القياس الكمي للتجديد الذاتي في ثقافات Murine ماموسفيري

لذلك توفر ثقافات المموسفير نظامًا حركيًا يسهل الوصول إليه لدراسة وتشريح الجوانب الهامة من السلوكيات الطبيعية في الخلايا الجذعية السرطانية للثدي ، بما في ذلك قدرتها على تجديد الذات والتمييز. يهدف منهجنا الكمي إلى تقييم معدل نمو الثقافات المامومورية بطريقة موضوعية، مما يسمح بإجراء مقارنة مباشرة بين مختلف أنواع الخلايا وظروفها. للتجربة الأولى، أنصح الحفاظ على رقابة مشددة على أوقات الحضانة لتجنب أكثر من الهضم وضمان العد دقيقة الخلية قبل كل الطلاء.

إثبات الإجراء مع (شارولايز بول) سيكون (إيريكو داليا)، فني من مختبري. بعد حصاد أربعة غدد الثدي الصدرية البطنية والسفلى من 5 إلى 30، 8 إلى 10 أسابيع الفئران الإناث القديمة، وضع ما يصل إلى 20 الغدد لكل 100 ملليمتر بتري طبق في حجم الحد الأدنى من DPBS. المفروم الأنسجة إلى قطع أصغر وإضافة 10 ملليلتر من وسط الجهاز الهضمي إلى شظايا.

استخدام ماصة المصلية 25 ملليلتر لنقل قطع الأنسجة إلى أنبوب مخروطي 50 ملليلتر وختم الأنبوب مع فيلم البارافين. ثم احتضان الشظايا على دوار في 0.03 X G لمدة 2 1/2 ساعة في 37 درجة و 5٪ ثاني أكسيد الكربون مع الرطوبة. في نهاية الحضانة، إذا كان يمكن تمرير جميع الشظايا من خلال طرف ماصة P1000، الرواسب الطين الأنسجة عن طريق الطرد المركزي وdedeantant بعناية عظمى.

إعادة تعليق بيليه في 3 ملليلتر من برنامج تلفزيوني وتصفية محتويات أنبوب بالتتابع من خلال واحد 100، 170، 140 ميكرومتر مصفاة الخلية في أنبوب مخروطي جديد، وغسل كل مصفاة مع 2 ملليلتر من DPBS جديدة بعد كل مرشح. بيليه الخلايا عن طريق الطرد المركزي وdedeant إعادة إيقاف الخلايا في DPBS المتبقية. خلط الخلايا مع حجم متساو من كلوريد الأمونيوم البوتاسيوم تحلل العازلة وتحلل خلايا الدم الحمراء على الجليد لمدة تصل إلى 5 دقائق.

في نهاية الحضانة ، قم باعتقال التحلل مع 10 ملليلتر من DPBS وجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي. تأكيد وجود بيليه بيضاء وإعادة تعليق بيليه في 1 إلى 5 ملليلتر من متوسطة مامومور للعد. ثم لوحة الخلايا على غير الأنسجة ثقافة المعالجة التصاق منخفضة جدا ستة لوحات جيدا في 2 × 10 إلى الخلايا الخامسة القابلة للحياة لكل ملليلتر من تركيز متوسط مامومور لاحتضان 7 إلى 10 يوما في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.

في نهاية ثقافة 7 إلى 10 أيام، وجمع اللامموسفيرات الأولية من كل بئر من لوحة ثقافة الخلية والرواسب mammospheres بواسطة cetrifugation. بعد decanting supernatant ، استخدم ماصة P200 مع طرف مصفى إلى ماموسفيرات ماmosphes حوالي 100 مرة. إن توليد المرضى من الخلايا المفردة أمر بالغ الأهمية بالنسبة للكمية الدقيقة لخلية الماموفير للحصول على قدرة جديدة.

فحص بصريا مدى الفصل واستخدام مصفاة الخلية إذا لزم الأمر. إعادة تعليق mammospheres تفكيكها مع 1 إلى 5 ملليلتر من 1 إلى 5 ملليلتر من طازجة ممومور المتوسطة للعد وطبقة 2 X 10 إلى الخلايا الرابعة القابلة للحياة لكل ملليلتر على البوليهيما المغلفة التصاق منخفضة جدا ستة لوحات جيدا لثقافة 5 إلى 7 أيام. ثم، بعد 5 إلى 7 أيام، عد عدد من المجالات في البئر.

في نهاية كل مقطع، استخدم كاميرا رقمية مثبتة على منظار مجسم لمسح السطح بأكمله لجميع الآبار لتصوير المجالات. بعد حفظ الصور، كملفات tif، قم باستيراد صور المنظار المجسم كتسلسل صورة في ImageJ وتعيين المقياس ونوع الصورة إلى 8 بت. تكرار رزمة الصور وحدد طرح الخلفية من علامة التبويب معالجة.

تحقق من خيارات الخلفية الخفيفة والانزلاقات القطعية الإضافية وانقر فوق موافق لمعالجة جميع صور المكدس. حدد ضبط وعتبة من علامة التبويب صورة وانقر فوق تطبيق. ستظهر نافذة منبثقة.

حدد الافتراضي كـ الأسلوب والضوء كخلفية. تحقق من حساب عتبة لكل صورة مربع وانقر فوق موافق. لمعالجة كافة الصور في المكدس، حدد مستجمعات المياه وانقر فوق نعم. حدد فتح وانقر فوق نعم وحدد تآكل وانقر فوق نعم.

بعد ذلك، حدد تحليل الجسيمات من القائمة تحليل وتعيين الحد الأدنى لحجم العتبة في 10، 000 ميكرومتر مربع و دائري بين 0.50 و 1.00. حدد الخيار علامات الحذف من القائمة المنسدلة إظهار ثم تحقق من تلخيص، استبعاد على الحواف، وعرض في الموقع. ثم انقر فوق موافق لمعالجة كافة الصور المكدس.

لحساب منحنى النمو التراكمي لكل مرور تسجيل عدد الخلايا مطلي وعدد الخلايا في المجالات التي يتم حسابها في البئر وحساب حجم الكرة في نهاية كل مرور. يستنتج عدد من المجالات مطلي، بقسمة عدد الخلايا مطلي لكل مرور على حجم المجال تحسب في نهاية المقطع السابق. حساب رقم الخلية التراكمي لكل بئر لكل مرور ورقم المجال التراكمي لكل بئر لكل مرور و رسم نقاط البيانات على مقياس شبه لوغاريتمي.

ثم خط اتجاه أسي إلى نقاط البيانات وحساب معامل التصميم لقياس الخير من صالح. ثم تصور معادلة خط الاتجاه كدالة أسية طبيعية لاستنتاج معدل نمو الثقافة. في هذه التجربة، تم تحديد المجال وأرقام الخلايا من خمسة مقاطع متتالية، لثلاث تجارب مستقلة.

هنا في الخلية التراكمية وأرقام المجال لكل مرور تظهر. كما لوحظ تفعيل Myc ، يؤدي إلى زيادة معدلات نمو الكرة والخلايا. يمكن اختيار نقاط زمنية بيولوجية وملائمة لجمع الخلايا أو لإجراء تحليل التعبير الجيني أو الأصول الوظيفية الأخرى لتقييم تمايز الخلايا، والهجرة، والغزو.

هذا هو نهج بسيط وفعال من حيث التكلفة مع تطبيقات متعددة. على سبيل المثال، يمكن استخدامه في الاكتشاف المباشر لقياس الآثار على انتشار الخلايا الجذعية السرطانية والتجديد الذاتي.