الكشف عن سرطان المبيض باستخدام الضوئية تدفق الصوتية الخلوية

يتم تقديم بروتوكول للكشف عن الخلايا السرطانية المبيضة المتداولة باستخدام نظام تدفق الصوتية التصويرية حسب العرف والمستهدفة النانويه كبريتيد النحاس المغطي بحمض الفوليك.

التدابير السريرية الحالية للكشف عن سرطان المبيض غير محددة، وعدم وجود نقطة الكشف عن الرعاية من الخلايا السرطانية تعميم. نظام التدفق الضوئي الصوتي يتيح اختبار عينات المريض لعلامات سرطان المبيض المحددة في مجرى الدم. يوفر هذا الإجراء تقنية منصة فريدة مع تحسينات على التقنيات الحالية من حيث البساطة، وانخفاض التكلفة، والحدود الواعدة للكشف، والقدرة على تطبيقها على تطبيقات واسعة.

من خلال هذا العمل، ونحن نهدف إلى بناء الخروج من نظامنا الجسيمات النانوية المستهدفة لسرطان المبيض لاختبار عينات المرضى الجسم الحي السابق لCTCs. هذا النظام متعدد الاستخدامات لـ PAFC قادر على التوسع للاستخدام السريري ، واختبار وجود مجموعة واسعة من المؤشرات الحيوية في الدم. المحاذاة البصرية السليمة أمر بالغ الأهمية للكشف عن الأهداف داخل نظام تدفق الألياف الضوئية.

وعلاوة على ذلك، لضمان اقتران الصوتية السليم، تأكد من عدم وجود فقاعات بين الشريحة الزجاجية و محول. بسبب الطبيعة المخصصة لنظام التدفق ومكوناته ، فإن التصور للأسلوب مفيد لاستنساخ دقيق. في غطاء الدخان الكيميائي التهوية، فلتر حوالي 300 ملليلتر من المياه ذات الأيونات من خلال مرشح معقم 0.2 ميكرومتر.

إضافة 0.0134 غرام من كلوريد النحاس و 100 ملليلتر من المياه ديونيد إلى قارورة قاعية مستديرة 250 ملليلتر نظيفة لإنشاء محلول كلوريد النحاس ملليمولار واحد. أضف 0.015 جرام من حمض الفوليك إلى القارورة واستخدم شريطًا مغناطيسيًا لخلط المحلول لمدة خمس دقائق تقريبًا. ثم مزيج 0.024 غراما من كبريتيد الصوديوم nonahydrate مع 100 ميكرولترات من المياه الأيونية.

استخدام ماصة 200 ميكرولتر لإضافة ببطء هذا الحل إلى خليط التفاعل على مدى مدة 10 ثانية تقريبا. اِكب وعاء التفاعل وضع السفينة في حمام النفط تعيين إلى 90 درجة مئوية ومواصلة التحريك.

بعد حوالي 15 دقيقة أو عندما وصل حمام الزيت إلى نطاق درجة الحرارة بين 85 و 90 درجة مئوية ، اسمح لتفاعل العمل لمدة ساعة إضافية. عندما يكون رد الفعل كاملاً، قم بإزالة وعاء التفاعل من حمام الزيت واتركه يبرد في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 إلى 15 دقيقة قبل نقله إلى حمام جليدي. بمجرد تبريد التفاعل ، قم بضبط درجة PH إلى حوالي 10 باستخدام هيدروكسيد الصوديوم الضرس.

يضاف الخليط إلى عمود الطرد المركزي 30 كيلودالون في دفعات 15 ملليلتر والطرد المركزي في 3، 082 مرات ز لمدة 15 دقيقة لتنقية خليط التفاعل. أولاً، اخلطي جسيمات كبريتيد كبريتيد النحاس في تركيز مناسب في وسائل الإعلام الطازجة في مجال الـ RPMI. أضف محلول الجسيمات النانوية هذا إلى كل بئر من الصفيحة المعدة التي تحتوي على خلايا SK-OV-3 بتركيز 400 ميكروغرام لكل ملليلتر.

احتضان في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة ساعتين. بعد ذلك، تبسينيزي الخلايا مع 0.5 ملليلتر من 0.25٪ التربسين وEDTA. لتحييد التربسين، إضافة ما لا يقل عن ملليلتر من حمض الفوليك خالية من الأحماض RPMI 1640 كاملة وسائل الإعلام النمو والطرد المركزي الخلايا في 123 مرات ز لمدة ست دقائق.

لغسل الخلايا، وإزالة فائقة، resuspend الخلايا في مليلترين من برنامج تلفزيوني والطرد المركزي في 123 مرة ز لمدة ست دقائق. كرر هذه الخطوة غسل مرتين لإزالة أي جسيمات نانوية غير منضمة. ثم إعادة تعليق الخلايا مع 1-2 ملليلتر من حل توين 2٪ في برنامج تلفزيوني.

عد الخلايا باستخدام مقياس الهيموسيتات ودربان الأزرق. تمييع الخلايا في محلول من 2٪ توين في برنامج تلفزيوني لتركيز المختار للكشف. استخدم ملف STL ثلاثي الأبعاد لطباعة خزان التدفق باستخدام أي من البلاستيك الحراري ABS أو PLA.

بعد طباعة الخزان، وتنظيف وتجميع النظام للاستخدام. مكان الزجاج يغطي على مدى ملليمتر واحد من ثلاثة ملليمتر فتحة وثقب سنتيمتر واحد في نظام التدفق وختم بعناية مع السيليكون لمنع التسرب. بعد ذلك ، تناسب أنبوب الشعيرات الدموية في أنابيب السيليكون الشفاء.

أدخل الأنابيب في غرفة التدفق من جانب خزان التدفق بحيث يكون أنبوب الشعيرات الدموية الزجاجي فوق وأمام فتحة الثلاثة ملليمترات والثقب سنتيمتر واحد. ختم الأنابيب مع السيليكون. ثم قم بتوصيل محول إلى نبض الموجات فوق الصوتية والمتلقي.

تضخيم الإشارة مع كسب 59 ديسيبل. قم بتوصيل مخرجات المرشح بمنظار قابل لإعادة التشكيل متعدد الأغراض مزود بمصفوفة بوابة مضمنة قابلة للبرمجة في الحقل. قم بتوصيل أحد الأنابيب القادمة من غرفة التدفق إلى تقاطع T المتصل بمضخات حقنتين في كل فرع.

تعبئة واحدة من مضخات حقنة مع الهواء ومضخة أخرى مع العينة التي سيتم تحليلها. تعيين مضخة تحتوي على الهواء إلى معدل تدفق 40 ميكرولتر في الدقيقة الواحدة وتعيين المضخة التي تحتوي على عينة إلى معدل تدفق 20 ميكرولترات في الدقيقة الواحدة. بعد ذلك، قم بتوصيل الأنبوب المتبقي الخارج من نظام التدفق إلى حاوية من 10٪ التبييض للتخلص من الخلايا بعد خروجها من نظام التدفق.

ضع قسم أنبوب الكوارتز الشعري في محاذاة مباشرة مع محول في الرؤية الميدانية للمجهر للسماح بوضع دقيق للألياف البصرية فوق العينة بحيث يضيء العرض الكامل للأنبوب. تشع العينة باستخدام الألياف البصرية توجيه ليزر الحالة الصلبة ضخ الصمام الثنائي تعمل في الطول الموجي من 1، 053 نانومتر. استخدام الكاميرا التي شنت المجهر لتسجيل تدفق، وإطلاق الليزر، ومرور العينات من خلال نظام التدفق.

في هذه الدراسة، يتم استخدام قياس التدفق الضوئي الصوتي وعامل استهداف كبريتيد النحاس المستهدف للكشف عن الخلايا السرطانية المنتشرة المبيضية. تظهر صورة تيم النموذجية للجسيمات النانوية المركبة أن متوسط حجم الجسيمات النانوية النموذجية يبلغ حوالي 8.6 نانومتر. ثم تقاس القطرات الأفقية والرأسية لكل جسيم عمودي على بعضها البعض، ثم يتم قياسها بشكل متوسط.

ويبلغ متوسط قطر هذه الجسيمات 73.6 نانومتر. جسيمات نانوية كبريتيد النحاس لها منحنى امتصاص مميزة تمتد إلى الأشعة تحت الحمراء القريبة. هناك قطعة أثرية طفيفة حول 850 نانومتر التي تسببها تبديل الليزر بواسطة مقياس الطيف.

تظهر صور المجهر الفلوري للخلايا المحتضنة بجسيمات نانوية ذات علامات فلورية أنه يمكن تصور امتصاص الجسيمات النانوية من خلال وجود الفلوريسنس عبر الخلية. لا تظهر الخلايا المحتضنة بجسيمات نانوية أي إشارة فلورية. يشير وجود هذه الإشارة الفلورية إلى نجاح امتصاص الجسيمات وقدرتها على الكشف عنها في نظام التدفق.

وتظهر هنا أمثلة لإشارات الحصول على البيانات النموذجية. وتشير البيانات الخام إلى الاختلافات في الإشارة بين الخلايا الموسومة بالجسيمات النانوية، وBBS، وجسيمات كبريتيد النحاس ذات الكبريتات النانوية ذات الجزيئات النانوية ذات الجزيئات النانوية التي تم وضعها في جسيمات كبريتيد النحاس. الاستفادة من عرض مختبر مخصص وبرمجيات MATLAB ، تتم إعادة بناء الصور من الضوابط الإيجابية والسلبية في الوقت الحقيقي واقتناء آخر على التوالي.

يتم تحويل المغلفات الفردية فيما بعد إلى قيم بكسل وعرضها كأعمدة مستقلة. تحدث اختلافات واضحة في الإشارة الصوتية الضوئية بين PBS وجسيمات كبريتيد كبريتيد النحاس ذات جسيمات نانوية من حمض الفوليك بتركيز 100 ميكروغرام لكل ملليلتر. خلال هذا الإجراء، من المهم جداً محاذاة محول الموجات فوق الصوتية والمجهر والألياف البصرية بشكل صحيح داخل نظام قياس التدفق الضوئي الصوتي.

تأكيد محاذاة النظام عن طريق اختبار عناصر تحكم موجبة وسلبية. نظرًا لتعدد استخدام تقنيات الاستهداف الضوئية الصوتية ومجموعة واسعة من التطبيقات الممكنة باستخدام PAFC ، فإن هذه التقنية تمهد الطريق للتطبيقات السريرية والبحثية المهمة ترجمةً. لضمان التطبيق السريري، يجب أن تركز الدراسات الأخرى على اختبار عينات المرضى والحد من الخطوات الإجرائية.

وينبغي أن يتم تركيب الجسيمات النانوية في غطاء الدخان الكيميائية استخدام معدات الحماية المناسبة. يجب التعامل مع خطوط الخلايا البشرية وفقا لإرشادات مؤسستك. ويتطلب استخدام الليزر تدريباً على السلامة الإشعاعية والمعدات الشخصية المناسبة.

ولا ينبغي أن يتم استخدام الليزر والاختبار الضوئي الصوتي إلا من قبل موظفين مدربين تدريبا عاليا.