دراسة ثلاثية سلبية سرطان الثدي باستخدام نموذج سرطان الثدي Orthotopic

بروتوكولنا يتغلب على نافذة التصوير الكهربائي المحدود من خلال تضمين علامة GFP التي تسهل أيضًا الكشف عن ميكروميتاساساتيس وتحديد كمه من خلال تحليل PCR. لأن علامة GFP يتحايل على نافذة اقتناء الإضاءة الحيوية المحدودة، يمكن تصوير المزيد من المواضيع دون فقدان الإشارة وتكون إمكانية الحصول على نتائج سلبية خاطئة محدودة. هذه الدراسة ستكون مفيدة للباحثين لتقييم الفعالية العلاجية للعوامل المضادة للسرطان.

هذه المنهجية توفر نموذجا مفيدا للباحثين المهتمين EMT, مقاومة الأدوية, وآليات الخلايا الجذعية السرطانية المتعلقة بعملية النقيلي وكذلك لتطوير الأدوية المضادة للسرطان. بعد التأكد من عدم وجود استجابة لدواسة منعكس، مسحة الغدة الثديية الرابعة اليسرى مع الكحول واستخدام غرامة الجرذ الأسنان ملقط لرفع الغدة الثديية الرابعة قليلا. التأكد من شطبة طرف، إدراج إبرة قياس 25 تعلق على حقنة ملليلتر واحد يحتوي على 100 ميكرولترات من مزيج مصفوفة غشاء الطابق السفلي الخلية وتراجع قليلا المكبس للتأكد من الإبرة لا تتصل أي الأوعية الدموية.

للحصول على نتائج مقارنة، يجب أن يكون موقع حقن الخلايا السرطانية متناسقًا بين جميع الحيوانات المتلقية. إذا لم يدخل الدم في الحقنة ، وحقن ببطء كامل حجم المحلل في وسادة الدهون الثديية. سوف تظهر كتلة مستديرة مرفوعة تحت الجلد.

انتظر 10 إلى 15 ثانية لمصفوفة غشاء الطابق السفلي لتصلب قبل إزالة الإبرة والسماح للxenograft لتنمو بحرية دون انقطاع لمدة سبعة إلى 10 أيام قبل إجراء قياس حجم الورم. ثم استخدام الفرجار لقياس حجم xenograft في كل من الفئران وتحديد حجم الورم باستخدام المعادلة كما هو مبين. قبل تصوير الدراسة، صورة ثلاثة ورم إضافي يحمل الفئران لمدة 40 دقيقة على فترات لمدة دقيقتين باستخدام المعلمات كما هو مبين للحصول على حركية لوسفيرين للدراسة.

استخدم إشارة الإضاءة الحيوية المقاسة في ذروة لتحديد الإطار الزمني الأمثل للحصول على الصورة لجميع النقاط الزمنية اللاحقة. لأداء التصوير الانبثاث، تغطية الورم الأساسي مع قطع كم من قفاز أسود ووضع الماوس تخدير في الماسح الضوئي ثم صورة إشارة لوسيفيرين باستخدام نفس المعلمات كما أظهرت للتو مع الجانب البطني من الماوس التي تواجه الكاميرا لتصوير الانبثاث الرئة والجانب الظهري من الماوس التي تواجه الكاميرا لتصوير الانبثاث الدماغ. باستخدام برنامج الماسح الضوئي وتحليل البيانات، رسم منطقة ذات أهمية على المنطقة المصورة لضمان تغطية الجهاز بأكمله من الاهتمام للسماح بتقييم العبء النقيلي وقياس الناتج التخمين الحيوي كتدفق إجمالي والفوتونات في الثانية الواحدة.

مباشرة بعد القياس الكمي إشارة الإضاءة الحيوية، وحصاد أنسجة الدماغ والرئة وشطف الأعضاء بسرعة في برنامج تلفزيوني لإزالة أي بقع الدم السطحية. ضع الأعضاء على لوحة بلاستيكية سوداء منخفضة الفلورة التلقائية ونقل العينات إلى ماسح ضوئي فلوري متعدد الأطياف مجهز بقدرة فك ية طيفية للكشف عن GFP. للحصول على صور متعددة الأطياف من GFP للأعضاء المستخرجة، تفحص الأجهزة من 500 إلى 720 نانومتر مع حجم الخطوة من 10 نانومتر.

للحصول على التشكيل الجانبي للفلورس التلقائي للأنسجة، قم بفحص الأعضاء المبتورة من فئران التحكم غير المُطلقة. بالإضافة إلى ذلك، صورة GFP الأنسجة الإيجابية مثل الورم الأولي للحصول على الفلورا السيارات مختلطة GFP الشخصي. معالجة هذه الأطياف وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة لإنشاء مكتبة الطيفية مع GFP نقية ومواصفات الفلورانس السيارات.

بعد التأكد من دقة المكتبة الطيفية وفصل إشارة GFP من خلفية الأنسجة المفلورة التلقائية ، استخدم نفس المكتبة لتكميز جميع الصور في الدراسة. لاستخراج الحمض النووي بعد تجميد المفاجئة، ووضع الدماغ كله في أنبوب تجانس خمسة ملليلتر تحتوي على ملليلترين من العازلة DNA تحلل واستخدام التجانس تعيين إلى 50 لتجانس الأنسجة. عندما تم تجانس الأنسجة تماما، نقل ملليلتر واحد من lysate إلى DNAse وRNAse مجانا اثنين من المليلتر microcentrifuge أنبوب وعزل الحمض النووي وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.

إضافة 500 ميكرولترات من 100٪ الإيثانول لعزل وخلط العينة عن طريق الانقلاب. بعد ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة، واستخدام ماصة لنقل الحمض النووي مثل الصوف يترسب إلى اثنين من المليلتر DNAse جديدة وRNAse أنبوب الحرة. السماح للعينة الهواء الجاف لمدة دقيقة واحدة قبل إضافة ملليلتر واحد من 75٪ الإيثانول إلى الأنبوب وعكس الأنبوب ثلاث إلى ست مرات لغسل العينة.

تخلص من الإيثانول بعد الانقلاب الأخير قبل غسل الحمض النووي مرتين أكثر مع الإيثانول الطازج لكل غسل كما هو موضح للتو. بعد الغسيل الأخير، يجفف الهواء العينة لمدة 10 ثوانٍ قبل أن يذوب الحمض النووي في 52 ميكرولتر من ثمانية ملليمولار هيدروكسيد الصوديوم. نقل اثنين من aliliter microliter من الحمض النووي إلى قارورة مقياس الطيفية وتحديد تركيز الحمض النووي في العينة باستخدام نسبة امتصاص بين A260 و 280 وفقا للصيغة.

ضبط تركيز الحمض النووي للعينة إلى 50 نانوغرام لكل ميكرولتر مع ثمانية ملليمولار هيدروكسيد الصوديوم إضافية وتصميم زوج التمهيدي محددة لتسلسل GFP الخضراء الخارجية في المنزل باستخدام بوابة ويب تصميم التمهيدي مفتوحة المصدر للكشف في الوقت الحقيقي PCR من علامة GFP والخلايا النقيلي التي غزت واستعمرت المواقع القعدة من الورم. ثم استخدم كاشف PCR سريع في الوقت الحقيقي وجهاز PCR في الوقت الحقيقي الذي يدعم بروتوكول PCR سريع في الوقت الحقيقي لتحليل PCR الكمي في الوقت الحقيقي للعينة. للكشف عن خلايا سرطان الثدي النقيلي في الرئة، استخدم مقص تشريح لفتح تجويف الصدر وقطع الماضي القلب والزعتر لفضح القصبة الهوائية.

أدخل إبرة قياس 22 تعلق على حقنة 10 ملليلتر تحتوي على محلول بوين في القصبة الهوائية والاكتئاب المكبس حتى تصبح الرئة المنهارة منتفخة مع ما يقرب من ملليلتر من الحل. إزالة الحقنة والإبرة مرة واحدة وقد تم تضخيم الرئتين ونقل الرئة كلها إلى أنبوب 15 ملليلتر تحتوي على محلول بوين الطازجة. عكس بلطف أنبوب عدة مرات قبل مغادرة الأنسجة لنقع لمدة 24 ساعة في درجة حرارة الغرفة.

في اليوم التالي، شطف الرئة بالماء ووضع العينة في أنبوب من 70٪ الإيثانول. ثم استخدم مجهر تشريح لحساب عدد من بقع بيضاء النقيلي والعقيدات على أسطح الرئتين. قياس حجم الورم بواسطة الفرجر هو طريقة راسخة لتقييم فعالية العلاج.

للحصول على إشارات مماثلة بين مجموعات الدراسة، يجب إجراء دراسة حركية BLI قبل التصوير لتحديد الإطار الزمني للتصوير الأفضل. نظرا لنسبة إشارة إلى خلفية متفوقة، والجسم كله في BLI vivo حساس جدا في الكشف عن إشارات الانبثاث منخفضة المستوى مقارنة مع نهج GFP. ومع ذلك ، بسبب الطبيعة المستقرة لجزيء GFP ، فإن الباحثين لديهم الوقت الكافي لمعالجة الذبيحة قبل التقاط إشارات GFP من الأعضاء المستهدفة في دراسات المراسلين المزدوجين.

يوضح هذا المثال الحقيقي كيف يمكن أن تشوه قياسات حجم الورم الفرجر تفسير البيانات حيث فقد هذا xenograft معظم محتوى الخلايا السرطانية القابلة للحياة مع الحفاظ على كتلته وشكله الكبير. ويمكن أيضا الكشف الجزيئي بواسطة PCR في الوقت الحقيقي توفر أدلة مقنعة على الانبثاث الدماغ في نموذج سرطان الثدي العظام باستخدام تسلسل الحمض النووي GFP الخارجية كما تسلسل الحمض النووي GFP عبر العدوى لا توجد بشكل طبيعي في البشر أو القوارض. يجب أن يكون موقع الزرع مرتبطًا من الناحية الفسيولوجية والتشريحية بتشويه السرطان.

يمكن تقييم كل من الجينات الورمية والتعبير البروتيني في المواقع الأولية والهدّية ويمكن عزل الخلايا النقيليّة لمزيد من التوصيف.