الفاصل الزمني التصوير الحي والقياس الكمي لديناميات فرع التقشر السريع في تطوير الخلايا العصبية Drosophila
سبتمبر 25, 2019
هنا، نقوم بوصف الطريقة التي استخدمناها لتصوير فيلوبوديا الددرية المنوية في إعداد مباشر لدماغ اليرقات دروسوفيلا، والبروتوكول الذي قمنا بتطويره لتحديد مجموعات بيانات التصوير ثلاثي الأبعاد الفاصلة زمنياً للتقييمات الكمية للدندريت ديناميات في تطوير الخلايا العصبية.
يوفر هذا البروتوكول نهجًا جديدًا لتحديد ديناميات الفرع في arbor المتسخ وتطوير الخلايا العصبية باستخدام التصوير المباشر لفاصل الوقت وبرنامج شرح صورة ثلاثية الأبعاد. هذه التقنية صور وتتبع المحطات الفرعية توفير طريقة سريعة وفعالة لقياس السلوكيات الديناميكية من الفيلوبوديا التشجر. توفر الأبحاث التي تستخدم هذه الطريقة نظرة ثاقبة على فهم كيفية تنظيم التطوير والنشاط لتحول التشعب.
طرقنا قابلة للتطبيق على الخلايا العصبية المسماة قليلة في كل من في المختبر وفي إعدادات الجسم الحي. عند تنفيذ هذا الإجراء، تذكر أنه يجب تعديل معلمات التصوير بعناية لتحقيق دقة زمنية ومكانية كافية. لحصاد العقول من drosophila اليرقات، تحت مجهر تشريح استخدام زوج واحد من عدد خمسة أصابع تشريح تلميح القياسية لعقد عينة اليرقات في مكان أثناء استخدام الآخر لتشريح بعناية الدماغ، والحفاظ على أقراص العين، فصوص الدماغ، والحبل العصبي البطني.
ثم قم بإزالة العضلات المرفقة لتقليل أي حركة للعينة أثناء التصوير. عندما تم حصاد كل من العقول، واستخدام الشحوم فراغ لرسم غرفة مربعة على شريحة زجاجية وإضافة 20 ميكرولترات من محلول ملحي خارجي إلى الغرفة. استخدام ملقط لنقل العقول إلى الغرفة وضبط مواقف من العقول تحت المجهر مع الجانبين الظهرية التي تواجه.
غطي الغرفة بزلة غلاف زجاجي واضغط بلطف على زلة الغطاء لتقليل الانجراف للعينة أثناء إجراء التصوير. لتحديد explants الدماغ التي تحتوي على الخلايا العصبية المسمى بشكل فردي، في غضون 30 دقيقة من تشريح حدد هدف غمر الماء 40X ومصدر ضوء epifluorescence. حدد ليزر فوتون ضبطها إلى 920 نانومتر وجهاز الكشف غير Dscan وتعيين المعلمات التصوير لجمع الصور في 512 في 512 بكسل لكل إطار ودقيقة واحدة لكل Z كومة لمدة 10 دقائق.
ثم، ضبط التكبير البصري والرقمي لتحقيق ما يكفي X، Y، Z القرار مع ضمان تغطية كامل arbor dendritic في غضون دقيقة واحدة. وسوف تولد الإعدادات الصور مع نموذجي X، ص، Z القرار من 0.11 في 0.11 في 0.25 ميكرومتر. لتصحيح الانجراف، افتح الملف الذي يهمك في برنامج تصحيح انجراف مناسب وانقر على تحرير وتحرير المعلمات المجهرية.
تعيين نوع المجهر إلى حقل واسع لصورتين الفوتون إذا كان هناك خيار فوتون اثنين واتبع سير العمل المعرفة من قبل البرنامج. لdethonvolution، فتح الصورة المصححة الانجراف في برنامج فك التشفير واتبع سير العمل. ثم احفظ الصورة deconvolved في نوع ملف معتمد من قبل برنامج التعليق التوضيحي الصورة اللاحقة قادرة على تحليل البيانات 4D والإبلاغ عن الإحداثيات المكانية من البقع المعرفة داخل الصورة.
للتعليق التوضيحي للصورة، افتح الصورة deconvolved في برنامج التعليق التوضيحي للصورة وتفحص وعلامة نصائح الفرع في جميع النقاط الزمنية في 3D. سيقوم برنامج التعليق التوضيحي للصورة بالإبلاغ عن الإحداثيات المكانية والزمانية لنصائح الفرع المميزة وتخزينها. تصدير معلومات الإحداثيات كملف CSV من أجل الحسابات اللاحقة.
في الوحدة النمطية البقع، انقر فوق تخطي إنشاء تلقائي، تحرير يدوياً، ثم تحقق من خانة الاختيار التوصيل التلقائي إلى بقعة محددة. راجع الإطارات في السلسلة الزمنية وحدد فرع للتعليق التوضيحي. اضغط على مفتاح Shift، انقر فوق طرف الطرف الطرفي الفرعي لإضافة بقعة.
ثم انقر فوق علامة التبويب إحصائيات، حدد مفصلة، وقيم محددة، والموضع. سيتم عرض معلومات الإحداثيات المكانية والزمانية المسجلة. انقر فوق حفظ لتصدير البيانات كملف CSV.
لحساب موضع طرف الفرع في 3D، افتح ملف CSV كجداول بيانات وحدد عمود "معرف المسار". انقر فوق فرز أصغر إلى أكبر وقبول توسيع التحديد. بعد الفرز، معرف المسار سوف تحدد كل فرع dendritic فريدة من نوعها والبقع من نفس الفرع حصة نفس المسار ID.The الوقت العمود سيتم تخزين المعلومات من أطر زمنية مختلفة.
في جدول البيانات، أضف عمود المسافة، واستخدم الإحداثيات لحساب المسافة لكل نقطتين متجاورتين زمنيًا. لقياس الحركات الطفيفة عند مستوى voxel واحد، قم بإعادة تعيين كل قيم المسافة التي تقل عن 0.3 ميكرومتر لتصفية أي تعليق توضيحي غير مصحح للصورة أو غير كامل. بعد ذلك، قم بإنشاء عمود إزاحة ثم نسخ القيم من عمود المسافة إلى العمود الإزاحة.
تعيين أحداث التمديد والسحب يدويًا لكل طرف فرع. إذا كان امتداداً، اترك قيمة النزوح الإيجابية دون تغيير. إذا كان التراجع، تغيير قيمة إزاحة المقابلة إلى قيمة سالبة.
ثم، في عمود حدث جديد، جمع قيم الإزاحة لأحداث التمديد والسحب الفردية. في هذا الفيديو، يمكن ملاحظة سلسلة صور متوقعة بالحد الأقصى للكثافة تم جمعها من خلية عصبية جانبية مُنَتَسمة بشكل فردي. تسمح صور الإطار الواحد بتقييم أحداث التراجع والامتداد.
يسمح التتبع رباعي الأبعاد شبه المميّس لمحطات الفروع بالشرح التوضيحي لمحطات الفروع الديناميكية للخلايا العصبية الجانبية البطنية المسماة بشكل فردي كما هو موضح. حساب اتجاه ومسافة حركات الفرع في كل نقطة زمنية يسمح مقارنة ديناميات فرع التشعب لالخلايا العصبية الجانبية البطيني المسمى بشكل فردي في مراحل مختلفة من النمو. الخطوة الأكثر أهمية هي الحفاظ على سلامة أنسجة المخ وdendrite مورفيلوري أثناء تشريح وتركيب.
جودة سلسلة الصور الخام هي أيضا حاسمة لنجاح التتبع وتحديد الكم. باستخدام هذه التقنية اكتسبنا القدرة على إجراء تحليل كمي للdendrite filopodia في تطوير الخلايا العصبية المركزية drosophila واستكشاف الآلات الجزيئية المتعلقة النضج dendrite وsasaptogenesis.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
النظرة العامة
تقدم هذه الدراسة طريقة لتصوير خيوط التغصن المتحركة بدرجة عالية في أدمغة يرقات Drosophila الحية. باستخدام تصوير زمني ثلاثي الأبعاد، يقوم البروتوكول بقياس ديناميكيات الفروع للأشجار التغصنية في الخلايا العصبية النامية، مما يوفر رؤى حول تكوين التغصن المنظم بالتطور والنشاط.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- علم الأحياء النمائي
- تقنيات التصوير
الخلفية
- تلعب خيوط التغصن دورًا حاسمًا في تكوّن المشابك وتطور الدوائر العصبية.
- فهم ديناميكيات التغصن ضروري للحصول على رؤى حول اللدونة العصبية والوظيفة.
- تقنيات التصوير الحي تتيح ملاحظة التغييرات العصبية في الوقت الحقيقي أثناء التطور.
- يمكن أن يوفر القياس الكمي الديناميكي للتغصن فهمًا أفضل للآليات التنظيمية.
غرض الدراسة
- لتطوير طريقة قوية لتتبع خيوط التغصن الحية في الجسم الحي.
- لتقييم ديناميكيات التفرع في الخلايا العصبية النامية.
- لتيسير الرؤى حول كيفية تأثير النشاط العصبي والتطور على مورفولوجيا التغصن.
الطرق المستخدمة
- تصوير زمني ليرقات Drosophila أحيائية.
- تم استخدام برنامج برمجي لشرح الصور ثلاثي الأبعاد لتتبع أطراف الفروع.
- تم تحسين بارامترات التصوير للحصول على دقة زمنية ومكانية خلال التشريح.
- شمل تحليل ما بعد التصوير تصحيح الانحراف، وإزالة التداخل، والشرح اليدوي لأطراف الفروع.
- اشتمل التحليل الكمي على حساب المسافات والحركات لأطراف الفروع التغصنية.
النتائج الرئيسية
- نجحت الطريقة في تتبع السلوكيات الديناميكية لخيوط التغصن في الخلايا العصبية النامية.
- تم تقييم أحداث تمدد وتراجع كل فرع تغصن كميًا.
- كانت جودة الصورة وسلامة الأنسجة حاسمة للتتبع الدقيق والقياس الكمي.
- يمكن لهذه الطريقة إجراء تحليلات مقارنة عبر مراحل تطور مختلفة.
الاستنتاجات
- توفر هذه الدراسة بروتوكولًا جديدًا للتحليل الكمي لديناميكيات خيوط التغصن.
- تعزز الطريقة فهم كيفية تنظيم التطور والنشاط العصبي لمورفولوجيا التغصن.
- يمكن أن تقدم الرؤى المكتسبة معلومات حول تكوين المشابك والاتصال العصبي.
الأسئلة المتداولة
Executive Industry Relevance
Quantifying dendritic branch dynamics enables mechanistic de-risking in neurodevelopmental target validation by linking structural plasticity to functional outcomes. This approach supports predictive confidence in early discovery by providing quantitative readouts of neurite morphogenesis relevant to synaptic formation pathways. The method’s applicability to sparsely labeled neurons in vitro and in vivo enhances translational continuity across model systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses related to neurite outgrowth and synaptic partner engagement through direct measurement of filopodial dynamics.
- Operational Value: Provides a standardized framework for assessing target engagement effects on dendritic complexity in phenotypic screening assays.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, spatially resolved data on branch tip movements that can serve as phenotypic readouts for compound-induced neurodevelopmental effects.
- Operational Value: Supports assay standardization through drift correction, deconvolution, and coordinate-based tracking, improving reproducibility across laboratories.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates disease-relevant system modeling by enabling comparison of dendritic dynamics across developmental stages or genetic perturbations linked to neurodevelopmental disorders.
- Operational Value: Produces translatable metrics (extension/retraction events, displacement) that bridge in vitro findings to in vivo validation.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by converting live imaging data into quantifiable dynamics that inform lead identification and preclinical risk assessment.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of targets regulating cytoskeletal remodeling and activity-dependent neurite stabilization.
- Screening: Enables assay readiness through standardized imaging protocols and post-processing pipelines that ensure data consistency.
- Analytics: Delivers quantitative outputs (distance, displacement, event summation) that allow objective comparison of dendritic behavior across experimental conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by providing measurable neurite dynamics that correlate with synaptic maturation and circuit formation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging and quantification platform applicable to diverse neuronal models and screening campaigns.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in neurodevelopmental target validation by linking molecular perturbations to dynamic structural phenotypes.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized drift correction, deconvolution, and manual annotation workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing objective, quantitative neurite morphology data early in the discovery pipeline.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on effects on dendritic complexity and synaptic readiness.
Implementation Considerations
- Requires expertise in live imaging, neuronal dissection, and 4D image annotation software for accurate terminal tracking.
- Depends on high-resolution microscopy systems capable of 3D time-lapse acquisition with sufficient temporal resolution to capture fast filopodial dynamics.
- Necessitates cross-team standardization of imaging parameters, drift correction protocols, and annotation criteria to ensure data comparability.
- Involves adaptation considerations when transferring the protocol to different neuronal types or model systems with varying arbor complexity.
- Dependent on preserving tissue integrity during dissection and mounting, as physical disruption directly impacts data quality and tracking accuracy.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:54
Larval Brain Explant Dissection and Mounting
2:04
Live Time-Lapse Imaging
3:02
Drift Correction and Deconvolution
3:54
Image Annotation
5:06
Dynamic Dendritic Branch Calculation
6:43
Results: Representative Dynamic Dendritic Branch Terminal Tracking
7:34
Conclusion
