بروتوكول تجميد السحق لمعالجه الكفوف الماوس لتقييم المسارات الجزيئية للالتهابات الانسجه في الكولاجين المستحثة نموذج التهاب المفاصل

تقييم الملامح الجزيئية في الأنسجة المحلية هو خطوة حاسمة لفهم آلية عمل المستحضرات الصيدلانية النشطة كما يتم تقييمها في النماذج قبل الفحص الطبية ذات الصلة بالأمراض. في مجال أبحاث التهاب المفاصل، والبيئة الأنسجة المحلية من الفائدة هي المفاصل الصغيرة التي تحمل الوزن والتي تتكون من خليط معقد من العظام والغضاريف والعضلات والخلايا المناعية. هنا نحن وصف طريقة قوية موثوق بها لتعطيل الميكانيكية و / أو السحق من هذه البيئة الأنسجة المعقدة في بيئة تسيطر عليها بالتبريد.

ويمكن بعد ذلك استخدام هذه الطريقة لتوليد جهود التنميط البروتومية والنسخية المصبية لإنشاء التواقيع الجزيئية للمرض من مصدر عينة موحد واحد. هذه الطريقة تولد مسحوق متجانس على عكس العديد من التقنيات القديمة الأخرى. بالإضافة إلى ذلك، يسمح الإجراء القديم لعزل درجة الحرارة لعزل الحمض النووي الريبي عالي الجودة.

ويمكن بعد ذلك استخدام هذه الطريقة لتوليد التنميط البروتومي والمنسخ في المصب مما يتيح التوصيف الجزيئي لمسارات المرض ذات الصلة ذات الصلة. هذه الطريقة يمكن أن توفر رؤى لأي مجال البحوث التي يتم اشتقاق التواقيع الجزيئية من الأنسجة. ويمكن توسيع هذه الطريقة إلى أي نظام الأنسجة المعقدة التي لديها كثيفة ويصعب فصل المكونات.

على الرغم من أننا لم تقيم حتى هذه اللحظة، يمكن أن نرى التطبيق المحتمل للأنسجة الغضروف الكثيفة مثل الأذنين أو العظام. الطبيعة الحرجة للوقت لنقل المسحوق إلى أنابيب لوزن هو شيء يأخذ الممارسة. إذا أخذ الكثير من الوقت، سيبدأ المسحوق في الذوبان ويصبح غير متبلور.

من المهم أن تحد من عدد العينات إلى 10 إلى 15 حتى تكون مرتاحًا للإجراء. في يوم تجهيز الأنسجة، prechill جميع الأدوات اللازمة على الجليد الجاف لمدة لا تقل عن 10 دقيقة. ارتداء قفازات حرارية لتجنب التعرض للأذى من البرد القارس.

المقبل, نقل كل من مخلب الماوس المعدة في أنبوب 1.5 ملليلتر microcentuge منفصلة وعلى الفور المفاجئة تجميد في النيتروجين السائل. تخزين الكفوف المجمدة في درجة حرارة سالبة 80 درجة مئوية. عندما تكون جاهزة للمتابعة، املأ مطحنة الفريزر بالنيتروجين السائل ودعها توازن لمدة 10 دقائق على الأقل.

ضع العينة غير المجهزة على الجليد الجاف واحفظها هناك لتجنب دورات التجميد/الذوبان. ثم نقل مخلب واحد هند إلى قارورة كبيرة قبل المبردة البولي طحن مع قابس الصلب السفلي. إدراج آثار الصلب قبل المبردة وإغلاق قارورة طحن البولي مع المكونات الصلب الأعلى قبل المبردة.

نقل قوارير كبيرة طحن البولي مع العينات في طاحونة الفريزر المعبأة مسبقا وإغلاق الغطاء مع المشبك المطاطي وجدت في الجزء الأمامي من الصك. السماح للعينات تبرد في النيتروجين السائل لمدة دقيقة واحدة. بعد ذلك، قم بتعيين مطحنة التجميد إلى برنامج دقيقة واحدة مع 10 دورات في الثانية.

اضغط على زر التشغيل وانتظر حتى مطحنة التجميد لإكمال دورته. بعد ذلك، افتح غطاء مطحنة الفريزر واخرج قارورة الطحن البولي كبيرة. ضع قارورة الطحن في مستخرج وقم بإزالة قابس الصلب العلوي عن طريق الضغط النزولي على المقبض الأسود حتى ينزلق مقبس الصلب من أنبوب البولي.

نقل قارورة طحن مفتوحة على الجليد الجاف واستخدام ملقط قبل المبردة لإزالة آثار الصلب. نقل مسحوق المجمدة إلى ما قبل المبردة 50 ملليلتر أنبوب مخروطي. تزن ما بين 30 و 50 ملليغرام من مسحوق المجمدة في المستويات 1.5 ملليلتر ميكروسنتريفوغ أنبوب لاستخراج الحمض النووي الريبي وبين 100 و 200 ملليغرام لاستخراج البروتين.

تخزين العينات المسحوقة في درجة حرارة سالبة 80 درجة مئوية والمضي قدما في الجيش الملكي النيبالي وعزل البروتين في غضون 24 ساعة. أولا، إضافة 10 ميكرولترات من بيتا-mercaptoethanol لكل ملليلتر من RLT العازلة. حساب حجم RLT العازلة المقابلة لنسبة 23.3 ملليلتر لكل ملليغرام من الأنسجة وإضافة الحجم المناسب من RLT العازلة مع بيتا mercaptoethanol إلى الأنبوب مع مسحوق المجمدة.

دوامة العينة في 3،000 دورة في الدقيقة لمدة 10 ثوان. استخدام 1 ملليلتر أنبوب إلى ماص صعودا وهبوطا بقوة 10 مرات ودوامة العينة مرة أخرى في 3، 000 دورة في الدقيقة لمدة 20 ثانية. أجهزة الطرد المركزي في 13،000 مرات ز لمدة دقيقتين ونقل 700 ميكرولترات من عظمى إلى أنبوب جديد.

إضافة 700 ميكرولترات من 70٪ الإيثانول لهذا الأنبوب وتحميل 700 ميكرولترات من العينة على عمود تنقية الجيش الملكي النيبالي. الطرد المركزي الأنبوب بسرعة لا تقل عن 10،000 مرات ز لمدة 30 ثانية. تجاهل التدفق من خلال وتحميل الجزء المتبقي من العينة على العمود RNeasy والطرد المركزي الأنبوب مرة أخرى بسرعة لا تقل عن 10،000 مرة ز لمدة 30 ثانية.

تجاهل التدفق من خلال وغسل العمود عن طريق إضافة 700 ميكرولترات من العازلة RW1 وrrifuging ما لا يقل عن سرعة 10، 000 مرة ز لمدة 30 ثانية. إذا كان أداء خيار DNAse الهضم, 350 microliters من RW1 يضاف قبل العلاج DNAse. وبعد العلاج DNAse، يضاف 350 ميكرولترات إضافية من RW1.

ثم غسل العمود مرتين عن طريق إضافة 500 ميكرولترات من RPE العازلة والطرد المركزي بسرعة لا تقل عن 10،000 مرات ز لمدة 30 ثانية مع التأكد من التخلص من تدفق من خلال كل مرة. بعد ذلك، قم بتجفيف العمود عن طريق الطرد المركزي بسرعة لا تقل عن 10,000 مرة ز لمدة دقيقتين. Elute الجيش الملكي النيبالي عن طريق إضافة 50 ميكرولترات من الماء وsuguging بسرعة لا تقل عن 10، 000 مرات ز لمدة دقيقتين.

جمع تدفق من خلال ونقلها إلى أنبوب جديد 1.5 ملليلتر. تحديد كمية الحمض النووي الريبي باستخدام طريقة الباحث في الاختيار وتخزينها عند درجة حرارة سالبة 80 درجة مئوية قبل إجراء المزيد من التحليل. تمييع 10X خلية محلول الأسهم تحلل ل1X خلية محلول الأسهم تحلل مع المياه الصف ثقافة الخلية.

إعادة تشكيل كوكتيل مثبطات البروتياز تعيين واحد مع ملليلتر واحد من الماء لجعل مخزون مثبطات البروتياز 100X. إضافة 100 ملليلتر من مثبطات البروتياز إلى 9.9 ملليلتر من 1X خلية تحلل العازلة للحصول على حل الأسهم النهائية 1X. إضافة أربعة microliters من الجليد الباردة الخلية العازلة لتحلل كل ملليغرام من مسحوق الأنسجة وإضافة واحد خمسة ملليمتر حبة الفولاذ المقاوم للصدأ إلى الأنبوب.

دوامة الأنبوب في 3،000 دورة في الدقيقة لمدة 60 ثانية. نقل أنبوب إلى الثلج الرطب والاستمرار في العينة التالية. بالإضافة إلى ذلك، قد يجد الباحثون أن وضع مربع عمودي يمكن أن تسهل أفضل خلط مع حبة.

بعد ساعة واحدة، الطرد المركزي الأنابيب في 10،000 مرات ز وعند أربع درجات مئوية لمدة 15 دقيقة. نقل اابر في أنبوب جديد مع التأكد من تجنب طبقة الدهون على القمة. تحديد تركيز البروتين الكلي.

Aliquot كل عينة في أنابيب microcentuge 1.5 ملليلتر وتخزينها في درجة مئوية سلبية 80 حتى تصبح جاهزة لإجراء مزيد من التحليل. في هذه الدراسة، يتم استخدام طريقة السحق المبردة لمعالجة الكفوف مورين من أجل تحسين العائد ونوعية الحمض النووي الريبي أو البروتين المستخرج من الأنسجة وتمكين تحليل ملامح الجزيئية المرتبطة الاستجابات الالتهابية. تصور صورة هلام تمثيلي يظهر الحمض النووي الريبي المستخرج من الكفوف الأمامية من الفئران وكالة المخابرات المركزية.

28S rrna و 18S rRNA العصابات تشير إلى أن جميع العينات لديها كمية كافية من الحمض النووي الريبي سليمة. تظهر هنا مؤامرة مبعثرة تمثيلية لتركيزات البروتين الإجمالية استنادًا إلى تحليل البروتين BCA. تركيزات البروتين الكلي من الفئران الساذجة، فئران وكالة المخابرات المركزية، أو فئران وكالة الاستخبارات المركزية تحت علاجات مختلفة قابلة للمقارنة عبر المجموعات.

ثم يتم إجراء تحليلات Luminex لتحديد تركيزات السيتوكينات الالتهابية وكيموكينات في مستخلص البروتين. مؤامرة مبعثرة تمثيلية لتركيزات السيتوكينات المطبعية و chemokines يكشف أنه بالمقارنة مع الفئران الساذجة ، يتم رفع العديد من السيتوكينات في الفئران وكالة المخابرات المركزية والعلاج مع الأجسام المضادة IL17A يمنع بشكل كبير إنتاج العديد من السيتوكينات. يتم إجراء تحليل Microarray لتقييم التغيرات في النسخ في وكالة المخابرات المركزية والآثار المتعلقة بالعلاج.

تظهر هنا خريطة حرارية تمثيلية للجينات زادت بشكل كبير في فئران وكالة الاستخبارات المركزية مقارنة بالفئران الساذجة. عند إجراء هذا الإجراء ، من المهم للباحثين تقليل الوقت الذي يتم فيه الاحتفاظ الأنبوب والمسحوق خارج الجليد الجاف. وهذا يساعد على منع ذوبان المسحوق والمشاكل اللاحقة للرنا والبروتين المتدهورة.

تتيح الجودة العالية للتوقيعات الجزيئية الناتجة عن هذه التقنية للباحثين استجواب الملف الفريد الذي ينقله العلاجي ويسمح أيضًا بالتمايز بين الآليات التي يمكن استخدامها لعلاج الحالات التهاب المفاصل. ويمكن استخدام هذه التقنية لاستخراج عدد من الأنسجة الكثيفة مثل الأذنين والعظام لتقييم المزيد من التواقيع الجزيئية في هذه الأنسجة ذات الاهتمام. فهم كيف تُعدل العلاجات التواقيع الجزيئية للمرض يمكننا من تقييم مسارات الإشارات المحددة بشكل أفضل.

وربما الأهم من ذلك، ما هي المسارات التي لا يتم تنظيمها مع الآلية العلاجية التي يتم تقييمها. عند العمل مع النيتروجين السائل والجليد الجاف، لا بد من استخدام معدات الحماية الشخصية بما في ذلك القفازات ودروع الوجه ذات التصنيف الصحيح. يمكن أن يسبب التعرض للجلد لأكثر من بضع ثوان حروقًا شديدة.

عند العمل مع كميات كبيرة من الجليد الجاف، من المهم أن تعمل في منطقة جيدة التهوية كما الجليد الجاف النشرات ثاني أكسيد الكربون.