التصور من المبيضات الbicans في الجهاز الهضمي Murine باستخدام التهجين في الموقع الفلورسنت

الغرض من هذا البروتوكول هو تصور شكل خليه المبيضات الbicans والتعريب في الجهاز الهضمي الثدييات.

وقد أثمرت هذا البروتوكول بعض من أفضل الأفكار لدينا حتى الآن في كيفية المبيضات albicans يسكن الجهاز الهضمي الثدييات. على سبيل المثال ، حتى وقت قريب ، لم نكن نعرف حقا أين يتم توطين المبيضات داخل القناة الهضمية أو أي من أشكالها المورفولوجية العديدة التي تفترضها داخل هذه المتخصصة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح للمرء بتصور المبيضات داخل بيئتها الطبيعية دون تعطيل التفاعلات ثلاثية الأبعاد التي يمتلكها الفطريات مع الهياكل المضيفة أو مع البكتيريا في الميكروبات.

لأن القناة الهضمية هي بيئة معقدة، فإنه من الصعب جدا لنموذج في المختبر، وبالتالي كان مرضية جدا لإيجاد وسيلة للتحقيق علم الأحياء المبيضات مباشرة في نموذج المضيف. يشتبه في بعض مكونات ميكروبيوتا الأمعاء بما في ذلك المبيضات ألبيكانس للعب أدوار في أمراض مثل مرض التهاب الأمعاء. يمكن استخدام هذه التقنية لتشخيص وجود كائنات دقيقة محددة في عينات خزعة تم الحصول عليها من المرضى.

إتقان تقنية gavage والقدرة على تشريح شرائح الجهاز الهضمي دون تمزيق الأعضاء مهم للحصول على أفضل النتائج. للبدء ، gavage كل مع حجم محسوب من inoculum معين. إرفاق إبرة تغذية الحيوانات autoclaved لحقنة ملليلتر واحد وملء الحقنة مع حجم gavage واحد مع التأكد من إزالة جميع الفقاعات.

ضع الحقنة على سطح معقمة. لتأمين الحيوان ، عقد في قاعدة الذيل مع اليد المهيمنة وشريحة اليد غير المهان حتى ظهر الحيوان إلى الجلد فضفاضة وراء الأذنين. جمع scruff معا بإحكام مع الإبهام والسبابة.

التقاط الحيوان من قبل scruff، الوجه أكثر من وحلقة إصبع صغير من نفس اليد حول الذيل لشل الحيوان ضد كف اليد. بلطف تمديد رأس الحيوان بحيث يكون في خط مستقيم مع الجسم. ثم التقط الحقنة باليد المهيمنة وقم بإمساكها عموديًا على الحيوان مع الإبرة المنحنية التي تشير إلى الأسفل.

استخدام الكرة من الإبرة لربط بلطف داخل زاوية من الفم وتقدم الإبرة على طول جانب الفم إلى الجزء الخلفي من الحلق، ثم نقل الإبرة إلى المركز. مرة واحدة في الكرة من الإبرة في الجزء الخلفي من الحلق الحيوان، إمالة الإبرة حتى تكون موازية مع خط جسم الحيوان والسماح لها بالانزلاق بسلاسة أسفل الحلق. إذا لم تنزلق الإبرة بسلاسة إلى أسفل الحلق، فقد لا يتم وضع الإبرة بشكل صحيح ويجب سحبها لإعادة وضعها والمحاولة مرة أخرى.

تقدم بسلاسة الإبرة السماح للحيوان بابتلاع الإبرة حتى تبقى فقط بضعة ملليمترات مرئية. اختبار أن الكرة من الإبرة في المعدة عن طريق التقدم بلطف المكبس وإذا لم يكن هناك مقاومة، ومواصلة تقديم inoculum. سحب ببطء الإبرة مرة واحدة وقد تم إعطاء inoculum ووضع الحيوان في قفصه.

مواصلة مراقبة الحيوان لمدة خمس إلى 10 دقائق لعلامات التنفس أو الضيق مجهدة والتحقق من أنه يستأنف النشاط الطبيعي بعد وقت قصير من gavage. إذا سيتم استخدام نفس inoculum للحيوان القادم، تنظيف الإبرة مع مسح الكحول. إذا سيتم استخدام حقنة مختلفة، استبدل الإبرة.

استخدام ملقط حادة العضوية لقرصة جزء من جلد البطن وجلس الجلد والزى الكامن بالقرب من قاعدة الحوض باستخدام مقص. تمديد شق في شكل U على طول كل جانب من تجويف البريتونية، وما يصل إلى القفص الصدري، ثم رفع الجلد للخروج من الطريق. استخدام ملقط حادة العضوية لاستخراج بلطف cecum من تجويف البريتوني باستخدام مقص لقطع الاتصالات بين ال cecum والأمعاء الصغيرة والكبيرة.

وضع cecum بأكمله في كاسيت علم الأنسجة بحيث يكون untwisted ويضع شقة. ضع وسادة الرغوة الثانية على القمة واغلق الكاسيت. ثم ضع الكاسيت في جرة قبعة المسمار التي تحتوي على الميثاكارن.

اكوس قسم الأمعاء الغليظة الذي يحتوي على واحد إلى اثنين من كريات البراز وله طول أقل من الكاسيت. ضع الأنسجة في الكاسيت مع إبقائها مسطحة وغير مُتَرَقة. تراكب مع لوحة الرغوة الثانية، وإغلاق الكاسيت ووضعها في الميثاكارن.

لكل قسم من الأمعاء الدقيقة التي يجب أخذها، مكوس قطعة سنتيمتر واحد إلى اثنين تحتوي على بعض المواد الهضمية. وضع الأنسجة في الكاسيت، تراكب مع وسادة رغوة الثاني، وإغلاق الكاسيت ووضعها في الميثاكارين. عند استئصال المعدة، قطع الاتصالات إلى المريء والأمعاء الدقيقة.

ضع الأنسجة في الكاسيت ووضع الكاسيت في الميثاكارن. اترك الكاسيتات في محلول الميثاكارين في درجة حرارة الغرفة لمدة ثلاث ساعات على الأقل ولكن أقل من أسبوعين. بعد التثبيت، وإزالة منصات رغوة والعودة كل قسم الأنسجة سليمة في الكاسيت لها.

ثم غسل الأنسجة مرتين لمدة 35 دقيقة في 100٪ الميثانول، مرتين لمدة 25 دقيقة في 100٪ الإيثانول، ومرتين لمدة 20 دقيقة في إكسيلين. بات أشرطة جافة على منشفة ورقية ووضعها في الشمع البارافين قبل ذاب لمدة ساعتين في 70 درجة مئوية في فرن التهجين. ثم إزالة أشرطة من الشمع، والسماح للشمع الزائد لاستنزاف وتخزينها في درجة حرارة الغرفة حتى يتم تضمينها في كتل الشمع.

إزالة الشمع من البارافين جزءا لا يتجزأ من أقسام النسيج عن طريق إدراج الشرائح في جرة قبل الدفء مليئة بالزيلين. اترك الجرة عند درجة حرارة 60 درجة مئوية لمدة 10 دقائق، ثم تخلص من غسل الزيلين. صب ازلين درجة حرارة الغرفة الطازجة في جرة وتكرار الحضانة.

ثم املأ الجرة بالإيثانول بنسبة 100٪ واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. بعد الحضانة، وإزالة الشرائح من جرة والهواء الجافة لهم. لتلطيخ C.albicans مع مسبار السمك، تبدأ برسم دائرة حول قسم الأنسجة باستخدام بات القلم.

الماصات 50 ميكرولتر من مسبار يحتوي على حل التهجين على الأنسجة الثابتة وانتشرت بلطف مع طرف ماصة. تراكب السائل مع غطاء التهجين مع التأكد من منع الفقاعات. ثم ختم الشرائح في غرفة تهجين المياه ضيق واحتضان المقاطع لمدة ثلاث ساعات في 50 درجة مئوية في فرن التهجين في الظلام.

بعد الحضانة، إضافة محلول الغسيل إلى جرة كوبلين. قم بإزالة الغطاء بعناية من الشريحة باستخدام ملقط ووضع الشريحة في محلول الغسيل. تغطية جرة مع رقائق الألومنيوم واحتضان ذلك في 50 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.

بعد ذلك ، قم بغسل الشرائح عن طريق صب محلول الغسيل وإعادة ملء الجرة باستخدام PBS. صب فورا قبالة وإعادة ملء مع برنامج تلفزيوني جديد تكرار العملية لما مجموعه اثنين من يغسل. ويك بعيدا برنامج تلفزيوني مع مسح مهمة حساسة ودائرة قسم الأنسجة المعوية مع بات القلم.

ضع الشرائح في حاوية بلاستيكية مبهمة وأضف 50 ميكرولترات من محلول تلطيخ نوات الميوسين إلى قسم الأنسجة. تغطية الحاوية مع رقائق الألومنيوم واحتضانه في أربع درجات مئوية لمدة 45 دقيقة. بعد الحضانة، وضع الشرائح في جرة كوبلين وغسلها مرتين مع برنامج تلفزيوني.

اضغط بعيدا برنامج تلفزيوني الزائدة على منشفة ورقية ثم الفتيل بعيدا قطرات النهائي مع الأنسجة. ضع قطرة واحدة من المتوسط المتصاعد على كل قسم وتراكبه مع غطاء زجاجي مع التأكد من منع الفقاعات. دع المتوسط المتصاعد ينتشر تحت الغطاء بأكمله.

مرساة الغطاء في مكان مع طلاء الأظافر في زوايا وصورة الشرائح باستخدام المجهر الفلورسنت. ويمكن استخدام هذا البروتوكول لتسمية فلورية C.albicans في المختبر وفي الأنسجة المضيفة. في المختبر نشر hyphae، خلايا الخميرة جولة، خلايا الأمعاء، والخلايا المبهمة كانت ثابتة، permeabilized، وتميزت مع المنظار الفلوري والتباين المرحلة.

تم تصوير الخمائر المستديرة والهيبا الممدود للغاية في الأمعاء الغليظة للماوس. كانت الأنسجة المضيفة ملطخة بمسبار C.albicans المحدد أو مسبار panfungal. تم تسمية C.albicans الأحمر، الخلية المضيفة نواة الأزرق، وطبقة المخاط الخضراء.

تم الكشف عن C.albicans في أجزاء مختلفة من الجهاز الهضمي مورين بما في ذلك المناطق المتاخمة مباشرة للغشاء المخاطي المضيف والمناطق المركزية أكثر من تجويف الأمعاء. بالنسبة للعلماء الذين لم يسبق لهم تنفيذ تقنية الـ gavage ، من المهم الحصول على تدريب متخصص قبل محاولة هذه الطريقة. بعد تلطيخ الأسماك، يمكن استخدام تقنيات الفلورسنت للتلوين ميزات إضافية من الغشاء المخاطي المضيف.

وهذا يمكن أن يسمح لتوصيف تلف الأنسجة أو الاستجابات المناعية للمضيف. وقد سمحت لنا هذه التقنية لتوصيف العلاقة بين مورفولوجيا الخلية الفطرية من المسوخ المبيضات ألبيكان والبقاء على قيد الحياة داخل المضيف تعزيز فهمنا لبيولوجيا المبيضات ألبيكانس التي يمكن الاستفادة منها عند تطوير العلاجات.