التصوير والتحليل لاتجاهات الأنسجة وديناميات النمو في الظهارة الهوائية النامية Drosophila خلال مراحل البوبال
June 2nd, 2020
تم تصميم هذا البروتوكول لتصوير وتحليل ديناميات اتجاه الخلية ونمو الأنسجة في ظهارة البطن Drosophila كما ذبابة الفاكهة يخضع التحول. يمكن تطبيق المنهجية الموصوفة هنا على دراسة مختلف مراحل النمو والأنسجة والهياكل تحت الخلوية في دروسوفيلا أو غيرها من الكائنات النموذجية.
داخل الكائنات متعددة الخلايا، تعرض الأنسجة درجات عالية في اتجاهها المكاني. تحاذي الخلايا وتعرض مجموعة من الأولويات على مسافات كبيرة خلال فترة تكوين المورفين. لفهم كيفية التوصل إلى ترتيبات النوبة من الظهارة أثناء التطوير ، من المهم تتبع توجهات الخلية وديناميات النمو مع الإخلاص الزمني العالي في الجسم الحي.
تم تصميم البروتوكول الموصوف لتصوير وتحليل سلوكيات الخلايا على المستويين العالمي والمحلي في البشرة الدوزوفيلية. هذه المنهجية يمكن أن توفر رؤى في نظرية مختلفة من البحوث، وبيولوجيا الخلايا، وmorphogenesis، والاقطاب الملوحة ويمكن تطبيقها على تحليل الأنسجة الأخرى، والهياكل، والنماذج. يمكن تنفيذ جميع الخطوات بسهولة بعد بعض الممارسة.
إنهم يطالبون بالدقة يساعد تصور هذا البروتوكول على تحقيق النتائج المثلى في وقت أقصر. تشريح الجرو معقد.
للبدء، استخدم فرشاة طلاء مبللة لنقل أبيض ما قبل الخراب إلى قارورة بلاستيكية جديدة، والاحتفاظ بها هناك لطالما لزم الأمر في 25 درجة مئوية. ثم، إزالة كل خادر من جدار القارورة بمساعدة ملقط. الغراء الجانب البطني من كل pupa على شريحة زجاجية مغطاة شريط لاصق مزدوج من جانب.
الاستفادة بلطف على سبيراكيليس الرأس والسطح الظهري من pupa مع نصائح من ملقط لضمان التصاق حالة pupal إلى الشريط. بدء تشريح تحت مجهر ستيريو عن طريق إزالة بلطف operculum من puparium مع ملقط. إدراج طرف واحد من ملقط في الضحلة بين حالة pupal وسطح pupa من خلال فتحopeular.
المسيل للدموع القضية من الرأس إلى الذيل بشكل مؤقت في واحد أو أكثر من التقلبات، وتجنب معسر pupa. أضعاف مرة أخرى في حالة pupal متصدع إلى الجانبين الجانبي كما كنت الاستمرار في المضي قدما إلى الطرف الخلفي. إزالة pupa من حالة pupal فتحها عن طريق إدراج بعناية ملقط تحت الحيوان وسحب بلطف.
الـ(خرا) يلتصق بطرف الـ(ملقط) عقد pupa بلطف من جانب البطن، ونقل الجراء إلى طبق الزجاج القاع على رأس قطرة صغيرة من زيت الهالوكربون الغازية نفاذة. لفة قطعة من الورق المناديل الرطبة على حواف الطبق وتغطية الطبق للحفاظ على الرطوبة.
توجيه pupa على قطرة النفط على الأطباق القاع الزجاج وفقا للمجال وعملية لتقييمها. للتصوير الحي على المدى الطويل من التوسع المبكر للعشاش الظهرية، الظهرالوجه الجانبي pupa. لتصوير توسعها المتأخر وإعادة عرض الأنسجة ، توجيه dorsally pupa.
نقل الطبق الزجاجي السفلي الذي يحتوي على الجراء المثبتة إلى مرحلة المجهر والتركيز على سطح منطقة البطن باستخدام الضوء المنقول. لتوظيف إعادة التركيب الميتوتوتية للحث على الفسيفساء الوراثية في ظهارة البطن، وإعداد الإناث العذراء تحمل صدمة حرارية flipase غير قابل للانسداد، وموقع FRT في موقع الجينوم محددة، وعلامة خلوية التعرف على distals إلى موقع FRT. إعداد الذكور المتحولين الذين يحملون موقع FRT في الموقع الجينومي المكافئ.
عبر عدة الإناث والذكور في نسبة ثلاثة إلى واحد في قارورة بلاستيكية في 25 درجة مئوية لمدة أربعة إلى خمسة أيام. لتوليد استنساخ الجسم في الهيستوبلاست، إجراء علاج الصدمات الحرارية في المرحلة الثالثة اليرقات instar من ذرية الصليب عن طريق غمر قارورة بلاستيكية تحتوي على الحيوانات في حمام مائي في 37 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة إلى ساعة. في برنامج J الصورة، استخدم وظيفة الإسقاط أقصى كثافة لحماية شرائح المكدس Z المكتسبة بواسطة المجهر confocal في 2D.
الاعشاش لها شكل مميز يوجهها في نظام احداثي مُعَطّق في مقدمة إلى اليسار و دورسال إلى الأعلى. لتحقيق أفضل النتائج مع هذا التحليل، يجب الحصول على صورة الإدخال مع دقة عالية. للحصول على قيم التوجيه النوعي على حواف الخلايا المحلية، انقر على القائمة الإضافية واختر خيار التوزيع J الاتجاه.
تعيين سيجما إطار جاوسي إلى بكسل واحد، spline مكعب إلى تدرج، الحد الأدنى من الاتساق إلى 20 في المئة، والحد الأدنى للطاقة إلى واحد في المئة. استخدم خيار مسح الألوان المكون الإضافي. تعيين تدرج إلى اتجاه، والتشبع إلى الاتساق، والسطوع لإدخال الصورة.
هذه رموز لون اتجاه حافة الخلية نسبة إلى نظام إحداثيات لوح الألوان. بعد ذلك، ضمن القائمة الإضافية، استخدم خيار قياس الاتجاه J لتحديد الاتجاهات الخلوية والخلية الاتجاهية إلى محاذاة الخلية. توليد الصغيرة، والمناطق غير متداخلة المتاخمة من مصلحة الوزن الموحدة حول 20 ميكرومتر مرات 20 ميكرومتر داخل المنطقة التي تحتلها الهستوبلاست.
يحسب المقياس الملح الاتجاه المحلي السائد والاتساق من ROIs. في هذه الدراسة ، والمنهجية المستخدمة قادرة على توليد أفلام عالية الدقة من pupae النامية لفترات تصل إلى 48 ساعة دون تبييض صورة كبيرة أو سمية الصورة. أمثلة من استنساخ نوع البرية التي تميزت بغياب NLS RFP وبقع التوأم في 26 ساعة بعد تشكيل puparium تظهر هنا.
المستنسخين ممدودين على طول الحدود الجزية. التوأم استنساخ مرتبة في موازاة أو جنبا إلى جنب. يظهر مورفولوجيا استنساخ نوع البرية في 26 ساعة و 47 ساعة بعد تشكيل الجراء مورفولوجيا الحدود المعقدة في كلتا المرحلتين.
المربع وخفقات المؤامرات للبارامترات الهندسية في 26 ساعة و 47 ساعة بعد تشكيل puparium تظهر المنطقة متوسط والمحيط زيادة كبيرة في هذه النافذة الزمنية. وقد تم الحفاظ على توجه استنساخ خلال التوسع وإعادة عرض. المعلمات شكل في 26 ساعة و 47 ساعة بعد تشكيل puparium تشير إلى خشونة، استدارة ودائرية بالكاد تغيرت في استنساخ نوع البرية.
تأكد من عدم إلحاق الضرر بـ pupa ، وإلا سيموت في غضون ساعات قليلة ، مما يؤثر على التصوير المباشر. ولا يتطلب هذا البروتوكول استخدام مُشفر أو أداة سارتوس. تجنبي أن تقرّص نفسك عند تشريحها.
من خلال تطبيق هذه المنهجيات الممكنة لتوليد أفلام عالية الدقة لفترات طويلة باستخدام تقنيات مختلفة تخيل. التنسيق إلى أقراص الفوتون أو الغزل. ويمكن استخدام التحليل الكلوري لاستكشاف الاستجابات غير المستقلة نظراً لأن الخلايا العشوائية تسهل في تحديد المحادثات المتبادلة أو آليات الاتصال الخلوي.
يمكن تكييف هذه الطرق بسهولة لدراسة مجموعة كاملة من الظواهر المورفوجينية، بما في ذلك تنسيق نمو البشرة والعضلات والعصبية أثناء التحول.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
نظرة عامة
تم تصميم هذا البروتوكول لتصوير وتحليل ديناميكيات توجيه الخلايا ونمو الأنسجة في الظهارة البطنية لذبابة الفاكهة أثناء خضوعها لعملية التحول. يمكن تطبيق المنهجية الموصوفة هنا لدراسة مراحل التطور المختلفة والأنسجة والهياكل دون الخلوية في ذبابة الفاكهة أو الكائنات النموذجية الأخرى.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- بيولوجيا الخلية
- التشكل الجنيني
- الاستقطاب المستوي
الخلفية
- تظهر الأنسجة درجات عالية من التوجيه المكاني داخل الكائنات متعددة الخلايا.
- تتماثل الخلايا وتظهر أولوية على مسافات كبيرة خلال التشكل الجنيني.
- تتبُع اتجاهات الخلايا وديناميكيات النمو أمر بالغ الأهمية لفهم ترتيبات الظهارة.
- تركز هذه الدراسة على البشرة الشرانية لذبابة الفاكهة.
هدف الدراسة
- لتصوير وتحليل سلوكيات الخلايا على المستويات العالمية والمحلية.
- لتوفير رؤى في نظريات بيولوجيا الخلية والتشكل الجنيني.
- لتطبيق المنهجية على أنسجة وكائنات نموذجية مختلفة.
الطرق المستخدمة
- تقنيات التصوير لتتبع توجيه الخلايا.
- تحليل ديناميكيات نمو الأنسجة.
- المراقبة الحية لتطور ذبابة الفاكهة.
- تطبيق البروتوكول على مراحل تطور مختلفة.
النتائج الرئيسية
- دقة مكانية زمنية عالية في تتبع سلوكيات الخلايا.
- رؤى حول ديناميكيات توجيه الخلايا أثناء عملية التحول.
- تطبيقات محتملة على الأنسجة الأخرى والكائنات النموذجية.
- المنهجية يمكن الوصول إليها بعد الممارسة.
الاستنتاجات
- يعزز البروتوكول فهم التشكل الجنيني للظهارة.
- يمكن تكييفها لتطبيقات بحثية مختلفة في بيولوجيا الخلية.
- يمكن للدراسات المستقبلية الاستفادة من هذه المنهجية للحصول على رؤى أوسع.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Understanding tissue-level organization and growth dynamics is critical for de-risking target validation in complex disease models. This protocol enables high-fidelity tracking of cellular alignment and morphogenetic processes, supporting mechanistic insights into epithelial patterning. Such quantitative spatial-temporal data enhances predictive confidence in preclinical models by linking cellular behaviors to tissue-scale outcomes.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of tissue-scale organization to validate hypotheses about planar polarity and cellular coordination in morphogenesis.
- Operational Value: Provides reproducible imaging and analysis workflows for assessing cellular alignment and directional growth in epithelial systems.
- Predictive Value: Supports target confidence by linking molecular perturbations to measurable changes in tissue orientation and clonally resolved growth dynamics.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative orientation and coherency metrics from defined regions of interest, enabling objective comparison of cellular behaviors across conditions.
- Operational Value: Standardizes live imaging protocols using gas-permeable halocarbon oil and mounted pupae for long-term, high-resolution time-lapse acquisition.
- Assay Readiness: Facilitates screening-ready readouts such as clone elongation, border morphology, and area/perimeter changes over time for phenotypic assessment.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-stage observations of histoblast clone dynamics to broader tissue remodeling processes relevant to wound healing and regeneration models.
- Mechanistic De-risking: Enables evaluation of non-autonomous responses via clonal analysis and genetic mosaics to dissect cell communication mechanisms in developing epithelia.
- Predictive Confidence: Sustained orientation and stable shape parameters during expansion provide baseline benchmarks for assessing aberrant morphogenesis in disease-relevant perturbations.
Pipeline & Workflow Integration
The method supports discovery biology through hypothesis testing of planar cell polarity and extends to lead identification by enabling quantitative assessment of cellular responses to genetic or pharmacological perturbations.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of cellular alignment and tissue orientation during morphogenetic events such as histoblast nest expansion and remodeling.
- Screening: Enables assay readiness through standardized live imaging and orientation analysis of epithelial sheets over 48-hour periods with minimal photo toxicity.
- Analytics: Generates dominant local orientation and coherency measurements from 20x20 micrometer regions of interest using OrientationJ plugins for objective, quantitative comparison.
- Translational Research: Connects clonal dynamics and border morphology changes to preclinical continuity in tissue repair and regeneration models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging and analysis platform adaptable to other tissues, developmental stages, and model organisms beyond Drosophila pupal epidermis.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in epithelial morphogenesis and planar polarity pathways.
- Operational Value: Ensures standardization, reproducibility, and scalability of live imaging and quantitative orientation analysis across laboratories and model systems.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early detection of aberrant tissue organization, reducing late-stage biological risk in preclinical programs.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization through quantifiable, morphology-based readouts that correlate with functional tissue states.
Implementation Considerations
- Requires expertise in Drosophila handling, pupal dissection, and live imaging under stereo and confocal microscopy.
- Dependent on gas-permeable halocarbon oil, glass-bottomed dishes, and stable humidity maintenance for long-term imaging.
- Necessitates standardized image acquisition protocols and plugin-based analysis (OrientationJ) for consistent orientation and coherency quantification.
- Requires adaptation of mounting orientation (dorsal vs. dorsal-lateral) based on the specific biological process being imaged (early expansion vs. late remodeling).
- Practical limitations include sensitivity to dissection-induced damage, which can compromise pupal viability and live imaging quality if not performed with precision.
