through direct observation of interaction-driven phenotypes.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling real-time imaging of defined cell pairs under controlled flow conditions.
- Screening: Delivers assay readiness through high-throughput single-cell trapping and stable culture chambers suitable for longitudinal monitoring.
- Analytics: Generates quantitative dependent variables such as migration tracks, proliferation rates, and morphological changes linked to specific interaction events.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by modeling human-relevant stromal-tumor interfaces in a scalable, reproducible format.
- Enterprise Reuse: Functions as a platform technology adaptable to multiple cell types, reducing redevelopment costs across discovery projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by de-risking mechanistic assumptions through direct single-cell observation.
- Operational Value: Improves reproducibility and scalability via standardized PDMS fabrication and syringe pump–driven loading, minimizing user-dependent variability.
- Strategic Value: Enhances go/no-go decisions by providing interaction-specific phenotypic readouts that reduce late-stage biological attrition.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on validated stromal-tumor communication mechanisms.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidic device fabrication, PDMS handling, and sterile cell culture techniques.
- Depends on access to syringe pumps, vacuum desiccators, plasma treatment systems, and fluorescence microscopy for dynamic tracking.
- Necessitates cross-team standardization of cell preparation protocols to prevent aggregation-induced clogging and ensure consistent capture efficiency.
- Involves adaptation considerations when extending to non-adherent or primary cell types due to differences in size, deformability, and surface adhesion.
- Practical limitations include the need for meticulous surface treatment to prevent biofouling and the constraint of chamber size on long-term culture duration.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:35
PDMS Device Preparation for Multiple Single Cell Capture
2:23
Preparation of a Single-cell Suspension
3:39
Multiple Single-cell Capture & Triple Single-cell Capture
4:48
Results: Single Cell Capture and Cell Co-culture in the Hydrodynamic Shuttling Chip
6:08
Conclusion
