العزلة والتمايز من المقاطع الاساسيه من الماوس الهيكل العظمي العضلات الشرح
أكتوبر 15, 2019
وتنتشر الخلايا السلائف التي تفرق لتشكيل myotubes بولينوتيد وألياف عضلية في نهاية المطاف الهيكل العظمي العضلات. هنا ، نقدم بروتوكولا للعزل الفعال وثقافة العضلات الاوليه من عضلات الماوس الكبار الشباب الهيكل العظمي. وتتيح هذه الطريقة الدراسات الجزيئية والجينية والايضيه لخلايا العضلات في الثقافة.
هذا هو بروتوكول لعزل الخلايا الجذعية الأولية عضلة الماوس لدراسة الأيض السابقين فيفو. يوفر هذا البروتوكول عددًا أكبر بكثير من الخلايا الجذعية مقارنة بالبروتوكولات الأخرى التي جربناها في الماضي. والأهم من ذلك، بمجرد أن نفرق هذه الخلايا الجذعية إلى ميوتوب، فإنها تظهر علم وظائف الأعضاء الطبيعي، لذلك أشياء مثل الإيقاعات الإيقاعية.
عند محاولة هذا الإجراء للمرة الأولى، أخذ ملاحظات مفصلة وحفظ عدة صور لأن كل explant الأنسجة تبدو مختلفة، وسوف يكون هناك اختلاف في الخروج من myoblasts. بدون مظاهرة مرئية، من الصعب معرفة ما إذا كنت تقوم بعزل الخلايا الصحيحة. لقد استفدنا من المساعدة السخية من الآخرين الذين أظهروا لنا هذه الطريقة عندما أنشأناها في مختبرنا.
بعد تحضير الطبق للتشريح وفقاً للمخطوطة، أعد غرفة رطبة بوضع ورقين إلى ثلاث أوراق سميكة من الماصات في كيس بلاستيكي واستخدام ماصة لتبلل سطح الورقة بالماء المعقم. ضع الغرفة تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة خمس دقائق لتعقيم. تشريح العضلات المطلوبة من ماوس يبلغ من العمر أربعة إلى ثمانية أسابيع وشطف بلطف في برنامج تلفزيوني يحتوي على 40 ميكروغرام لكل ملليلتر gentamycin لتعقيم.
استخدام ملقط العقيمة لنقل العضلات إلى طبق معقمة 10 سم غير المغلفة Petri. إضافة 0.5 إلى ملليلتر واحد من وسائل الاعلام الطلاء على العضلات بحيث الأنسجة رطبة ولكن ليس عائمة. استخدام مشرط عقيمة أو شفرة حلاقة لشريحة بلطف العضلات إلى أجزاء صغيرة.
استخدام ملقط أو ماصة لنقل شظايا العضلات على سطح لوحة ستة سنتيمترات المغلفة مسبقا. تراكب بلطف جدا إضافية 0.8 ملليلتر من وسائل الاعلام الطلاء على الأنسجة. ضع طبق الستة سنتيمترات الذي يحتوي على شظايا العضلات داخل الغرفة الرطبة وإعادته إلى حاضنة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية و5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 48 ساعة.
إعداد وسائل الإعلام myoblast قبل ال وجميعه، التربسين وPBS-gentamycin في حمام مائي في 37 درجة مئوية. لمعطف قارورة T25 لكل مجموعة العضلات، إضافة ملليلترين من حل طلاء لسطح القارورة، يهز بلطف لخلق معطف حتى على السطح، واحتضان قارورة في أربع درجات مئوية لمدة ساعة واحدة. الآن مع ماصة، وإزالة وسائل الاعلام الطلاء من explants العضلات وشطف بلطف explants العضلات مع ملليلتر اثنين من برنامج تلفزيوني-gentamycin.
إزالة بسرعة برنامج تلفزيوني وعدم السماح لوحة الجلوس في برنامج تلفزيوني. ثم يضاف بلطف ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني-gentamycin ووضع لوحة في الحاضنة درجة 37 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة. استخدام ماصة P1000 لجمع برنامج تلفزيوني مع الخلايا في أنبوب جهاز طرد مركزي 15 ملليلتر.
بعد ذلك، أضف ملليلتر واحد من التربسين إلى الطبق واعيده إلى حاضنة درجة 37 درجة مئوية لمدة ثلاث دقائق. اضغط بلطف على اللوحات لطرد القوالب. جمع التربسين مع الخلايا والجمع مع جمع برنامج تلفزيوني.
إضافة ثمانية ملليلتر من وسائل الاعلام myoblast إلى أنبوب الطرد المركزي وعكس بلطف لخلط. تراكب بلطف مليلترين من محلول الطلاء على لوحات العضلات وإعادة اللوحات إلى حاضنة درجة مئوية 37. تدور أنابيب الطرد المركزي التي تحتوي على خلايا في جهاز طرد مركزي لمدة ثلاث دقائق في 200 مرة ز.
استلهمت من فوق ونبقي ما يقرب من ملليلتر في الأنبوب. إضافة وسائط myoblast بلطف، ونقل الخلايا إلى قارورة المغلفة مسبقا ووضع القارورة في حاضنة درجة مئوية 37. استلهم وسائل الإعلام من قارورة P0 myoblast T25.
شطف الخلايا لفترة وجيزة مع ملليلترين من برنامج تلفزيوني دافئ-gentamycin ثم pirate برنامج تلفزيوني من القارورة. الماصات ملليلتر اثنين من PBS الدافئة في كل قارورة تحتوي على myoblasts. ضع القارورة مع برنامج تلفزيوني في حاضنة درجة مئوية 37 لمدة ثلاث دقائق.
ثم اضغط بقوة على جانب القارورة لطرد الخلايا. تحقق تحت مجهر خفيف لتعويم myoblasts بحرية. ضع القارورة تستقيم في غطاء لثقافة الأنسجة وشطف الجزء السفلي من القارورة مع 10 ملليلترات من وسائل الإعلام myoblast مرتين إلى ثلاث مرات لضمان طرد جميع الخلايا.
جمع خليط وسائط الخلية في أنبوب جهاز طرد مركزي 15 ملليلتر. جهاز طرد مركزي لمدة ثلاث دقائق في 200 مرة ز. التعرق وسائل الإعلام على ترك حوالي ملليلتر واحد في أنبوب يجري الحرص على تجنب بيليه الخلية.
أضف بلطف حجمًا مناسبًا من وسائط myoblast إلى أنبوب الطرد المركزي واخلط بلطف. توزيع خليط الخلية على قارورة T75 جديدة ستة ملليلتر لكل من. أضف 10 ملليلترات من وسائط myoblast إلى كل قارورة T75 جديدة.
هز القارورة أفقياً بلطف لتوزيع الخلايا ووضعها في الحاضنة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. في هذا البروتوكول، تم رصد الخلايا الأولية من explants تحت مجهر ضوء قياسي. وبدا الحصاد المبكر من myoblasts كما جولة صغيرة والمجالات مشرق.
استغرق التمايز من myoblasts أربعة إلى ستة أيام خلالها مورفولوجيا الخلايا تغيرت من مجالات جولة واحدة إلى ألياف طويلة طويلة متعددة نوات. تم إنتاج شتّى ميوتوبات مختلفة تماماً والتي كانت جاهزة لقياس معدلات استهلاك الأكسجين. يمكن استخدام هذه الخلايا لعدد من التطبيقات المتلقين للمعلومات.
على سبيل المثال، نحن كثيرا ما تستخدم لهم لدراسة تدفق الركيزة في الصكوك Seahorse.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
النظرة العامة
يحدد هذا البروتوكول عزل الميوبلاستات الأولية من عضلات هيكل الماوس البالغ الشاب، مما يسهل دراسة استقلاب خلايا العضلات خارج الجسم. تنتج الطريقة عددًا أكبر من الخلايا الجذعية مقارنة بالتقنيات السابقة، مما يسمح بدراسات فسيولوجية مفصلة.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- بيولوجيا الخلية
- فسيولوجيا العضلات
الخلفية
- الميوبلاستات هي خلايا سليفة تتمايز إلى أنبوبيات عضلية وألياف عضلية هيكلية.
- فهم استقلاب خلايا العضلات ضروري للعديد من الدراسات البيولوجية.
- البروتكلات السابقة أسفرت عن عدد أقل من الخلايا الجذعية العضلية.
- التوضيح المرئي ضروري للعزل الناجح للخلايا الصحيحة.
هدف الدراسة
- تقديم طريقة فعالة لعزل الميوبلاستات الأولية.
- تمكين الدراسات الجزيئية والوراثية لخلايا العضلات.
- توفير رؤى حول استقلاب وفسيولوجيا خلايا العضلات.
الطرق المستخدمة
- عزل الميوبلاستات الأولية من عضل الماوس الهيكلي.
- زراعة الميوبلاستات للتمايز إلى أنبوبيات عضلية.
- التوثيق المرئي للأنسجة المستأصلة أثناء الإجراء.
- المقارنة مع بروتوكولات العزل السابقة.
النتائج الرئيسية
- ينتج البروتوكول عددًا أكبر من الميوبلاستات.
- تظهر الأنبوبيات العضلية المشتقة من هذه الخلايا خصائص فسيولوجية طبيعية.
- تتطلب التنوع في الأنسجة المستأصلة مراقبة وتسجيلًا دقيقين.
- يتم تعزيز العزل الناجح بالإرشاد البصري من الباحثين ذوي الخبرة.
الاستنتاجات
- هذه الطريقة فعالة لدراسة استقلاب خلايا العضلات.
- توفر طريقة موثوقة للحصول على الميوبلاستات الأولية.
- يمكن للدراسات المستقبلية الاستفادة من هذا البروتوكول في مختلف الأبحاث المتعلقة بالعضلات.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Robust isolation and differentiation of primary myoblasts from mouse skeletal muscle explants enables reproducible ex vivo modeling of muscle cell metabolism for early-stage drug discovery. This system supports high-fidelity investigation of metabolic pathways, substrate utilization, and genetic perturbations in a scalable, standardized format. The approach enhances predictive confidence for target validation and mechanistic de-risking in muscle-related therapeutic programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of metabolic pathways and functional target validation in primary muscle cells.
- Supports mechanistic de-risking by providing physiologically relevant myotube models with normal circadian rhythms.
- Facilitates hypothesis-driven studies on muscle metabolism and gene function using exogenous DNA or viral vectors.
Screening & Assay Development
- Provides a reproducible source of primary myoblasts for quantitative metabolic assays, including substrate flux analysis.
- Supports assay standardization and scalability for downstream compound screening in muscle cell systems.
- Enables preparation of differentiated myotubes suitable for high-content metabolic readouts.
Translational & Preclinical Research
- Offers a disease-relevant ex vivo system for studying metabolic phenotypes across mouse models.
- Aligns with translational biomarker strategies by enabling direct measurement of oxygen consumption and substrate utilization.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by bridging in vitro and in vivo muscle biology.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery continuum from early target validation through assay development and preclinical metabolic studies.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing and pathway clarification in primary muscle cells.
- Screening: Delivers reproducible, scalable cell populations for quantitative metabolic assays.
- Analytics: Enables measurement of oxygen consumption rates and substrate flux for comparative analysis.
- Translational Research: Provides an ex vivo platform for aligning metabolic findings with in vivo models.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized workflow for repeated use across muscle metabolism projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in muscle metabolism studies.
- Operational Value: Enhances reproducibility, scalability, and standardization of primary cell workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital efficiency in early-stage muscle target programs.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of muscle-related therapeutic assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary cell isolation and differentiation techniques.
- Needs access to sterile tissue culture facilities and metabolic assay instrumentation.
- Demands rigorous cross-team standardization for reproducibility and data comparability.
- May require adaptation for different mouse models or muscle tissue sources.
- Visual documentation and training are critical due to variability in explant outgrowth.
