Abbiategrasso بروتوكول بنك الدماغ لجمع ومعالجة وتتميز الأدمغة الشيخوخة
June 3rd, 2020
يصف هذا البروتوكول طريقة لتتبع مسارات شيخوخة الدماغ الفردية من خلال برنامج التبرع بالدماغ والتوصيف السليم للأدمغة. ويشارك المتبرعون الدماغ في دراسة طولية طويلة الأجل بما في ذلك التقييمات المتسلسلة متعددة الأبعاد. ويتضمن البروتوكول وصفا مفصلا لمعالجة الدماغ ومنهجية تشخيصية دقيقة.
مع تزايد انتشار الاضطرابات العصبية المعرفية باستمرار، فإن هدفنا هو الحصول على عينات من أنسجة الدماغ عالية الجودة وتوصيفها وتخزينها لتحقيق تشخيص دقيق وإلقاء الضوء على الآليات العصبية. وبالنظر إلى قياس الدماغ، تسمح منهجية أخذ العينات لدينا بأن يتم تنفيذ جميع الدراسات الوصفية على الأنسجة المحددة بشكل جيد من الناحية النسيجية من كلا نصفي الكرة الأرضية ويمكن جمع العديد من البيانات وربطها من خلال التعلم العميق. وكثيرا ما لوحظت آثار إضافية على تلف الدماغ من قبل أمراض متعددة.
يتطلب التشخيص المحدد الجمع بين متلازمة سريرية مع النتائج العصبية لاكتشاف الأمراض المسببة للأمراض، والعلاجات الممكنة. إجراءات القطع جديدة، فضلا عن إدارة قسم الماكرو صعبة ولكنها ضرورية أيضا لتحقيق نتائج جيدة. ومن الأهمية بمكان وجود فريق مدرب ومتماسك للتغلب على هذه الصعوبات.
بروتوكولنا يتضمن سلسلة من الخطوات التي هي البراعة الثدييات المطلوبة ، وبالتالي يمكن أن يكون العرض البصري أكثر فائدة من النصوص الوصفية للباحث الذي يرغب في إتقان هذه التقنيات. بعد التأكد من التصوير المقطعي، استخدم مشرطًا حادًا لإجراء شق فروة رأس من خلال بشرة الشعر والأنسجة تحت الجلد على لوحة الإكلين من طرف العملية الشعاعية على جانب إلى آخر، وتمر فوق الرأس. فصل طيتين من فروة الرأس بعناية من الجمجمة ومواصلة شق حتى يصبح الدهون المدارية الفائقة الصفراء مرئية.
تعكس فروة الرأس في وقت ما بعد وسحب الجزء الآخر من الأنسجة في وقت ما. باستخدام مشرط ملقط، حصاد عينة صغيرة من العضلات الصدغية في كل جانب من الجمجمة، ووضع عينة واحدة في الفورمالديهايد 4٪، والعينة الأخرى في أربع درجات مئوية. باستخدام منشار كهربائي قطع الجمجمة في قطع V على الجانب الأمامي وإزالة الجمجمة.
بعد قطع السحايات، حصاد قطعة واحدة من دورا لتثبيت وآخر لتجميد. إدراج 20 قياس 3.5 إبرة بوصة تعلق على حقنة 10 ملليلتر من خلال الكولسوم الجسم للوصول إلى البطين الثالث والتراجع عن المكبس للحصول على حوالي 10 ملليلتر من السائل الشوكي الدماغي. تقييم لون المظهر والتعكر من السوائل وقياس عدد مرات الـ PH.
سحب بلطف على كل من الفصوص الأمامية لرفع الدماغ وقطع كل من الأعصاب البصرية infundibulum, الشرايين السباتية الداخلية والأعصاب القحفية الثالثة والرابعة والخامسة والسادسة. قطع tentorium للوصول إلى fossa الخلفي وقطع الشرايين الفقرية والأعصاب القحفية السفلى. ثم أدخل المشرط في عمق ممكن من خلال ماغنوم الشطة لقطع الجزء الأكثرcaudal من medula وإزالة بعناية الدماغ كله.
استخدام مشرط لتظهر حتى العظم على كهف ميككل وجمع ganglion Gasserian من كل جانب لتثبيت وتجميد. استخدام مطرقة الجراحية وإزميل لكسر turcica sella العظمية وإزالة الغدة النخامية لتثبيت في 4٪ الفورمالديهايد. فحص الجمجمة والدماغ كله من التغيرات العيانية والتغيرات في الأوعية الدموية.
استخدم شريط قياس لقياس أقطار الوضعية العرضية والواقبية للدماغ ووزن الدماغ على مقياس. استرداد بعناية دائرة ويليس للتقييم العياني لوجود المتغيرات التشريحية، والآفات، أو تضيق الأوعية. فصل وفحص المخ، المخيخ، وعقل الأدمغة قبل وزن الأنسجة بشكل فردي.
إزالة واحد إلى اثنين، قطعت مربعة سنتيمترين إلى أربعة من leptomeninges من محدب والحفاظ على العينات في كامل عالية الجلوكوز DMEM ثقافة المتوسطة في أربع درجات مئوية. حصاد الغدة الصنوبرية لتثبيت في 4٪ الفورمالديهايد وإزالة المصابيح الشمية والأعصاب البصرية لتثبيت وتجميد واحد من كل زوج. ضع المخ المخي المخيخ، و الدماغ على الجليد عند أربع درجات مئوية.
عندما تم حصاد جميع الأنسجة ذات الاهتمام استخدام الغراء لاصق السوبر لإعادة ربط العظام واستخدام إبرة جراحية، والغرز غير قابلة للامتصاص لخياطة الظهر فروة الرأس. لتشريح بنك الدماغ استخدام سكين تشريح لقطع جذع الدماغ axially وجعل أول قطع على مستوى منتصف الربعي من خلال الكوليكولو متفوقة للحصول على شريحتين لفضح شبه الحادة. قطع جذع الدماغ إلى 10، شرائح ثمانية ملليمتر مع الحرص على تضمين التخفيضات التي تمر عبر البونسترالي بالقرب من الهوامش العليا للبطين الرابع لمراقبة caeruleus locus ومن خلال oblongata medulla أدنى من ستريا الصوتية، فقط فوق قمة أدنى من البطين الرابع للحصول على شرائح بما في ذلك نواة المحرك الظهري من المبهم.
تسمية جميع الشرائح بطريقة السد المجسمة على أنها BS لتمتة الدماغ متبوعة بالأرقام العربية. بعد المقطع الأخير من جذع الدماغ، استخدم التسمية SC للحبل الشوكي متبوعة بالأرقام العربية. قطع المخيخ على متن الطائرة القوس لفصل نصفي الدماغين cerebellar على مستوى vermis وتنفيذ تقسيم القوس للحصول على خمس شرائح من كل نصف الكرة الأرضية.
قم بتسمية جميع الشرائح من الفيرميس كـ CBR أو CBL لخيخ الرحم الأيمن والأيسر على التوالي، واستخدم الأرقام العربية لتحديد كل قسم. المقبل، وفصل نصفي الدماغين من المخ من خلال الكالوسوم corpus على متن الطائرة القوس قبل تقطيع نصف الكرة الأرضية على طول الطائرة التاجية بشكل فريد يمر بين شياسم البصرية والهيئات mammillary من خلال القطب الفص الصدغي الجبهي، cingulate الأمامي، commissure الأمامي، نواة من الصغرى، والقانغلية القاعدية. جعل قطع الثانية حوالي سنتيمتر واحد يمر في وقت ما بعد عن طريق الهيئات الثدي وفضح ganglia القاعدية، المهادات الأمامية تحت المهاد، وamgdala.
مواصلة تشريح تشريح المناطق الأمامية والخلفية حتى تم الحصول على شرائح 15-21 سم لكل نصف الكرة الأرضية. ضع الشريحة على سطح مستوٍ كما يتم تحقيقه بعد وضعها الأصلي في الاتجاه الأمامي الأمامي من القطب الأمامي إلى القطب القذالي ، مع استمرار الجزء مع الشرائح السابقة التي تواجه صعودًا. عندما تم وضع جميع الشرائح حدد المقاطع الرئيسية التي سيتم إصلاحها للالسينتولوجيا بما في ذلك الأجزاء المكتسبة سابقا والأقسام قرن آمون، الجدارية والأقرف، وتسمية الشرائح كما L أو R تليها الأرقام العربية بما في ذلك تسمية تشير إلى ما إذا كان سيتم إصلاح الشريحة أو تجميدها.
عندما تم تقسيم جميع الأنسجة وتسميتها ، احصل على صورة لكل سلسلة من المقاطع قبل تثبيتها أو تجميدها. لتجميد العينات وضع أقسام الأنسجة البديلة محفوظة على علبة الألومنيوم المجمدة قبل وتغطية المقاطع مع لوحة الألومنيوم المتشابكة للحفاظ عليها شقة. ثم تجميد الشرائح في النيتروجين السائل لمدة ثلاث دقائق قبل وضع العينات المجمدة داخل كيس من البلاستيك المسمى مع رموز تحديد الهوية المقابلة وأرقام شريحة لتخزين في مربع التبريد المناسبة في 80 درجة مئوية.
لإصلاح العينات وضع أقسام الأنسجة البديلة محفوظة في قطع فردية من الشاش ووضع شرائح في 10٪ الفوسفات buffered حل formalin لمدة خمسة أيام في غرفة باردة أربع درجات مئوية. تلقى 24 من أصل 27 أدمغة تم حصادها التوصيف العصبي الكامل مع تشخيص مرضي سريري محدد. يشير التحليل الأولي للدماغ الكهربي الكمي لسلسلة من 36 متبرعًا بالدماغ إلى أن نسبة إيقاع ألفا الرئيسية أقل بكثير في الاضطرابات العصبية المعرفية الرئيسية مقارنة بالاضطرابات العصبية المعرفية المعتدلة العادية لكبار السن.
هنا يظهر مثال على علم الأمراض غير المتماثلة مع ضمور الجانب الأيمن واضح بشكل مجهري مع تمدد البطين الشديد الملاحظ في القسم التاجي الأيمن مقارنة باليسرى. حالة أخرى يعرض اهان من نصف الكرة الأيمن، في حين يظهر عينة أخرى ضمور واضح من الجسم الماميلي الأيمن. يمكن أن تكون ملطّخة أقسام الماكرو لتحديد فقدان الميلين أو توزيع مناعية داخل نصفي الكرة الأرضية.
هذه العينات هي من التوائم الذين لديهم بداية سريرية لمرض الزهايمر في أطر زمنية مختلفة بسبب العوامل اللاجينية والبيئية. ومع ذلك ، كشف التحليل المجهري صورة مشابهة جدا الأمراض العصبية تشير إلى ارتفاع أمراض مرض الزهايمر واعتلال الأوعية الدموية الأميلويد. في هذين المرضى ومع ذلك ، فإن نفس التشخيص السريري لمرض الزهايمر لا يتوافق تماما مع السمات العصبية ، والتي كشفت عن ثنائي الخرف في تعدد الإتثاءات.
في الواقع ، قدمت القضية الأولى جثث ليوي في كذبة واحدة الجيروسكوبية والنيجرا substantia. والحالة الثانية أظهرت جثث ليوي المرتبطة بنويرات ليوي في اللوزة وفي نواة القاصرين. صورة من الشرائح بعناية لتحديد دقيق للمناطق التشريحية أثناء التحليل المجهري.
التثبيت وتجميد شرائح الفردي هي أيضا مهمة للحفاظ على بنية الأنسجة المجهرية Omics تضاريس تنشيط الجينات وتوزيع البروتين وربط هذه البيانات مع علم الأنسجة. الثقافات الخلية من الأنسجة ذات ميز جيد، وأيضا التحقيق في مرض pathogenesis. دائما ارتداء معدات وقائية شخصية كافية كما يعتبر أنسجة الدماغ المكتسبة المعدية المحتملة ولأن استخدام أدوات خطرة مثل الأدوات الحادة والنيتروجين السائل مطلوب.
نظرة عامة
يحدد هذا البروتوكول طريقة لتتبع مسارات الشيخوخة الفردية للدماغ من خلال برنامج للتبرع بالدماغ، مع التركيز على التوصيف الصحيح لأنسجة الدماغ. يصف المنهجية الشاملة للمعالجة والتشخيص للحصول على عينات عالية الجودة من أنسجة الدماغ.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- الآليات التنكسية العصبية
- شيخوخة الدماغ
الخلفية
- تتزايد انتشار الاضطرابات العصبية المعرفية، مما يستلزم وجود أنسجة دماغية عالية الجودة لتشخيص دقيق.
- تستخدم الدراسات الطولية تقييمات متعددة الأبعاد لفهم شامل.
- تدمج منهجية أخذ العينات اعتبارات عدم تناسق الدماغ لدراسات التحليل الشاملة الفعالة.
- من الضروري وجود فريق مدرب للتغلب على عمليات تشريح الدماغ المعقدة.
غرض الدراسة
- لتوصيف وتخزين أنسجة الدماغ لتشخيص الأمراض التنكسية العصبية.
- لاستكشاف مسببات الأمراض وإمكانية العلاجات من خلال تحليل شامل.
- لتأسيس منهجية قوية لحصاد أنسجة الدماغ والحفاظ عليها.
الطرق المستخدمة
- يتضمن البروتوكول تقنيات معالجة الدماغ وحفظه بالتفصيل.
- يشمل تشريحًا دقيقًا لمناطف مختلفة في الدماغ وجمع السائل الدماغي النخاعي.
- تشدد المنهجية على استخدام فريق مدرب لدقة المطلوبة في مهام معالجة الدماغ.
- يتم اقتراح العروض المرئية لتعزيز إتقان التقنية بين الباحثين.
النتائج الرئيسية
- تسمح المنهجية المفصلة بحصاد عينات الدماغ بشكل متسق وعالي الجودة عبر أمراض مختلفة.
- يسهل البروتوكول فهمًا أفضل للتغيرات التشريحية والمرضية في الدماغ.
- يتم التشديد على دمج المتلازمات السريرية والنتائج المرضية العصبية للتشخيص النهائي.
الاستنتاجات
- تظهر هذه الدراسة بروتوكولًا فعالًا لتوصيف أنسجة الدماغ يمكن أن يحسن التشخيص والبحث في الأمراض التنكسية العصبية.
- تشدد على أهمية تقنيات الحصاد الدقيقة للدراسات المستقبلية حول شيخوخة الدماغ.
- تمتلك النتائج آثارًا كبيرة لفهم صحة الدماغ والتدخلات العلاجية المحتملة.
الأسئلة المتداولة
Executive Industry Relevance
This protocol supports target validation in neurodegenerative disease research by enabling histologically well-defined tissue collection from both hemispheres, facilitating mechanistic de-risking through correlated omics and pathology data. It enhances predictive confidence in preclinical models by providing neuropathologically verified human brain samples linked to longitudinal clinical and lifestyle data. The approach strengthens translational continuity by integrating ante-mortem phenotyping with post-mortem neuropathology, reducing biological uncertainty in target selection.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through direct comparison of frozen and fixed tissue from contralateral hemispheres for omics and histology alignment.
- Operational Value: Supports biological de-risking by providing neuropathologically confirmed tissue to validate target engagement and pathway modulation.
- Strategic Value: Improves target confidence by linking clinical syndrome with definitive neuropathological diagnosis, reducing false-positive target assumptions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares well-characterized brain tissue for biomarker assay development using histologically defined regions from both hemispheres.
- Operational Value: Enables assay standardization through reproducible tissue processing and fixed/frozen pairing for cross-platform validation.
- Strategic Value: Enhances screening readiness by supplying qualified human tissue for target-based and phenotypic screening cascades.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates disease-relevant system modeling by providing human tissue with matched clinical and neuropathological profiles for target validation.
- Operational Value: Supports preclinical continuity by allowing omics studies on histologically validated tissue, improving biomarker translatability.
- Strategic Value: Enables risk-adjusted advancement decisions through mechanistic de-risking using human-derived pathological and molecular data.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum by supplying validated human brain tissue for target identification, assay development, and preclinical validation stages, particularly in neurodegenerative programs requiring pathological confirmation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling molecular analysis of histologically defined brain regions linked to clinical phenotypes.
- Screening: Enhances assay readiness through standardized tissue preservation and longitudinal donor data for reproducible biomarker measurement.
- Analytics: Generates quantitative neuropathological and omics readouts that enable cross-condition comparison and target prioritization.
- Translational Research: Connects discovery to preclinical validation by providing human tissue with verified pathology, improving predictive modeling of target modulation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable tissue characterization pipeline for longitudinal neurodegenerative studies across multiple therapeutic programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity through neuropathologically verified human tissue.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility via paired fixed/frozen processing and detailed labeling protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing pathological confirmation to de-risk targets before preclinical investment.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization by integrating clinical, lifestyle, and neuropathological data for target validation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in neuroanatomy, neuropathology, and aseptic tissue handling for proper dissection and preservation.
- Depends on instrumentation including scalpels, saws, forceps, cryogenic storage, and formalin fixation systems.
- Necessitates cross-team standardization between clinical coordinators, neuropathologists, and molecular biologists for consistent data collection.
- Involves adaptation considerations for different brain regions and pathologies due to asymmetric disease distribution.
- Limited by geographic donor availability and resource intensity of longitudinal clinical assessment and neuropathological processing.
