Name: التصور من المبيضات الbicans في الجهاز الهضمي Murine باستخدام التهجين في الموقع الفلورسنت (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 8 s
Description: اكتشف تقنية التهجين الفلورسنتي لتصور Candida albicans في الجهاز الهضمي للفئران. تتيح هذه الطريقة دراسة تفاعلات الفطريات مع البكتيريا المعوية والأنسجة المضيفة مباشرة.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ويود المؤلفون ان يشكروا كارولينا تروتيني ، كاثرين نغ ، جوستين سوننبرغ ، وكيه كاي هوانغ للتوجيه في تطوير تقنيه الأسماك. قدمت تيريزا O'Meara تعليقات مفيده علي المخطوطة ، وساعدت ميريام ليفي في التصوير الفوتوغرافي. وقد دعم هذا العمل من قبل المعاهد القومية للصحة منح R01AI108992 ، R01DK113788 ، وجائزه الترحيب Burخشونه في التسبب في الامراض المعدية.

<ol><li>Noble, S. M., Gianetti, B. A., Witchley, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candida+Albicans+Cell-Type+Switching+and+Functional+Plasticity+in+the+Mammalian+Host%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Candida Albicans Cell-Type Switching and Functional Plasticity in the Mammalian Host.</a> Nature Reviews in Microbiology. 15 (2), 96-108 (2017).</li>
<li>Bacher, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Anti-fungal+Th17+Immunity+and+Pathology+Rely+on+Cross-Reactivity+against+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Human Anti-fungal Th17 Immunity and Pathology Rely on Cross-Reactivity against Candida albicans.</a> Cell. 176 (6), 1340-1355 (2019).</li>
<li>Shao, T. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Commensal+Candida+albicans+Positively+Calibrates+Systemic+Th17+Immunological+Responses%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+and+Microbe%22%5BJournal%5D)">Commensal Candida albicans Positively Calibrates Systemic Th17 Immunological Responses.</a> Cell Host and Microbe. 25 (3), 404-417 (2019).</li>
<li>Jiang, T. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Commensal+Fungi+Recapitulate+the+Protective+Benefits+of+Intestinal+Bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+and+Microbe%22%5BJournal%5D)">Commensal Fungi Recapitulate the Protective Benefits of Intestinal Bacteria.</a> Cell Host and Microbe. 22 (6), 809-816 (2017).</li>
<li>Iliev, I. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+Between+Commensal+Fungi+and+the+C-Type+Lectin+Receptor+Dectin-1+Influence+Colitis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Interactions Between Commensal Fungi and the C-Type Lectin Receptor Dectin-1 Influence Colitis.</a> Science. 336 (6086), 1314-1317 (2012).</li>
<li>Fan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+HIF-1+alpha+and+LL-37+by+Commensal+Bacteria+Inhibits+Candida+Albicans+Colonization%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Activation of HIF-1 alpha and LL-37 by Commensal Bacteria Inhibits Candida Albicans Colonization.</a> Nature Medicine. 21 (7), 808-814 (2015).</li>
<li>Koh, A. Y., Kohler, J. R., Coggshall, K. T., Van Rooijen, N., Pier, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mucosal+Damage+and+Neutropenia+Are+Required+for+Candida+Albicans+Dissemination%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Mucosal Damage and Neutropenia Are Required for Candida Albicans Dissemination.</a> PLoS Pathogens. 4 (2), e35(2008).</li>
<li>Yamaguchi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastric+Colonization+of+Candida+Albicans+Differs+in+Mice+Fed+Commercial+and+Purified+Diets%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Gastric Colonization of Candida Albicans Differs in Mice Fed Commercial and Purified Diets.</a> Journal of Nutrition. 135 (1), 109-115 (2005).</li>
<li>Kadosh, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+Antifungal+Treatment+in+a+Diet-Based+Murine+Model+of+Disseminated+Candidiasis+Acquired+via+the+Gastrointestinal+Tract%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Effect of Antifungal Treatment in a Diet-Based Murine Model of Disseminated Candidiasis Acquired via the Gastrointestinal Tract.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 60 (11), 6703-6708 (2016).</li>
<li>Perlroth, J., Choi, B., Spellberg, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nosocomial+Fungal+Infections%3A+Epidemiology%2C+Diagnosis%2C+and+Treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+Mycology%22%5BJournal%5D)">Nosocomial Fungal Infections: Epidemiology, Diagnosis, and Treatment.</a> Medical Mycology. 45 (4), 321-346 (2007).</li>
<li>Pande, K., Chen, C., Noble, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Passage+Through+the+Mammalian+Gut+Triggers+a+Phenotypic+Switch+That+Promotes+Candida+Albicans+Commensalism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Passage Through the Mammalian Gut Triggers a Phenotypic Switch That Promotes Candida Albicans Commensalism.</a> Nature Genetics. 45 (9), 1088-1091 (2013).</li>
<li>Witchley, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candida+Albicans+Morphogenesis+Programs+Control+the+Balance+between+Gut+Commensalism+and+Invasive+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+and+Microbe%22%5BJournal%5D)">Candida Albicans Morphogenesis Programs Control the Balance between Gut Commensalism and Invasive Infection.</a> Cell Host and Microbe. 25 (3), 432-443 (2019).</li>
<li>Noble, S. M., Gianetti, B. A., Witchley, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candida+Albicans+Cell-Type+Switching+and+Functional+Plasticity+in+the+Mammalian+Host%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Candida Albicans Cell-Type Switching and Functional Plasticity in the Mammalian Host.</a> Nature Reviews in Microbiology. 15 (2), 96-108 (2017).</li>
<li>Balish, E., Filutowicz, H., Oberley, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlates+of+Cell-Mediated+Immunity+in+Candida+Albicans-Colonized+Gnotobiotic+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Correlates of Cell-Mediated Immunity in Candida Albicans-Colonized Gnotobiotic Mice.</a> Infection and Immunity. 58 (1), 107-113 (1990).</li>
<li>Guarner, J., Brandt, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histopathologic+Diagnosis+of+Fungal+Infections+in+the+21st+Century%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Histopathologic Diagnosis of Fungal Infections in the 21st Century.</a> Clinical Microbiology Reviews. 24 (2), (2011).</li>
<li>Johansson, M. E., Hansson, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preservation+of+Mucus+in+Histological+Sections%2C+Immunostaining+of+Mucins+in+Fixed+Tissue%2C+and+Localization+of+Bacteria+with+FISH%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Preservation of Mucus in Histological Sections, Immunostaining of Mucins in Fixed Tissue, and Localization of Bacteria with FISH.</a> Methods in Molecular Biology. 842, 229-235 (2012).</li>
<li>Swidsinski, A., Weber, J., Loening-Baucke, V., Hale, L. P., Lochs, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+Organization+and+Composition+of+the+Mucosal+Flora+in+Patients+with+Inflammatory+Bowel+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Spatial Organization and Composition of the Mucosal Flora in Patients with Inflammatory Bowel Disease.</a> Journal of Clinical Microbiology. 43 (7), 3380-3389 (2005).</li>
<li>Lee, K. L., Buckley, H. R., Campbell, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Amino+Acid+Liquid+Synthetic+Medium+for+the+Development+of+Mycelial+and+Yeast+Forms+of+Candida+Albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Sabouraudia%22%5BJournal%5D)">An Amino Acid Liquid Synthetic Medium for the Development of Mycelial and Yeast Forms of Candida Albicans.</a> Sabouraudia. 13 (2), 148-153 (1975).</li>
<li>Banerjee, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UME6%2C+a+Novel+Filament-Specific+Regulator+of+Candida+Albicans+Hyphal+Extension+and+Virulence%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">UME6, a Novel Filament-Specific Regulator of Candida Albicans Hyphal Extension and Virulence.</a> Molecular Biology of the Cell. 19 (4), 1354-1365 (2008).</li>
<li>Earle, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Imaging+of+Gut+Microbiota+Spatial+Organization%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+and+Microbe%22%5BJournal%5D)">Quantitative Imaging of Gut Microbiota Spatial Organization.</a> Cell Host and Microbe. 18 (4), 478-488 (2015).</li>
<li>Sokol, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fungal+Microbiota+Dysbiosis+in+IBD%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Fungal Microbiota Dysbiosis in IBD.</a> Gut. 66 (6), 1039-1048 (2017).</li>
</ol>

وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.

الطريقة الموصوفة هنا يسمح لتصور c. مبيض الخمائر و هيبوهاي في مساحات GI من الفئران التي استعمرت المعلقين من اي جنس أو سلاله. المسبار الأسماك التهجين إلى rRNA 23S ، والتي يتم توزيعها في جميع انحاء سيتوتوبلاسما الفطرية. وقد تم تكييف طريقتنا من بروتوكول سبق الإبلاغ عنه لتصور بكتيريا الأمعاء20. لان c. مبيض يغير المورفولوجية في المضيف ، والأسلوب هو مفيد لرصد شكل الخلية الفطرية ، فضلا عن التعريب. علي سبيل المثال ، لقد استخدمنا هذه الطريقة لدحض فرضيه ان الخمائر تسود في جميع انحاء الجهاز الهضمي ، وفضح التناقضات بين في الجسم المجري والظاهري في المختبر من بعض "المسوخ-معيبه" طفرات12.
يوجد العديد من نماذج الماوس ل c. مبيض الاستعمار المعلق. والكائنات المجهرية لفئران المختبرات والبشر متميزة ، وفي الفئران ، يلزم استخدام المضادات الحيوية أو اتباع نظام غذائي متخصص لأقامه استعمار مستقر. العلاج بالمضادات الحيوية يعزز أيضا c. مبيض الاستعمار من البشر وهو عامل خطر كبير لنشر المرض10. المضادات الحيوية المستخدمة في هذه الدراسة غير مكلفه نسبيا وتسفر عن انخفاضات موثوقه في الجراثيم الجرثومية. لاحظ انه يتم استخدام المضادات الحيوية لإنقاص عبء الأنواع البكتيرية العدائية ، وليس للقضاء علي جميع البكتيريا من الكائنات. إذا كان الباحثون يرغبون في دراسة c. albicans-التفاعلات المضيف في غياب البكتيريا أو لتجنب استخدام المضادات الحيوية أو نظام غذائي خاص ، يمكن ان تحل محل الحيوانية الخالية من الجراثيم للحيوانات تربي تقليديا. ومع ذلك ، الفئران gnotobiotic تظهر بعض التشوات المناعية والتشريحية ، التالي قد لا تكون مناسبه لجميع الأغراض.
العديد من الخطوات الهامه لتلطيخ الأسماك الناجحة: طريقه التثبيت الموصي بها أمر بالغ الاهميه للحفاظ علي السلامة الهيكلية للانسجه الهضمية ، وخاصه المحتويات الهشة لتجويف الأمعاء ، مثل طبقه المخاط والثلاثية الابعاد تنظيم الفطريات والبكتيريا16. يرجى ملاحظه ان العديد من حلول التثبيت الشائعة الاستخدام التي تحتوي علي المياه تضر بشكل كبير بهندسة الاناره. المثبتات والحلول لغسل ما بعد التثبيت الموصي بها في هذا البروتوكول لا تحتوي علي الماء ، ومن المهم تجنب التلوث بالماء. خطوه حاسمه أخرى هي خطوه التهجين ، حيث انه من المهم تجنب تبخر محلول التهجين اثناء احتضان الشرائح في الفرن التهجين. نقترح وضع الشرائح في وعاء ماء لتجنب هذه المشكلة. بدلا من ذلك ، يمكن للمرء استخدام غرف التهجين للماء مثل تلك التي تستخدم في الأصل لتهجين ميكروصفائف.
ويرد في هذا البروتوكول وصف لمسبار خاص بالأسماك من طراز c. مبيض. ومع ذلك ، لان العديد من الفئران التي تربي في المختبر لا تحتوي علي c. مبيض أو الفطريات الأخرى كجزء من الميكروبات المعوية الطبيعية ، والمسبار الفطري قد وصمه عار علي وجه التحديد c. مبيض في الكائنات المستعمرة بالتجربة. قد يكون من المرغوب فيه استبدال مسبار الفطرية بسبب خصائصه التهجين متفوقة واعلي نسبه الاشاره إلى الضوضاء. إذا تم استخدام المسبار الفطري كمسبار زائف لل c. مبيض، فمن المهم لتوثيق عدم وجود تلطيخ في الكائنات غير المصابة (اي ، التعامل مع المضادات الحيوية ولكن ليس c. مبيض). تلطيخ الحيوانية السيطرة غير المستعمرة هو أيضا مفيد لتقييم تلطيخ الخلفية التي قد تنجم عن التزام بتحقيقات الأسماك إلى الجسيمات الغذائية. وعموما ، فان استخدام تحقيقات الأسماك يوفر خصوصية محسنه علي معظم الطرق الأخرى لتلطيخ الفطريات ، مثل Calcofluor الأبيض (الذي البقع كيتين ، مكون جدار الخلية التي قد تختلف بين أنواع الخلايا) ، GMS ، أو الأجسام المضادة المضادة للفطريات المتاحة تجاريا. وعلاوة علي ذلك ، تلطيخ الأسماك يسمح لتكلفه الكائنات الحية المتعددة باستخدام بشكل مختلف المسمية تحقيقات الأسماك إلى الأنواع المحددة.
واحد التحذير من هذه التقنية هو ان بعض أنواع الخلايا الخميرة c. مبيض تظهر مشابهه جدا من قبل الأسماك (علي سبيل المثال ، وأنواع الخلايا غير الشفافة والأمعاء). للتمييز بين هذه الأنواع من الخلايا ، سيكون من المفيد تطوير تحقيقات التهجين إلى الخلية mRNAs الفطرية نوع محدد. ومع ذلك ، في شكله الحالي ، وقد كشفت تقنيه الأسماك بالفعل الاختلافات المفاجئة بين السلوكيات المجرية وفي المختبر من المسوخ c. مبيض تقييمها في اطار كلا الشرطين12، مشيرا إلى التفاعلات المعقدة في بيئة المعلق الطبيعية التي لا تحاكي بشكل كاف من قبل الموجودة في اختبارات المختبر. المزيد من الدراسات من البقع c. مبيض مختلفه في الأنواع البرية اضافيه والمضيفين متحولة من المرجح ان تسفر عن رؤى اضافيه في التفاعلات الفطرية المضيف. وعلي وجه الخصوص ، فانه سيكون من المفيد لتوصيف c. مبيض في نماذج من مرض التهاب الأمعاء ، والذي يرتبط مع فكسانال عاليه من c. مبيض في البشر21، وغيرها من نماذج c. مبيض فرط النمو والمرض. ويمكن أيضا الجمع بين تقنيه FISH مع مناعي لتلطيخ خلايا المضيف محدده. وعموما ، فان الطريقة المعروضة هنا توفر وسيله سريعة وموثوق بها إلى حد معقول لتحديد التوطين c. مبيض والتشكل داخل القناة الهضمية الثدييات.

المبيضات الbicans هو المعلق الفطرية ، فضلا عن الممرض البشري الانتهازي. هذه الخميرة تفتقر إلى المكانة البيئية المحددة وتنتشر بدلا من ذلك داخل الجهاز الهضمي (GI) المسالك ، والجلد ، والمسالك البولية التناسلية للبشر وغيرها من الثدييات1. في حين ركزت البحوث المبكرة علي c. مبيض في المقام الأول علي إمكاناتها ضراوة, وتشير العديد من التقارير الاخيره ان المعلقين نشر الكائنات داخل الأمعاء قد تلعب أدوارا هامه في الصحة الطبيعية, بما في ذلك التنمية المناعية لل المضيف2،3،4. لتسهيل التحقيقات في c. مبيض المعلقة داخل الأمعاء الثدييات ، وضعنا نموذج الماوس من الاستعمار الهضمي مستقره والتهجين في الموقع (الأسماك) القائم علي طريقه لتصور خلايا الخميرة الفطرية و هيبوهاي داخل التجويف المعوي.
مع بعض الاستثناءات5، الفئران المختبرة التي ولدت عاده ما تظهر مقاومه للاستعمار الفطرية في الجهاز الهضمي. ويعتقد ان المقاومة الاستعمار ان توسط من قبل الأنواع البكتيرية محدده; ومع ذلك ، يمكن التغلب علي هذا عن طريق العلاج من الحيوانية مع المضادات الحيوية6،7 أو استخدام نظامغذائي محدد كيميائيا التي يفترض ان يغير تكوين الأنواعالبكتيرية 8 ،9. المثل ، في البشر ، ارتبط استخدام المضادات الحيوية واسعه الطيف مع الإفراط في c. مبيض ونشر10. لدينا نموذج الاستعمار murine يستخدم المضادات الحيوية واسعه الطيف لإنشاء الاستعمار c. مبيض من الفئران المناعية ، تربي تقليديا. يتم توفير البنسلين والسستربتومايسين في مياه الشرب للحيوانات لمده أسبوع واحد قبل أنبوبي مع 108 مستعمره تشكيل وحدات (cfus) من c. albicans. طالما استمرت المياه التي غرست المضادات الحيوية, c. مبيض سوف تنتشر من خلال الجهاز الهضمي, الوصول إلى البراز من 106− 108 cfus/g. وعلي الرغم من ارتفاع مستوي الاستعمار الفطري ، تبقي الماشية صحية وتكتسب الوزن بنفس معدل التحكم غير المصاب. وقد استخدم هذا النموذج بنجاح لفحص وتوصيف العوامل المعلقة ج. مبيض المتعددة11,12.
مثل الأعضاء الآخرين في المملكة الفطرية ، c. مبيض قادر علي اللدونة المورفولوجية هائله13. تحت الظروف المختبرية, وقد ثبت ان الانتقال بين ما لا يقل عن سته أنواع الخلايا الخميرة أحاديه الخلية, فضلا عن هيبوهاي متعدد الخلايا و سودوهيهايهاي. الانتقال من الخميرة إلى حيفا هي واحده من سماتها الأكثر تميزا في الضراوة ، وتسود في معظم نماذج امراض الثدييات ، وكذلك في الانسجه البشرية المصابة. لتحديد التعريب c. مبيض والمورفولوجية الخلية داخل الجهاز الهضمي murine ، وضعنا تقنيه الأسماك لتلطيخ الخمائر و هيبوهاي في الأقسام النسيجية الثابتة. التحقيقات تتكون من فلوريسسينتلي المسمية الحمض النووي قله كريات الديك التي التهجين إلى الفطرية 23S ريبوسومال RNA (rRNA) ، والتي يتم توزيعها في جميع انحاء سيتوتوبلاسما الفطرية. لان يتم إصلاح الانسجه المضيف بطريقه تحافظ علي الهندسة المعمارية ثلاثية الابعاد من الأمعاء ، بما في ذلك الغشاء المخاطي المضيف ، والمواد الهضمية ، والجراثيم الجرثومية ، والمخاط داخل تجويف الأمعاء ، وهذه التقنية تسمح توطين الفطرية الخلايا فيما يتعلق بهذه المعالم عندما ملطخه. تقنيه الأسماك يقارن بشكل إيجابي إلى البقع النسيجية التقليدية للفطريات ، مثل الدوري حمض شيف (PAS) أو جوموري ميثينامين الفضة (GMS) ، فضلا عن الأجسام المضادة للفطريات المتاحة تجاريا ، لان هذه الكواشف ليست محدده C. albicans. وعلاوة علي ذلك ، فان المثبتات القياسية تزيل طبقه المخاط وتعطل المحتويات الأخرى لتجويف الأمعاء14،15.
في هذه المقالة ، ونحن نقدم تعليمات مفصله لإنشاء عاليه الجودة c. مبيض الاستعمار من الجهاز الهضمي الماوس ، لتشريح الجهاز الهضمي من الرحيم الحيوانية ، لتثبيت الانسجه بطريقه تحافظ علي الاناره الهندسة المعمارية ، والكشف عن c. مبيض داخل الانسجه المضيفة باستخدام الأسماك. بالاضافه إلى أنواع البرية وسلالات متحولة من c. albicans ، يمكن استخدام تقنيه أنبوبي لتسليم الكائنات المجهرية الأخرى. تقنيه التثبيت ستكون مفيده لأي دراسة فيها الحفاظ علي محتويات الأمعاء هو المطلوب. ويمكن الانتهاء من اجراء الأسماك في غضون يوم واحد ، ويمكن استخدامها لتوطين الأنواع الفطرية متعددة باستخدام متعددة ، والمسمي بشكل مختلف التحقيقات.

<table><tbody><tr><td>يمكن استبدال 309659 BD بحقنة 1</td><td></td><td></td><td>مل من أي بائع</td></tr><tr><td>يمكن استبدال أجار</td><td></td><td></td> الدم BHI <td>من أي بائع</td></tr><tr><td>C. albicans مسبار</td><td>FISH IDT DNA Technologies</td><td>طلب</td><td></td>مخصص</tr><tr><td>غرفة للتهجين حضانة</td><td></td><td></td><td>غرفة مانعة لتسرب الماء تهدف إلى تقليل التبخر</td></tr><tr><td>الكلوروفورم</td><td>يمكن استبدال Sigma</td><td>C2432</td><td>> = 99.5٪</td></tr> <tr><td>DAPI</td><td>Roche</td><td>10236276001</td><td>من أي بائع</td></tr><tr><td>مناديل ممسحة مهمة دقيقة</td><td>يمكن استبدال Kimberley-Clark</td><td>34256CT</td><td>Kimwipes</td></tr><tr><td>D-glucose</td><td>Sigma</td><td>G7021-5KG</td><td>من أي بائع</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma</td><td>E7023</td><td>درجة البيولوجيا الجزيئية</td></tr><tr><td>إبر التغذية</td><td>إيقاع ، شركة</td><td>7910</td><td>معدن ؛ 20 X1-1 / 2 "W / 2-1 / 4 ؛ يمكن تعقيمها لتعقيم</td></tr><tr><td>FITC-UEA-1</td><td>Sigma</td><td>L9006-1MG</td><td>الفلوروفورات الأخرى المتاحة</td></tr><tr><td>FITC-WGA</td><td>Sigma</td><td>L4895-2MG</td><td>الفلوروفورات الأخرى المتاحة</td></tr><tr><td>وسادات الرغوة</td><td>فيشر</td><td>22038221</td><td>طلب وسادات الرغوة التي تتناسب مع الكاسيت</td></tr><tr><td>فورماميد</td><td>سيجما</td><td>47671</td><td>درجة البيولوجيا الجزيئية</td></tr><tr><td>حمض الخليك الجليدي</td><td>ماكرون للكيماويات</td><td>الدقيقة MK881746</td><td>كاشف ACS ، > = 99.5٪</td></tr> <tr><td>جرة كوبلين</td><td>زجاجية فيشر</td><td>08-815</td><td>تحمل ما يصل إلى 10 شرائح متتالية</td></tr><tr><td>أشرطة الأنسجة</td><td>Simport</td><td>M512</td><td>أشرطة عميقة حتى لا يتم سحق</td></tr><tr><td>الأعور أغطية التهجين</td><td>Sigma</td><td>GBL712222</td> فرن <td></td></tr><tr><td></td><td>تهجين خال من RNase</td><td></td><td>يمكن استبداله من أي بائع</td></tr><tr><td>يمكن استبدال LB</td><td></td><td></td><td>من أي</td></tr><tr><td>بائع وسائط</td><td></td><td></td> Lee <td>المعدة كما هو موضح في Lee et al. 1975</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma</td><td>179337</td><td>كاشف ACS ، > = 99.8٪</td></tr> <tr><td>مختبرات نهر تشارلز</td><td></td><td>028</td><td>بالغ BALB / c ؛ 18-21 جرام (8-10 أسابيع)</td></tr> <tr><td>بارافورمالدهايد</td><td>فيشر</td><td>50-980-487</td><td>محلول 16٪</td></tr><tr><td>شمع البارافين</td><td>Sigma</td><td>P3558-1KG</td><td>Paraplast لتضمين الأنسجة</td></tr><tr><td>PBS ، درجة الحموضة 7.4</td><td>وحدة إنتاج وسائط منشأة زراعة الخلايا UCSF</td><td></td><td>CCFAL003 الكالسيوم ، خالية من المغنيسيوم ؛ يمكن استبدالها من أي بائع</td></tr><tr><td>Penicillin G</td><td>Sigma</td><td>PENNA-100MU</td><td></td></tr><tr><td>Sabouraud dextrose agar</td><td></td><td></td> يمكن <td>أن يكون استبدال من أي بائع</td></tr><tr><td>سالين</td><td>باكستر</td><td>2F7123</td><td>معقم ، يمكن استبداله من أي بائع</td></tr><tr><td>يمكن استبدال كلوريد الصوديوم (NaCl)</td> <td>Sigma</td><td>S3014</td><td>من أي بائع ؛ الحفاظ على</td></tr><tr><td>كبريتات دوديسيل الصوديوم</td> الخالية من RNase (SDS) يمكن <td>استبدال Sigma</td><td>L3771</td><td>من أي بائع ؛ الحفاظ على Streptomycin Sigma S9137-100G</td></tr> <tr><td></td><td></td><td></td><td>الخالي من RNase</td></tr><tr><td>يمكن استبدال Super PAP pen</td><td>Life Technologies</td><td>8899</td><td>من أي بائع</td></tr><tr><td>يمكن استبدال Tris-HCl</td><td>Sigma</td><td>T3253</td><td>من أي بائع ؛ الحفاظ على مختبرات Vectashield Vector Laboratories الخالية من RNase</td></tr><tr><td></td><td></td><td>H-1000</td><td>لا يحتوي على DAPI</td></tr><tr><td>Xylenes</td><td>Sigma</td><td>214736</td><td>درجة</td></tr><tr><td>كاشف YEPD</td><td></td><td></td> يمكن <td>أن يكون استبدالها من أي مورد</td></tr></tbody></table>

التصور من المبيضات الbicans في الجهاز الهضمي murine باستخدام التهجين في الموقع الفلورسنت

Visualization of Candida albicans in the Murine Gastrointestinal Tract Using Fluorescent In Situ Hybridization

المبيضات الbicans هو عنصر فطري من الجراثيم الأمعاء في البشر والعديد من الثدييات الأخرى. علي الرغم من ان c. مبيض لا يسبب اعراضا في معظم المضيفين المستعمرين ، والخزان المعلق لا يعمل كمستودع للامراض المعدية ، ويرتبط وجود الطفيليات الفطرية العالية في الأمعاء مع مرض التهاب الأمعاء. هنا ، ونحن وصف طريقه لتصور c. مبيض الشكل الخلية والتعريب في نموذج الماوس من الاستعمار المعدي المعوي مستقره. يتم تاسيس الاستعمار باستخدام جرعه واحده من c. مبيض في الكائنات التي عولجت مع المضادات الحيوية عن طريق الفم. يتم إصلاح شرائح من انسجه الأمعاء بطريقه تحافظ علي الهندسة المعمارية لمحتويات الاناره (الكائنات الحية المجهرية والمخاط) وكذلك الغشاء المخاطي المضيف. وأخيرا ، يتم تنفيذ التهجين الفلورسنت في الموقع باستخدام مجسات ضد rrna الفطرية إلى وصمه عار ل c. مبيض و هيبهاي. ومن المزايا الرئيسية لهذا البروتوكول انه يسمح بالمراقبة المتزامنة لتشكل خليه c. مبيض وارتباطها المكاني مع الهياكل المضيفة اثناء الاستعمار الهضمي.

ووفقا للتعليمات المقدمة ، ستكون نتيجة هذه التقنية هي الوسم الفلوري لنوى في ظهاره المضيف ، والمخاط ، و c. مبيض في انسجه GI المقسمة. يجب ان تظهر خلايا المبيضات الbicans نوع البرية اما المستديرة ، خلايا الخميرة أحاديه الخلية أو ممدود للغاية ، والمتفرعة في بعض الأحيان ، الخلية الخلوية ، والانقسامات الخلايا لا تكون واضحة في هيبوهاي). المسوخ من c. مبيض قد تظهر بالاضافه إلى ذلك أصغر, ممدود قليلا "الرمادي" الخمائر أو أكبر, ممدود قليلا "القناة الهضمية" (الانتقالية التي يسببها المعدة) أو "مبهمه" الخمائر.
ويصور الشكل 1 ابره التغذية المستخدمة في الحقن عن طريق الفم ، فضلا عن المواضع الرئيسية للابره اثناء إجراءات الحقن. الشكل 2 يوفر الاعداد النموذجية المستخدمة لتشريح الجهاز وظهور شرائح GI من الماوس.
الشكل 3 يعرض الأسماك تلطيخ أنواع مختلفه من الخلايا c. مبيض بعد الانتشار في المختبر وداخل نموذج الماوس. الشكل 3A يظهر الفلورية والصور المرحلة من الثابتة ، تتخللها ، في المختبر-التي تروج لها هيبوهاي. هيفات تشكيل كان مع سائل [لي] متوسطه18 مع 2% ن-اسيتيل الجلوكوزامين, pH 6.8 في 37 [ك.]. ويبين الشكل 3ب الفلورية والصور المرحلة من الثابتة ، تتخللها ، في خلايا الخميرة الانبوبيه المنتشرة. الشكل 3ج ، D يظهر ثابته ، تتخللها ، في المختبر-الخلايا المعوية المنتشرة والخلايا غير الشفافة ، علي التوالي. الأمعاء وأنواع الخلايا غير الشفافة يمكن تمييزها شكليا الا عندما تصور عن طريق مسح المجهر الكتروني. يرجى ملاحظه ان تلطيخ الأسماك من الخلايا المنتشرة في المختبر سيكون دون الأمثل إذا كانت الخلايا ليست جيدا تتخلل. ويرد مثال علي تلطيخ الضعيفة ومنتشر في الشكل 3ج. للحصول علي أفضل النتائج ، يجب تحديد ظروف تثبيت الخلايا والتغلغل بشكل تجريبي لكل نوع خليه والأنواع التي سيتم التحقيق فيها. ولحسن الحظ ، فان البروتوكول الموصي به لتصور c. مبيض في الانسجه المقطوعة ينتج يتخلله أكثر اتساقا.
الشكل 3e-G تصور c. مبيض في الفئران الأمعاء الغليظة ، ملطخه المسبار c. مبيض محدده(الشكل 3ه) أو المسبار الفطرية (الشكل 3و ، ز). C. مبيض يظهر الأحمر في هذه الصور ، نوى الخلية المضيفة زرقاء ، وطبقه المخاط الأخضر. كلا الخمائر المستديرة والممدودة جدا (نصال الأبيض) تحدث في الأمعاء الغليظة. يرجى ملاحظه ان تلطيخ هو أكثر إشراقا مع المسبار الفطرية. الشكل 3(ز ) يصور ume6 متحولة في نفس المقصورة ، ملطخه بالمسبار الفطري ume6 ترميز عامل النسخ المطلوب لتشكيل هيفا تحت الظروف المختبرية19 . ومن المثير للاهتمام ، لم يتم تلخيص النمط الظاهري الخميرة مقفله التي عرضها هذا المتحول تحت الظروف في المختبر داخل القناة الهضمية ، مما يوحي بأنه يجب تنشيط عامل زائده داخل المضيف12. ويصور الشكل 4 ظهور النوع البري c. مبيض في أجزاء مختلفه من القناة الهضمية murine ، بما في ذلك المناطق المتاخمة مباشره إلى الغشاء المخاطي المضيف والمناطق المركزية أكثر من تجويف الأمعاء.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60283/60283fig01.jpg"> الشكل 1: وضع ابره التغذية الرئيسية اثناء العصر الجاف. (ا) تغذيه الابره. (ب) تغذيه الكره ابره ادراجها إلى جانب اللسان. (ج) تغذيه ابره في وضع تستقيم مع الادراج في المريء. (د) إدخال ابره التغذية في المعدة مع بضعة ملليمترات مرئية فوق الأنف. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60283/60283fig01large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60283/60283fig02.jpg"> الشكل 2: مخطط تشريح المثال. (ا) وساده التشريح والاداات. (ب) القناة الهضمية التي تم الاعفاء منها. القريب (المريء) إلى الأقسام البعيدة (الشرج): المعدة. ثانيا-الأمعاء الصغيرة القريبة. III. الأمعاء الصغيرة الوسطي. رابعا-الأمعاء الصغيرة البعيدة. V. Cecum. سادسا-الأمعاء الغليظة. تشير مربعات الحدود المتقطعة الوردية إلى الانسجه التي سيتم إصلاحها. (ج) الانسجه التي توضع في الكاسيت. الأرقام الرومانية هي نفسها كما في لوحه b. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60283/60283fig02large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60283/60283fig03.jpg"> الشكل 3: صور تمثيليه من الأسماك الملطخة c. مبيض. (ا) اسماك c. مبيض هيهاينمتفي وسائل الاعلام لي السائل18 مع 2 ٪ ن-اسيتيل الجلوكوزامين ، pH 6.8. (ب) الأسماك من c. مبيض الخلايا الخميرة المستديرة نمت علي yepd + 2 ٪ لوحات أجار. (ج) الأسماك من الخلايا المعوية c. مبيض (ySN1045) نمت علي لوحات أجار yepd + 2 ٪. (د) سمك الخلايا المبهمة من c. مبيض نمت علي لوحات الاجار yepd + 2 ٪. (ه) النوع البري c. مبيض (ySN250) في الأمعاء الغليظة ، ملطخه المسبار c. مبيض الخاصة. (و) النوع البري c. مبيض في الأمعاء الغليظة ، ملطخه المسبار الفطري. (ز) Ume6 متحولة (ySN1479) في الأمعاء الغليظة ، ملطخه المسبار الفطرية: الأحمر هو c. مبيض، الأزرق هو نواه الظهاريه المضيف ، والأخضر هو mucin. نصال تشير إلى هيهاي الأسهم تشير إلى الخميرة. قضبان المقياس = 20 μm. تم تكييف الصورتين F و G من ويدلي وآخرون12. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60283/60283fig03large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60283/60283fig04.jpg"> الشكل 4: ظهور الأسماك الملونة c. مبيض في مقصورات الأمعاء مختلفه. ويظهر نوع البرية c. مبيض في الأجزاء المشار اليها من الجهاز الهضمي الماوس. داخل كل مقصوره ، تصور الصور المنطقة المجاورة لغشاء المخاطية المضيف والمنطقة الوسطي من تجويف الأمعاء. تم تنفيذ تلطيخ مع المسبار الفطرية. شريط مقياس = 20 ميكرومتر. وقد تم تكييف الصور من ويدلي وآخرون12. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60283/60283fig04large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="4">مخزون المضادات الحيوية (200x)</td>
		</tr>
<tr>
<td>البنسلين G</td>
			<td>181 ملغ/مل</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>الستربتومايسين</td>
			<td>400 mg/μL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">ميثاكارن</td>
		</tr>
<tr>
<td>الاسهم</td>
			<td>التركيز النهائي</td>
			<td>حجم</td>
			<td>وحدات</td>
		</tr>
<tr>
<td>الميثانول</td>
			<td>60 في المائة</td>
			<td>300</td>
			<td>مل</td>
		</tr>
<tr>
<td>كلوروفورم</td>
			<td>30</td>
			<td>150</td>
			<td>مل</td>
		</tr>
<tr>
<td>حمض الخليك الجليدي</td>
			<td>10</td>
			<td>50</td>
			<td>مل</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">التهجين الحل</td>
		</tr>
<tr>
<td>الاسهم</td>
			<td>التركيز النهائي</td>
			<td>حجم</td>
			<td>وحدات</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 متر تريس-HCl ، pH 7.4</td>
			<td>20 مم</td>
			<td>20</td>
			<td>ميكرولتر</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 م كلوريد الصوديوم</td>
			<td>0.9 M</td>
			<td>180</td>
			<td>ميكرولتر</td>
		</tr>
<tr>
<td>10% SDS</td>
			<td>0.10 في المائة</td>
			<td>10</td>
			<td>ميكرولتر</td>
		</tr>
<tr>
<td>100% فورماميد</td>
			<td>1.00 في المائة</td>
			<td>10</td>
			<td>μL (الاحتفاظ بها في الارصفه الصغيرة عند-20 درجه مئوية بين الاستخدامات)</td>
		</tr>
<tr>
<td>المياه الخالية من RNase</td>
			<td></td>
			<td>780</td>
			<td>ميكرولتر</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">حل غسل الأسماك</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 متر تريس-HCl ، pH 7.4</td>
			<td>20 مم</td>
			<td>1</td>
			<td>مل</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 م كلوريد الصوديوم</td>
			<td>0.9 M</td>
			<td>9</td>
			<td>مل</td>
		</tr>
<tr>
<td>المياه الخالية من RNase</td>
			<td></td>
			<td>40</td>
			<td>مل</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">محلول لتلطيخ النوى المخاطية</td>
		</tr>
<tr>
<td>DAPI ، 10 ميكروغرام/مل</td>
			<td>20 نانوغرام/مل</td>
			<td>2</td>
			<td>ميكرولتر</td>
		</tr>
<tr>
<td>لكتين ، 40 ميكروغرام/مل</td>
			<td>1.6 ميكروغرام/مل</td>
			<td>40</td>
			<td>ميكرولتر</td>
		</tr>
<tr>
<td>ال7.4 التلفزيوني ، pH</td>
			<td></td>
			<td>958</td>
			<td>ميكرولتر</td>
		</tr>
</tbody></table>الجدول 1: الاحجام والتركيزات النموذجية للحلول المستخدمة في هذا البروتوكول.

الغرض من هذا البروتوكول هو تصور شكل خليه المبيضات الbicans والتعريب في الجهاز الهضمي الثدييات.

التصور من المبيضات الbicans في الجهاز الهضمي Murine باستخدام التهجين في الموقع الفلورسنت

Candida albicans is a fungal component of the gut microbiota in humans and many other mammals. Although C. albicans does not cause symptoms in most ...

وقد أثمرت هذا البروتوكول بعض من أفضل الأفكار لدينا حتى الآن في كيفية المبيضات albicans يسكن الجهاز الهضمي الثدييات. على سبيل المثال ، حتى وقت قريب ، لم نكن نعرف حقا أين يتم توطين المبيضات داخل القناة الهضمية أو أي من أشكالها المورفولوجية العديدة التي تفترضها داخل هذه المتخصصة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح للمرء بتصور المبيضات داخل بيئتها الطبيعية دون تعطيل التفاعلات ثلاثية الأبعاد التي يمتلكها الفطريات مع الهياكل المضيفة أو مع البكتيريا في الميكروبات.لأن القناة الهضمية هي بيئة معقدة، فإنه من الصعب جدا لنموذج في المختبر، وبالتالي كان مرضية جدا لإيجاد وسيلة للتحقيق علم الأحياء المبيضات مباشرة في نموذج المضيف. يشتبه في بعض مكونات ميكروبيوتا الأمعاء بما في ذلك المبيضات ألبيكانس للعب أدوار في أمراض مثل مرض التهاب الأمعاء. يمكن استخدام هذه التقنية لتشخيص وجود كائنات دقيقة محددة في عينات خزعة تم الحصول عليها من المرضى.إتقان تقنية gavage والقدرة على تشريح شرائح الجهاز الهضمي دون تمزيق الأعضاء مهم للحصول على أفضل النتائج. للبدء ، gavage كل مع حجم محسوب من inoculum معين. إرفاق إبرة تغذية الحيوانات autoclaved لحقنة ملليلتر واحد وملء الحقنة مع حجم gavage واحد مع التأكد من إزالة جميع الفقاعات.ضع الحقنة على سطح معقمة. لتأمين الحيوان ، عقد في قاعدة الذيل مع اليد المهيمنة وشريحة اليد غير المهان حتى ظهر الحيوان إلى الجلد فضفاضة وراء الأذنين. جمع scruff معا بإحكام مع الإبهام والسبابة.التقاط الحيوان من قبل scruff، الوجه أكثر من وحلقة إصبع صغير من نفس اليد حول الذيل لشل الحيوان ضد كف اليد. بلطف تمديد رأس الحيوان بحيث يكون في خط مستقيم مع الجسم. ثم التقط الحقنة باليد المهيمنة وقم بإمساكها عموديًا على الحيوان مع الإبرة المنحنية التي تشير إلى الأسفل.استخدام الكرة من الإبرة لربط بلطف داخل زاوية من الفم وتقدم الإبرة على طول جانب الفم إلى الجزء الخلفي من الحلق، ثم نقل الإبرة إلى المركز. مرة واحدة في الكرة من الإبرة في الجزء الخلفي من الحلق الحيوان، إمالة الإبرة حتى تكون موازية مع خط جسم الحيوان والسماح لها بالانزلاق بسلاسة أسفل الحلق. إذا لم تنزلق الإبرة بسلاسة إلى أسفل الحلق، فقد لا يتم وضع الإبرة بشكل صحيح ويجب سحبها لإعادة وضعها والمحاولة مرة أخرى.تقدم بسلاسة الإبرة السماح للحيوان بابتلاع الإبرة حتى تبقى فقط بضعة ملليمترات مرئية. اختبار أن الكرة من الإبرة في المعدة عن طريق التقدم بلطف المكبس وإذا لم يكن هناك مقاومة، ومواصلة تقديم inoculum. سحب ببطء الإبرة مرة واحدة وقد تم إعطاء inoculum ووضع الحيوان في قفصه.مواصلة مراقبة الحيوان لمدة خمس إلى 10 دقائق لعلامات التنفس أو الضيق مجهدة والتحقق من أنه يستأنف النشاط الطبيعي بعد وقت قصير من gavage. إذا سيتم استخدام نفس inoculum للحيوان القادم، تنظيف الإبرة مع مسح الكحول. إذا سيتم استخدام حقنة مختلفة، استبدل الإبرة.استخدام ملقط حادة العضوية لقرصة جزء من جلد البطن وجلس الجلد والزى الكامن بالقرب من قاعدة الحوض باستخدام مقص. تمديد شق في شكل U على طول كل جانب من تجويف البريتونية، وما يصل إلى القفص الصدري، ثم رفع الجلد للخروج من الطريق. استخدام ملقط حادة العضوية لاستخراج بلطف cecum من تجويف البريتوني باستخدام مقص لقطع الاتصالات بين ال cecum والأمعاء الصغيرة والكبيرة.وضع cecum بأكمله في كاسيت علم الأنسجة بحيث يكون untwisted ويضع شقة. ضع وسادة الرغوة الثانية على القمة واغلق الكاسيت. ثم ضع الكاسيت في جرة قبعة المسمار التي تحتوي على الميثاكارن.اكوس قسم الأمعاء الغليظة الذي يحتوي على واحد إلى اثنين من كريات البراز وله طول أقل من الكاسيت. ضع الأنسجة في الكاسيت مع إبقائها مسطحة وغير مُتَرَقة. تراكب مع لوحة الرغوة الثانية، وإغلاق الكاسيت ووضعها في الميثاكارن.لكل قسم من الأمعاء الدقيقة التي يجب أخذها، مكوس قطعة سنتيمتر واحد إلى اثنين تحتوي على بعض المواد الهضمية. وضع الأنسجة في الكاسيت، تراكب مع وسادة رغوة الثاني، وإغلاق الكاسيت ووضعها في الميثاكارين. عند استئصال المعدة، قطع الاتصالات إلى المريء والأمعاء الدقيقة.ضع الأنسجة في الكاسيت ووضع الكاسيت في الميثاكارن. اترك الكاسيتات في محلول الميثاكارين في درجة حرارة الغرفة لمدة ثلاث ساعات على الأقل ولكن أقل من أسبوعين. بعد التثبيت، وإزالة منصات رغوة والعودة كل قسم الأنسجة سليمة في الكاسيت لها.ثم غسل الأنسجة مرتين لمدة 35 دقيقة في 100٪ الميثانول، مرتين لمدة 25 دقيقة في 100٪ الإيثانول، ومرتين لمدة 20 دقيقة في إكسيلين. بات أشرطة جافة على منشفة ورقية ووضعها في الشمع البارافين قبل ذاب لمدة ساعتين في 70 درجة مئوية في فرن التهجين. ثم إزالة أشرطة من الشمع، والسماح للشمع الزائد لاستنزاف وتخزينها في درجة حرارة الغرفة حتى يتم تضمينها في كتل الشمع.إزالة الشمع من البارافين جزءا لا يتجزأ من أقسام النسيج عن طريق إدراج الشرائح في جرة قبل الدفء مليئة بالزيلين. اترك الجرة عند درجة حرارة 60 درجة مئوية لمدة 10 دقائق، ثم تخلص من غسل الزيلين. صب ازلين درجة حرارة الغرفة الطازجة في جرة وتكرار الحضانة.ثم املأ الجرة بالإيثانول بنسبة 100٪ واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. بعد الحضانة، وإزالة الشرائح من جرة والهواء الجافة لهم. لتلطيخ C.albicans مع مسبار السمك، تبدأ برسم دائرة حول قسم الأنسجة باستخدام بات القلم.الماصات 50 ميكرولتر من مسبار يحتوي على حل التهجين على الأنسجة الثابتة وانتشرت بلطف مع طرف ماصة. تراكب السائل مع غطاء التهجين مع التأكد من منع الفقاعات. ثم ختم الشرائح في غرفة تهجين المياه ضيق واحتضان المقاطع لمدة ثلاث ساعات في 50 درجة مئوية في فرن التهجين في الظلام.بعد الحضانة، إضافة محلول الغسيل إلى جرة كوبلين. قم بإزالة الغطاء بعناية من الشريحة باستخدام ملقط ووضع الشريحة في محلول الغسيل. تغطية جرة مع رقائق الألومنيوم واحتضان ذلك في 50 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.بعد ذلك ، قم بغسل الشرائح عن طريق صب محلول الغسيل وإعادة ملء الجرة باستخدام PBS. صب فورا قبالة وإعادة ملء مع برنامج تلفزيوني جديد تكرار العملية لما مجموعه اثنين من يغسل. ويك بعيدا برنامج تلفزيوني مع مسح مهمة حساسة ودائرة قسم الأنسجة المعوية مع بات القلم.ضع الشرائح في حاوية بلاستيكية مبهمة وأضف 50 ميكرولترات من محلول تلطيخ نوات الميوسين إلى قسم الأنسجة. تغطية الحاوية مع رقائق الألومنيوم واحتضانه في أربع درجات مئوية لمدة 45 دقيقة. بعد الحضانة، وضع الشرائح في جرة كوبلين وغسلها مرتين مع برنامج تلفزيوني.اضغط بعيدا برنامج تلفزيوني الزائدة على منشفة ورقية ثم الفتيل بعيدا قطرات النهائي مع الأنسجة. ضع قطرة واحدة من المتوسط المتصاعد على كل قسم وتراكبه مع غطاء زجاجي مع التأكد من منع الفقاعات. دع المتوسط المتصاعد ينتشر تحت الغطاء بأكمله.مرساة الغطاء في مكان مع طلاء الأظافر في زوايا وصورة الشرائح باستخدام المجهر الفلورسنت. ويمكن استخدام هذا البروتوكول لتسمية فلورية C.albicans في المختبر وفي الأنسجة المضيفة. في المختبر نشر hyphae، خلايا الخميرة جولة، خلايا الأمعاء، والخلايا المبهمة كانت ثابتة، permeabilized، وتميزت مع المنظار الفلوري والتباين المرحلة.تم تصوير الخمائر المستديرة والهيبا الممدود للغاية في الأمعاء الغليظة للماوس. كانت الأنسجة المضيفة ملطخة بمسبار C.albicans المحدد أو مسبار panfungal. تم تسمية C.albicans الأحمر، الخلية المضيفة نواة الأزرق، وطبقة المخاط الخضراء.تم الكشف عن C.albicans في أجزاء مختلفة من الجهاز الهضمي مورين بما في ذلك المناطق المتاخمة مباشرة للغشاء المخاطي المضيف والمناطق المركزية أكثر من تجويف الأمعاء. بالنسبة للعلماء الذين لم يسبق لهم تنفيذ تقنية الـ gavage ، من المهم الحصول على تدريب متخصص قبل محاولة هذه الطريقة. بعد تلطيخ الأسماك، يمكن استخدام تقنيات الفلورسنت للتلوين ميزات إضافية من الغشاء المخاطي المضيف.وهذا يمكن أن يسمح لتوصيف تلف الأنسجة أو الاستجابات المناعية للمضيف. وقد سمحت لنا هذه التقنية لتوصيف العلاقة بين مورفولوجيا الخلية الفطرية من المسوخ المبيضات ألبيكان والبقاء على قيد الحياة داخل المضيف تعزيز فهمنا لبيولوجيا المبيضات ألبيكانس التي يمكن الاستفادة منها عند تطوير العلاجات.

visualization-candida-albicans-murine-gastrointestinal-tract-using

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

علم المناعة والعدوى

والتطوير السريع، وصغر حجمها والشفافية من الزرد هي مزايا هائلة لدراسة سيطرة المناعة الفطرية...

غير الغازية التصوير من المبيضات المنتشر في يرقات اسماك الزرد

المصدر: نغ، ك. م.، تروبيني، سي. تصور تفاعلات ميكروبيوم الأمعاء مع المضيف عبر التهجين الفلوري في الموقع ، تلوين الليكتين، والتصوير. J. Vis. Exp. (2021).يوضح هذا الفيديو عملية التهجين بالفلورة في الموقع (FISH) لتلوين ميكروبيوتا الأمعاء داخل أنسجة أمعاء الفئران عن طريق تهجين المجسات الفلورية مع حمض الريبونوكلييك البكتيري (rRNA) وصبغ هياكل المضيف للتحليل المجهري.

التهجين الفلوري في الموقع لبكتيريا الأمعاء في مقاطع أمعاء الفئران

يوضح هذا الفيديو تطوير نموذج فأر في الجسم الحي لدراسة تكوين الأغشية الحيوية للمبيضات البيضاء في الأنسجة تحت الجلد. تتضمن التجربة زرع أجهزة مصابة بالشميضات في المنطقة الخلفية للحيوان لتطوير الأغشية الحيوية.

المبيضات البيضاء تكوين الأغشية الحيوية في نموذج فأر In Vivo

نقدم إجراء تجريبيا لتطوير الأغشية الحيوية المبيضات البيضاء في نموذج تحت الجلد للفأر. تم قياس الأغشية الحيوية الفطرية من خلال تحديد عدد وحدات تكوين المستعمرة وعن طريق تصوير التلألؤ البيولوجي غير الجراحي ، حيث تتوافق كمية الضوء التي يتم إنتاجها مع عدد الخلايا القابلة للحياة.

المبيضات البيض بيوفيلم التنمية على الهيئات الأجنبية طبيا ذات الصلة في الماوس تحت الجلد نموذج تلاه ضوء بارد التصوير

نصف هنا تقنية قائمة على المجهر لتصور وتحديد الشلالات المبكرة للأحداث أثناء البلعمة لمسببات الأمراض مثل الفطريات المبيضات البيضاء والجسيمات التي يزيد حجمها عن 0.5 ميكرومتر بما في ذلك الخرز الزيموزان والمغلفة ب IgG.

تصور المراحل المبكرة من البلعمة

لعرض وتحديد الميزات الداخلية للأفلام الحيوية المبيضات albicans، ونحن إعداد العينات سليمة ثابتة التي يتم توضيحها عن طريق مطابقة مؤشر الانكسار. ثم ، يمكن استخدام المجهر المقطعي البصري للحصول على بيانات صور ثلاثية الأبعاد على الرغم من السماكة الكاملة للبيوفيلم.

توضيح والتصوير المبيضات ألبيكانس بيوفيم

مقايسة الجسم الحي السابق المذكورة في هذه الدراسة باستخدام مستخلصات التجانس الأمعاء وتلطيخ المناعة الفلوريس يمثل طريقة جديدة لدراسة التشكل الواصل من المبيضات albicans في الجهاز الهضمي. ويمكن استخدام هذه الطريقة للتحقيق في الإشارات البيئية التي تنظم التحول المورفوجينيك في القناة الهضمية.

مُسَاَنّة مُعَدِيّة سابقة لدراسة المبيضات المبيضات البَيكانسِيّة الواصلة Morphogenesi في الجهاز الهضمي

يفصل هذا البروتوكول المبسط سير العمل للكشف عن البكتيريا في عينات الأنسجة المعقدة وصورها ، من إصلاح الأنسجة إلى تلطيخ الميكروبات بالفلورسنت في التهجين الموقعي .

تصور التفاعلات الأمعاء Microbiota المضيف عبر الفلورسينس في التهجين الموقع ، تلطيخ ليكتين، والتصوير

غالبا ما ترتبط الميكروبات المعوية ، بما في ذلك البكتيريا خارج الخلية ومسببات الأمراض داخل الخلايا مثل فيروس أورساي والميكروسبوريديا (الفطريات) ، بالديدان الخيطية الخيطية البرية Caenorhabditis . تقدم هذه المقالة بروتوكولا للكشف عن الميكروبات التي تستعمر و / أو تصيب الديدان الخيطية C. elegans وقياسها ، ولقياس حمل مسببات الأمراض بعد العدوى الخاضعة للرقابة في المختبر.

التهجين الفلوري للحمض النووي الريبي في الموقع (FISH) لتصور الاستعمار الميكروبي والعدوى في أمعاء Caenorhabditis elegans

تصف هذه المخطوطة طريقة لفحص مكتبات المبيضات المبيضات المتحولة متوسطة الحجم بحثا عن الأنماط الظاهرية للتشكل أثناء العدوى النشطة في مضيف الثدييات باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر غير الغازي.

استخدام التصوير في الجسم الحي للكشف عن الأنماط الظاهرية للتشكل في سلالات المبيضات البيض الطافرة أثناء العدوى النشطة في مضيف الثدييات

أنشأنا نموذجا للفأر للعدوى المرتبطة بالقسطرة المرتبطة ب C.albicans (CRI) ، حيث يتشكل الغشاء الحيوي على القسطرة ، ويرتبط التفاعل بين C.albicans والمضيف جيدا مع CRI السريري. يساعد هذا النموذج في فحص العلاجات ل CRI المرتبط بالأغشية الحيوية C.albicans ، مما يضع أساسا للتحول السريري.

نموذج عدوى المبيضات البيض المرتبط بالقسطرة في الماوس

اكتشف تقنية التهجين الفلورسنتي لتصور Candida albicans في الجهاز الهضمي للفئران. تتيح هذه الطريقة دراسة تفاعلات الفطريات مع البكتيريا المعوية والأنسجة المضيفة مباشرة.

التصور من المبيضات الbicans في الجهاز الهضمي Murine باستخدام التهجين في الموقع الفلورسنت

استكشف المزيد من الفيديوهات