التصوير من ATP داخل الخلايا في شرائح الانسجه العضوية من الدماغ الماوس باستخدام الاستشعار القائم علي التاكل ATeam 1.03^يمك

نحن وصف بروتوكول للتعبير عن نوع الخلية محدده من المستشعر القائم علي التاكل المرمزة وراثيا ATeam 1.03^يمك في الثقافات شريحة النمط العضوي من الدماغ الامامي الماوس. علاوة علي ذلك ، نعرض كيفيه استخدام هذا المستشعر للتصوير الديناميكي لمستويات ATP الخلوية في الخلايا العصبية و astrocytes.

هنا نُظهر كيفية استخدام مستشعر الـ ATP الحساس من طراز FRET ATeam 1.03 YEMK لقياسات ديناميكية للتغيرات في مستويات ATP العصبية والأسترالية في شرائح فرس النهر المزرعة عضوياً. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن المرء يمكن دراسة استقلاب الطاقة في أنسجة الدماغ الحية في بيئة تسيطر عليها، بيئة ذات مستويات عالية من التعبير الاستشعار. هذه التقنية قد تساعد في الحصول على رؤى في الميكانيكا pathomeisms، والأمراض الكامنة، أو تلف الدماغ، على سبيل المثال، الناجمة عن الحرمان من الطاقة، مثل السكتة الدماغية.

يمكن، من حيث المبدأ، أن تستخدم لدراسة مستويات ATP، ليس فقط في أنسجة الدماغ، ولكن في الأجهزة الأخرى كذلك. لتشغيل هذه التجربة بنجاح، فمن الضروري لتنفيذ جميع الخطوات التي تنطوي على زراعة الأنسجة حذرا للغاية والحفاظ على العقم. وعلاوة على ذلك، هناك حاجة إلى بعض المعرفة التصوير الفلورسنت الخلوي.

معالجة الأنسجة في نهج الأكثر تطورا وتصور أمر حيوي لفهم الإجراءات المناسبة. وينطبق الشيء نفسه على تجارب التصوير. ومن خلال هذا الإجراء، سيكون رودريغو ليرشوندي، وهو من الـ"ما بعد الأدُك"، و"نا هوانغ"، وهو طالب ماجستير من المختبر.

في طبق بيتري بارد من الجليد مليء بـ ACSF ، ضع الدماغ على غشاء تصفية. فصل نصفي الكرة الأرضية وأداء قطع باراسيتتال بزاوية 45 درجة. إصلاح نصف الكرة الأرضية واحد في مرحلة النسيج هزاز مع superglue، ونقل على الفور كتلة الأنسجة إلى حمام هزاز يحتوي على الجليد الباردة ACSF فقاعة مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون و 95٪ الأكسجين.

محاذاة الأنسجة في حمام هزاز. الحفاظ على نصف الكرة الثاني في ACSF الجليد البارد حتى تقطيع. ضبط هزاز لقطع شرائح في 250 إلى 400 ميكرومتر.

بعد قطع الشريحة، حدد تكوين قرن آمون استنادًا إلى مظهره المورفولوجي النموذجي وعزله باستخدام الإبر تحت الجلد، مع الحفاظ على جزء قشرة الدماغ المجاورة لقنا الحصين. ضع الشريحة على شبكة في ACSF ، وتدفأ إلى 34 درجة مئوية وفقاعات مع 5٪ من ثاني أكسيد الكربون و 95٪ من الأكسجين حتى يتم جمع جميع الشرائح. نقل شرائح إلى مجلس الوزراء تدفق لارينار على الاستمرار في ظل ظروف معقمة.

مع ماصة باستور المقلوبة والمعقمة والزجاجية، قم بنقل الشرائح بلطف من ACSF إلى أحد أطباق بيتري الدافئة مسبقًا المليئة بمحلول Hanks'salt العقيم. تغيير الماصات ونقل شرائح إلى طبق الثقافة الثانية. كرر العملية خمس مرات بشكل عام.

نقل أقل HBSS ممكن إلى لوحات الثقافة التالية. باستخدام ماصة، ضع شريحة واحدة بلطف في كل مرة على الجزء العلوي من إدراج الثقافة. تجنب الاضطرابات في الماصات، وانتظر حتى تنزل الشريحة إلى طرف ماصة باستور.

كرر العملية لكل شريحة. ضع شريحتين على غشاء. قم بإزالة أي حل هانك الزائد من أعلى الإدراج باستخدام تلميح دقيق.

الحفاظ على الثقافات في حاضنة مرطبة في 5٪ ثاني أكسيد الكربون و 37 درجة مئوية حتى يوم التجربة. استبدال الوسط كل يومين إلى ثلاثة أيام. دون لمس الأنسجة، وتطبيق 0.5 ميكرولترات من ناقلات المخفف مباشرة إلى الجزء العلوي من كل شريحة.

وأخيرا، ضع شرائح مرة أخرى في الحاضنة والحفاظ عليها هناك لمدة ستة أيام أخرى على الأقل. قبل بدء التجربة، قم بنقل إدراج يحتوي على شرائح مثقفة في غطاء محرك السيارة العقيم، وضعه في طبق 30 ملليمتر يحتوي على ملليلتر واحد من متوسطة ثقافة شريحة الأعضاء، أو الحد الأدنى من الوسط الأساسي. ضع الطبق تحت المنظار المجسم وركز على سطح الشريحة.

استخدام اثنين من الإبر تحت الجلد العقيمة لجعل قصيرة عبر قطع الحق على حواف ضيقة من شريحة مختارة، وفي الطبقة العليا دون إتلاف الأنسجة تحتها. لإزالة شريحة المعدة من إدراج، عقد حواف الغشاء مع ملاقط واستخدام مشرط عقيمة لجعل مستقيم، والتخفيضات المتوازية إلى الغشاء، وتشكيل مربع أو مثلث مع شريحة في المركز. إذا كان إدراج تستضيف شرائح إضافية، ونقلها مرة أخرى إلى لوحة الأصلي وإلى الحاضنة.

سوف يمنع التوتر السطحي للوسيلة تسربه على سطح الغشاء. إعداد ACSF التجريبية والحصول على حى الهيدروجيني من 7.4 عن طريق محتدما مع 95٪ من الأوكسجين و 5٪ ثاني أكسيد الكربون من خلال أنابيب إدراجها متصلة إمدادات كاربوجين لمدة ثلاثين دقيقة على الأقل. الحفاظ على فقاعة المالحة خلال التجربة بأكملها.

ثم قم بالتبديل على مصدر الضوء الفلورسنت لمقياس أحادي اللون. نقل ثقافة شريحة الأعضاء إلى غرفة التجريبية. وضع شبكة على رأس ثقافة شريحة organotypic مع الإطار إلى أسفل، وليس لمس الثقافة، والمواضيع حتى، لمس الغشاء.

ضع الغرفة على مرحلة المجهر وتوصيلها بنظام الضخ. قم بتشغيل المضخة الم Peristaltic بمعدل تدفق 1.5 إلى 2.5 ملليلتر في الدقيقة. تأكد من عدم تسرب نظام التسريب.

وباستخدام ضوء الإرسال، قم بتركيز الشريحة المستزرعة وحدد المجال الذي يجب أن تجري فيه التجارب. قبل بدء تجارب التصوير، انتظر 15 دقيقة على الأقل للسماح للشرائح بالتكيف مع الظروف المالحة، ثم قم بتشغيل الكاميرا وبرنامج التصوير. تثير البروتين الفلورسنت المانح في 435 نانومتر.

تعيين وقت التعرض إلى ما بين 40 إلى 90 ميلي ثانية. ثم أدخل المرآة الديكروية والمرشحات في وحدة تقسيم شعاع. تقسيم الانبعاثات fluorescence في 500 نانومتر مع تقسيم صورة الانبعاثات، وتوظيف مرشحات تمرير الفرقة في 482 زائد أو ناقص 16 و 542 زائد أو ناقص 13.5 نانومتر لمزيد من عزل المانحة ومقبول fluorescence.

حدد منطقة من الاهتمام على ما يبدو خالية من الفلورس الخلوية لطرح الخلفية. دائرة هياكل واحدة من الأنسجة المسمى في الصورة على الشاشة لإنشاء ROIs. تعيين تردد الحصول على الصورة ووقت التسجيل العام.

بالنسبة للتجارب التي تزيد عن 30 دقيقة، يوصى بتردد شراء من 0.2 إلى 0.5 هيرتز لمنع السمية الضوئية. بعد ذلك، بدء التسجيل. لإحداث تغييرات في ATP داخل الخلايا، قم بتبديل أنبوب الضخ من ACSF القياسي إلى محلول ملحي يحتوي على مثبطات الأيض، على سبيل المثال، محلول نقص التروية الكيميائي.

بدلا من ذلك، استخدم ملحا مع تركيز البوتاسيوم مرتفعة في ثمانية ملليمتر لتقليد الإفراج عن أيون البوتاسيوم من الخلايا العصبية النشطة. مباشرة بعد التسجيلات، وتبادل ACSF التجريبية مع ACSF أكوام المخزنة. ثم نقل غرفة التسجيل التي تحتوي على ثقافة شريحة إلى مجهر المسح الضوئي بالليزر confocal.

التقاط صور مكدس Z في أعلى دقة Z ممكن في التكوين البصرية معين. في هذا البروتوكول، بعد عشرة أيام من عملية النقل، تم العثور على الخلايا العصبية التي تعبر عن ATeam 1.03 YEMK بكثافة عالية في القشرة الجديدة لشرائح الأنسجة المستزرعة في أعماق تصل إلى 50 ميكرومتر تحت سطح الشريحة. وقد تحققت نتائج مماثلة في قرن آمون.

بالنسبة للستروبوتات الهوائية، تم التعبير عن ATeam 1.03 YEMK تحت سيطرة مروج البروتين الحمضي الليفي الليفي البشري، وشرائح organotypic التي تعبر عن ATeam 1.03 YEMK في الخلايا العصبية قرن آموس المختارة ROIs تمثل سوماتا من الخلايا الهرمية. بعد تعريض الشريحة إلى 5 ملليمولار الصوديوم أزيد في غياب الجلوكوز خارج الخلية لمدة دقيقة واحدة، تم إحداث تغييرات معاكسة في كثافة الانبعاثات من الزوج فريت. ولوحظ أيضا انخفاض قابل للعكس في نسبة الـ ATeam FRET.

على المدى الطويل ATeam فريت نسبة في 14 خلايا مختلفة في ظل ظروف خط الأساس في الخلايا العصبية وstrocytes تبين أن ATeam هو جهاز استشعار موثوق ومستقر. يرجى ملاحظة أن نقص التروية الكيميائية أدى إلى الانخفاض القوي المتوقع في نسبة ATeam في كلا النوعين من الخلايا في نهاية هذه التجربة. لم ينتج عن زيادة في تركيز البوتاسيوم خارج الخلية من ثلاثة إلى ثمانية ملليمترات لمدة ثلاث دقائق في تغيير يمكن اكتشافه في الخلايا العصبية التي تعبر عن ATeam 1.03 YEMK.

في المقابل، تفاعلت الخلايا الفلكية مع الزيادة في البوتاسيوم خارج الخلية من خلال زيادة قابلة للعكس في نسبة ATeam FRET، مما يشير إلى زيادة في مستويات ATP داخل الخلايا. مرة أخرى، تسبب نقص التروية الكيميائية انخفاض فوري في نسبة ATeam، مما يدل على أن أجهزة الاستشعار يمكن الكشف عن التغيرات في ATP. عند محاولة التصوير الخلوي القائم على FRET كما هو موضح هنا ، من المهم أن نضع في اعتبارنا أن إنتاج شرائح عالية الجودة في الثقافات العضوية هي خطوة رئيسية.

وعلاوة على ذلك، مطلوب إزالة دقيقة من ندبة الدبقية والتصوير على مستوى الخبراء. بعد هذا الإجراء، ينبغي للمرء أيضا أن تكون قادرة على تنفيذ تجربة دمج مختلف nanosensor المستندة إلى فريت لالاستقلابات الخلوية. على سبيل المثال، تلك الجلوكوز أو اللاكتات.

وأخيرا وليس آخرا، ينبغي التأكيد على وجوب مراعاة ما يتصل بذلك من أفعال لحماية الحيوانات. وهذا ينطبق أيضا على القوانين الفعالة التي تحكم التعامل مع الكائنات المحورة وراثيا.