التصوير والتحليل لاتجاهات الأنسجة وديناميات النمو في الظهارة الهوائية النامية Drosophila خلال مراحل البوبال

داخل الكائنات متعددة الخلايا، تعرض الأنسجة درجات عالية في اتجاهها المكاني. تحاذي الخلايا وتعرض مجموعة من الأولويات على مسافات كبيرة خلال فترة تكوين المورفين. لفهم كيفية التوصل إلى ترتيبات النوبة من الظهارة أثناء التطوير ، من المهم تتبع توجهات الخلية وديناميات النمو مع الإخلاص الزمني العالي في الجسم الحي.

تم تصميم البروتوكول الموصوف لتصوير وتحليل سلوكيات الخلايا على المستويين العالمي والمحلي في البشرة الدوزوفيلية. هذه المنهجية يمكن أن توفر رؤى في نظرية مختلفة من البحوث، وبيولوجيا الخلايا، وmorphogenesis، والاقطاب الملوحة ويمكن تطبيقها على تحليل الأنسجة الأخرى، والهياكل، والنماذج. يمكن تنفيذ جميع الخطوات بسهولة بعد بعض الممارسة.

إنهم يطالبون بالدقة يساعد تصور هذا البروتوكول على تحقيق النتائج المثلى في وقت أقصر. تشريح الجرو معقد.

للبدء، استخدم فرشاة طلاء مبللة لنقل أبيض ما قبل الخراب إلى قارورة بلاستيكية جديدة، والاحتفاظ بها هناك لطالما لزم الأمر في 25 درجة مئوية. ثم، إزالة كل خادر من جدار القارورة بمساعدة ملقط. الغراء الجانب البطني من كل pupa على شريحة زجاجية مغطاة شريط لاصق مزدوج من جانب.

الاستفادة بلطف على سبيراكيليس الرأس والسطح الظهري من pupa مع نصائح من ملقط لضمان التصاق حالة pupal إلى الشريط. بدء تشريح تحت مجهر ستيريو عن طريق إزالة بلطف operculum من puparium مع ملقط. إدراج طرف واحد من ملقط في الضحلة بين حالة pupal وسطح pupa من خلال فتحopeular.

المسيل للدموع القضية من الرأس إلى الذيل بشكل مؤقت في واحد أو أكثر من التقلبات، وتجنب معسر pupa. أضعاف مرة أخرى في حالة pupal متصدع إلى الجانبين الجانبي كما كنت الاستمرار في المضي قدما إلى الطرف الخلفي. إزالة pupa من حالة pupal فتحها عن طريق إدراج بعناية ملقط تحت الحيوان وسحب بلطف.

الـ(خرا) يلتصق بطرف الـ(ملقط) عقد pupa بلطف من جانب البطن، ونقل الجراء إلى طبق الزجاج القاع على رأس قطرة صغيرة من زيت الهالوكربون الغازية نفاذة. لفة قطعة من الورق المناديل الرطبة على حواف الطبق وتغطية الطبق للحفاظ على الرطوبة.

توجيه pupa على قطرة النفط على الأطباق القاع الزجاج وفقا للمجال وعملية لتقييمها. للتصوير الحي على المدى الطويل من التوسع المبكر للعشاش الظهرية، الظهرالوجه الجانبي pupa. لتصوير توسعها المتأخر وإعادة عرض الأنسجة ، توجيه dorsally pupa.

نقل الطبق الزجاجي السفلي الذي يحتوي على الجراء المثبتة إلى مرحلة المجهر والتركيز على سطح منطقة البطن باستخدام الضوء المنقول. لتوظيف إعادة التركيب الميتوتوتية للحث على الفسيفساء الوراثية في ظهارة البطن، وإعداد الإناث العذراء تحمل صدمة حرارية flipase غير قابل للانسداد، وموقع FRT في موقع الجينوم محددة، وعلامة خلوية التعرف على distals إلى موقع FRT. إعداد الذكور المتحولين الذين يحملون موقع FRT في الموقع الجينومي المكافئ.

عبر عدة الإناث والذكور في نسبة ثلاثة إلى واحد في قارورة بلاستيكية في 25 درجة مئوية لمدة أربعة إلى خمسة أيام. لتوليد استنساخ الجسم في الهيستوبلاست، إجراء علاج الصدمات الحرارية في المرحلة الثالثة اليرقات instar من ذرية الصليب عن طريق غمر قارورة بلاستيكية تحتوي على الحيوانات في حمام مائي في 37 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة إلى ساعة. في برنامج J الصورة، استخدم وظيفة الإسقاط أقصى كثافة لحماية شرائح المكدس Z المكتسبة بواسطة المجهر confocal في 2D.

الاعشاش لها شكل مميز يوجهها في نظام احداثي مُعَطّق في مقدمة إلى اليسار و دورسال إلى الأعلى. لتحقيق أفضل النتائج مع هذا التحليل، يجب الحصول على صورة الإدخال مع دقة عالية. للحصول على قيم التوجيه النوعي على حواف الخلايا المحلية، انقر على القائمة الإضافية واختر خيار التوزيع J الاتجاه.

تعيين سيجما إطار جاوسي إلى بكسل واحد، spline مكعب إلى تدرج، الحد الأدنى من الاتساق إلى 20 في المئة، والحد الأدنى للطاقة إلى واحد في المئة. استخدم خيار مسح الألوان المكون الإضافي. تعيين تدرج إلى اتجاه، والتشبع إلى الاتساق، والسطوع لإدخال الصورة.

هذه رموز لون اتجاه حافة الخلية نسبة إلى نظام إحداثيات لوح الألوان. بعد ذلك، ضمن القائمة الإضافية، استخدم خيار قياس الاتجاه J لتحديد الاتجاهات الخلوية والخلية الاتجاهية إلى محاذاة الخلية. توليد الصغيرة، والمناطق غير متداخلة المتاخمة من مصلحة الوزن الموحدة حول 20 ميكرومتر مرات 20 ميكرومتر داخل المنطقة التي تحتلها الهستوبلاست.

يحسب المقياس الملح الاتجاه المحلي السائد والاتساق من ROIs. في هذه الدراسة ، والمنهجية المستخدمة قادرة على توليد أفلام عالية الدقة من pupae النامية لفترات تصل إلى 48 ساعة دون تبييض صورة كبيرة أو سمية الصورة. أمثلة من استنساخ نوع البرية التي تميزت بغياب NLS RFP وبقع التوأم في 26 ساعة بعد تشكيل puparium تظهر هنا.

المستنسخين ممدودين على طول الحدود الجزية. التوأم استنساخ مرتبة في موازاة أو جنبا إلى جنب. يظهر مورفولوجيا استنساخ نوع البرية في 26 ساعة و 47 ساعة بعد تشكيل الجراء مورفولوجيا الحدود المعقدة في كلتا المرحلتين.

المربع وخفقات المؤامرات للبارامترات الهندسية في 26 ساعة و 47 ساعة بعد تشكيل puparium تظهر المنطقة متوسط والمحيط زيادة كبيرة في هذه النافذة الزمنية. وقد تم الحفاظ على توجه استنساخ خلال التوسع وإعادة عرض. المعلمات شكل في 26 ساعة و 47 ساعة بعد تشكيل puparium تشير إلى خشونة، استدارة ودائرية بالكاد تغيرت في استنساخ نوع البرية.

تأكد من عدم إلحاق الضرر بـ pupa ، وإلا سيموت في غضون ساعات قليلة ، مما يؤثر على التصوير المباشر. ولا يتطلب هذا البروتوكول استخدام مُشفر أو أداة سارتوس. تجنبي أن تقرّص نفسك عند تشريحها.

من خلال تطبيق هذه المنهجيات الممكنة لتوليد أفلام عالية الدقة لفترات طويلة باستخدام تقنيات مختلفة تخيل. التنسيق إلى أقراص الفوتون أو الغزل. ويمكن استخدام التحليل الكلوري لاستكشاف الاستجابات غير المستقلة نظراً لأن الخلايا العشوائية تسهل في تحديد المحادثات المتبادلة أو آليات الاتصال الخلوي.

يمكن تكييف هذه الطرق بسهولة لدراسة مجموعة كاملة من الظواهر المورفوجينية، بما في ذلك تنسيق نمو البشرة والعضلات والعصبية أثناء التحول.