عزل يمكن الاعتماد عليه من الاوعيه المجهرية للجهاز العصبي المركزي عبر خمس مجموعات فقاري

هذا البروتوكول مهم لأنه يسمح للمقارنة بين الأوعية الدقيقة بين مناطق الجهاز العصبي المركزي المختلفة ، وكذلك بين الأفراد المختلفين. يمكن إكمال تقنية العزلة الدقيقة هذه في غضون يوم واحد ، وتلغي الحاجة إلى الطرد الشديد والتفكك الأنزيمي. إزالة السحايا والزفير المشيمية يمكن أن يكون صعبا.

تأكد من العمل ببطء وبعناية لضمان الإزالة الكاملة لكل نسيج. لتشريح أنسجة الجهاز العصبي المركزي من عينة فقرية صغيرة لزهية الدماغ، ضع الدماغ المحاصَد في أنبوب مخروطي 15 ملليلتر يحتوي على محلول MV-1 على الجليد، واستخدم ملقطًا لاسترداد الغدة النخامية من تورسيكا سيلا للجمجمة. وضع الغدة النخامية في أنبوب microcentuge 1.7 ملليلتر من MV-1 حل على الجليد، وإزالة الجلد والعضلات لفضح العمود الفقري.

بعد إزالة الأطراف والقفص الصدري والأعضاء الداخلية، استخدم حقنة 10 ملليلتر مجهزة بإبرة قياس 18 لطرد العمود الفقري بمحلول MV-1 الطازج، في اتجاه من الdal إلى الروستال في جميع أنحاء الفقاري القطني. ثم ضع الحبل الشوكي في أنبوب 5 ملليلتر يحتوي على محلول MV-1 جديد. بعد ذلك ، ضع الدماغ في طبق بيتري تحت المجهر التشريحي ، وإزالة السحايا مع وخز مزدوج المحاور.

تأكد من فحص الحبل الشوكي للتأكد من عدم وجود قطع من السحانيات. استخدام ملقط لفصل تحت المهاد، المخيخ، جذع الدماغ، والقشرة. عند الضرورة، استخدم ملقط والقزحية ومقص الربيع لإخراج المصابيح الشمية والمهاد، واستخدام وخز مزدوجة الشق لإزالة كل من plexus المشيمية من جميع البطينات الدماغ.

لتشريح أنسجة الجهاز العصبي المركزي من عينة كبيرة من الفقاريات الفيرفلورية، استخدم مجهر تشريح ووخز مزدوج المحاور، ملقط، ومقص قزحية العين والربيع لإزالة السحايا من كل أنسجة الجهاز العصبي المركزي، مع الحرص على إزالة أي قطعة من الضفيرة المشيمية من البطينين الدماغ. من أجل تجانس أنسجة الجهاز العصبي المركزي المحصودة، يُرمّم كل منطقة من مناطق الجهاز العصبي المركزي إلى قطعة من ملليمتر إلى قطعتين داخل أطباق بيتري الفردية. لتجانس أنسجة الجهاز العصبي المركزي من عينات الفقاريات الصغيرة، استخدم ماصة نقل لإضافة ملليلتر واحد من محلول MV-1 لتعليق الأنسجة المفرومة.

ثم استخدام ماصة نقل نفسه للاستغناء عن القشرة، المخيخ، جذع الدماغ، الفص البصري، وقطع الحبل الشوكي في الفردية 10 ملليلتر طاحونة الأنسجة الزجاجية، واستخدام آفة PTFE وخمس ملليلترات من حل MV-1 لطحن كل مجموعة من الأنسجة لحوالي 10 السكتات الدماغية. نقل كل ملاط الأنسجة في أنابيب مخروطية 15 ملليلتر الفردية على الجليد، واستخدام ملقط لوضع تحت المهاد والنخامية في 100 ميكرولترات من حل MV-1، في أنابيب 1.7 ملليلتر الفردية. ثم، تجانس بعناية كل الأنسجة مع ميكروبستل الزجاج.

لتجانس عينة كبيرة من الفقاريات، استخدم ماصة نقل مقطعة مشطة لنقل الأنسجة المفرومة إلى طاحونة نسيج زجاجي 55 ملليلتر، واربط المطحنة بمحرك علوي. إضافة نصف حجم الموصى بها من حل MV-1 وفقا للجزء CNS محددة يجري التجانس كما هو مبين في الجدول، وتشغيل مُنَقّر علوي إلى 150 دوران تقريباً في الدقيقة. قم بتحريك الأنبوب الزجاجي لأعلى ولون لحوالي 30 ثانية قبل إيقاف مُثير الحمل لإضافة المزيد من حل MV-1 لتحقيق تجانس إضافي، حتى يتم الحصول على ملاط متجانس.

ثم نقل الأنسجة المتجانسة إلى أنبوب مخروطي 50 ملليلتر على الجليد. لتنقية microvessel، بيليه أنسجة الجهاز العصبي المركزي يتجانس عن طريق الطرد المركزي، والتخلص من supernatants. لعزلة العينة الفقارية الصغيرة، ماصة القشرة، المخيخ، جذع الدماغ، الفص البصري والكريات الحبل الشوكي، في خمسة ملليلتر من الطازجة، الجليد الباردة MV-2 حل لكل عينة، حوالي 10 مرات، قبل إضافة خمسة ملليلتر أكثر من الجليد الباردة MV-2 حل لكل أنبوب.

الوجه بعناية الأنابيب لخلط، وإعادة تعليق تحت المهاد والكريات الغدة النخامية في ملليلتر واحد من حل MV-2. بالنسبة لعزلة العينة الفقارية الكبيرة، أضف 20 ملليلترًا من محلول MV-2 البارد من الجليد إلى القشرة والمخيخ وسيقان الدماغ والكريات الدقيقة للحبل الشوكي، وإعادة تعليق الكريات في مسدس أنبوبي عند 40 دوران في الدقيقة لمدة 5 دقائق. في نهاية إعادة التعليق، وفصل أنسجة الجهاز العصبي المركزي lycates عن طريق الطرد المركزي، وتدوير ببطء كل أنبوب للسماح للمابير لتمرير على طول الجدار لفصل بعناية طبقة الميلين سميكة وكثيفة على واجهة السائل من جدران أنبوب.

تجاهل واجهات الميلين والسائلة، وصمة عار الجدار الداخلي لكل أنبوب مع ملعقة ملفوفة مع مسح الورق منخفضة الوبر. ثم، استخدم مسح الورق المنخفض الوبر الملتوية لامتصاص السائل الزائد، واستخدام نصائح منخفضة الربط لإعادة تعليق كل بيليه في ملليلتر واحد من حل MV-3. لmiution microvessel والترشيح، مزيج بضعة ملليلترات من حل MV-3 الطازجة لكل الطين أنسجة الجهاز العصبي المركزي، وبينما خلط لتجنب المجاميع، سلالة كل تعليق من خلال مصفاة برويت في أنابيب مخروطية 50 ملليلتر الفردية.

مكان واحد 20 ميكرومتر النايلون صافي مرشح على واحد حامل مرشح معدلة في منطقة CNS. نقل حامل مرشح على أنبوب مخروطي 50 ملليلتر، والرطب مرشح مع خمسة ملليلتر من الجليد الباردة MV-3 حل، والتأكد من أن المخزن المؤقت يصب أسفل حامل مرشح، في أنبوب مخروطي. نقل microvessels مائل على كل 20 ميكرومتر مرشح النايلون صافي، وشطف microvessels مع خمسة إلى 10 ملليلتر من الجليد الباردة MV-3 الحل.

استخدم ملقط لنقل كل مرشح إلى القارص الفردية التي تحتوي على حل MV-3 البارد من الثلج ، وتهز كل مرشح بلطف لمدة 30 ثانية لفصل الميكروسيل. بعد نقل إلى أنبوب مخروطي 15 ملليلتر، وجمع microvessels عن طريق الطرد المركزي، واستخدام ماصة منخفضة ملزمة لإعادة تعليق كل بيليه في ملليلتر واحد من الجليد الباردة MV-3 الحل. ثم، نقل التعليقات microvessel من عينات الفقاريات الصغيرة في أنبوب microcentuge 1.7 ملليلتر للطرد المركزي لمدة خمس دقائق في 20،000 مرات G، في أربع درجات مئوية.

بالنسبة للعينات الفقارية الكبيرة، قم بنقل التعليق إلى أنابيب فردية من خمسة ملليلتر للطرد المركزي، وإضافة أربعة ملليلترات من محلول MV-3 للطرد المركزي لمدة خمس دقائق عند 2000 مرة G في أربع درجات مئوية. يمكن الكشف عن المكونات الجوهرية للوحدة العصبية الوعائية داخل microvessels ، معزولة كما هو موضح ، عن طريق الحقن المناعي لـ CD31 ، PDGFR-beta ، و aquaporin أربعة ، بما في ذلك القشرية ، cerebellar ، الغدة النخامية ، hypothalamic ، جذع الدماغ ، وmicrovess الشوكي. وبالمثل، فإن التعبير عن البروتين الملتزم-تقاطع VE-cadherin، والبروتينات تقاطع ضيق CLDN5 وZonula Occludens-1، ثلاثي الخلايا وصلة البروتين أنغولين-1، والعلامة القاعدية chemokine ligand CXCL motif 12، وغاما-غلوتاميل ترانسفيرايز-1، يمكن تصورها.

وعلاوة على ذلك، فإن غالبية microvessels تخلو من التعبير عن الفعل العضلات الملساء ألفا، مما يدل على أن هذا البروتوكول العزل يستهدف انتقائي microvessels من العيار الصغير. Microvessels التي تم الحصول عليها من غيرها من الفقاريات قلط الدماغ الصغيرة ، مثل الطيور ، الكذاب ، الضفدع ، والأسماك ، وتقاسم بعض الميزات المورفولوجية ، مما يشير إلى أن هذه الطريقة مفيدة لمزيد من توصيف الاختلافات في وحدات الأعصاب بين الأنواع. ويكشف القياس الكمي للتغيرات في تعبير البروتين عن زيادة في جزيء التصاق الخلايا الوعائية واحد، وجزيء التصاق تقاطعي B على طول ميكروفيسيل الحبل الشوكي، خلال ذروة التهاب الدماغ المناعي الذاتي التجريبي.

ومع ذلك ، فإن جزيء التصاق الخلايا الوعائية واحد هو أيضا زيادة كبيرة في microvessels الغدة النخامية ، وانخفاض في تحت المهاد وmicrovessels الدماغ. بالإضافة إلى ذلك ، لوحظت تغيرات في جزيء التصاق الخلايا الوعائية تعبير واحد خلال التهاب الدماغ المناعي الذاتي التجريبي المزمن في جميع أنسجة CNS ، وفي جزيء التصاق تقاطعي B التعبير في تحت المهاد والصغر النخامي. ويمكن إجراء التحليلات الكمية، مثل البقعة الغربية، والـ PCR والكيمياء المناعية، بعد هذا الإجراء للكشف عن رؤى في أنماط التعبير الجيني والبروتيني داخل حاجز الدم في الدماغ.

Paraformaldehyde هو كاشف شديد السمية، وينبغي دائما أن تعالج تحت غطاء محرك الدخان في حين يرتدي معدات الوقاية الشخصية المناسبة.