توصيف التدفق الخلوي المتزامن لأنواع الخلايا المتعددة التي تم استردادها من الدماغ/الحبل الشوكي من خلال أساليب تجانس مختلفه
نوفمبر 19, 2019
نقدم طريقه قياس التدفق الخلوي للتعرف علي أنواع مختلفه من الخلايا التي يتم استردادها من دماغ الماوس أو الحبل الشوكي في نفس الوقت. ويمكن استغلال هذه الطريقة لعزل أو توصيف مجموعات الخلايا النقية في الامراض التنكسية العصبية أو لقياس مدي استهداف الخلايا في الاداره المجرية لنواقل أو جسيمات نانويه فيروسية.
تطوير الجينات الانتقائية وأدوات تسليم المخدرات لعلاج الاضطرابات العصبية، يتطلب تحديد كم وتوصيف استهداف الخلايا، عند إعادة الإدارة، أو ناقلات الفيروسية، أو الجسيمات النانوية. لديهم القدرة على الإنتاجية ومتعددة من تدفق القياس الخلوي، ويسمح لتحديد مباشرة وفي وقت واحد من أنواع الخلايا المتعددة من الدماغ الماوس والحبل الشوكي. وسوف يكون إثبات الإجراء فرانسيسكو خافيير مولينا استيفيز، وهو ما بعد الدكتوراه من مختبر الكسندر.
بعد حصاد الدماغ والحبل الشوكي من فأر C57 Black 6 البالغ من العمر ثمانية أسابيع ، ضع الأنسجة في آبار فردية لطبقة من ستة آبار ، تحتوي على ملليلترين من الجليد البارد HPSS لكل بئر على الجليد. تقسيم كل الأنسجة المحصودة إلى قطعتين متساويتين. واستخدام مقص ل mince نصف عينة كل نسيج في قطعة سميكة ملليمتر واحد إلى اثنين.
عندما تم تفتيت جميع الأنسجة، قبل شطف 1، 000 ميكرولتر ماص تلميح في HPSS، واستخدام ماصة لنقل كل تعليق الأنسجة إلى أنابيب مخروطية 15 ملليلتر الفردية. شطف الآبار مع ملليلتر اثنين إضافية من HPSS في البئر. وسحب يغسل في الأنابيب المخروطية 15 ملليلتر المقابلة.
رواسب العينات عن طريق الطرد المركزي. وخلط 50 ميكرولترات من انزيم P من مجموعة تفكك الأنسجة العصبية مع 1, 900 ميكرولترات من العازلة X من عدة لكل عينة. دافئة مزيج الانزيم في 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق على الأقل.
ويُفطّن المُنْتَرَح من كلّ أنبوب جمع الأنسجة. عندما يكون خليط الإنزيم جاهزًا، أضف 1.95 ملليلتر من المحلل لكل عينة. ودوامة بلطف لإعادة تعليق الكريات.
المقبل، احتضان العينات على عجلة لمدة 15 دقيقة في 37 درجة مئوية، ومزيج 10 ميكرولترات من انزيم A مع 20 ميكرولترات من Y العازلة لكل عينة. Prewarm محلول الانزيم الثاني في 37 درجة مئوية، قبل إضافة 30 ميكرولترات من الحل إلى كل حل الأنسجة في نهاية الحضانة اهتزاز. استخدم 1000 طرف ماصة ميكروليت، مشطف مسبقًا مع HPSS لخلط كل عينة بلطف.
وإرجاع العينات إلى العجلة لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية. في نهاية الحضانة، اعتقال ردود الفعل الأنزيمية مع 10 ملليلتر من الجليد البارد HPSS. ورواسب العينات عن طريق الطرد المركزي.
في نهاية الطرد المركزي، إعادة تعليق الكريات في سبعة ملليلتر من الجليد البارد HPSS لكل أنبوب. ودوامة بلطف كل عينة، قبل عقد الأنابيب على الجليد. بالنسبة لتجانس الأنسجة، أضف ثلاثة ملليلترات من HPSS المبردة مسبقًا إلى مدفع الهاون الزجاجي المبرد مسبقًا لمطحنة أنسجة الدونسي، ونقل النصف الثاني من عينة واحدة من أنسجة الدماغ أو الحبل الشوكي المقطوعة إلى هاون.
بلطف لطخ الأنسجة مع 10 السكتات الدماغية من Pestle A، تليها 10 السكتات الدماغية من ب. Pestle ونقل خليط متجانس في أنبوب جديد مخروطي 15 ملليلتر. املأ الأنبوب إلى حجم نهائي من 10 ملليلترات مع HPSS المبردة مسبقًا للطرد المركزي. وإعادة تعليق بيليه في سبعة ملليلتر من HPSS الطازجة مع دوامة، قبل عقد العينة على الجليد.
لإزالة الحطام، إضافة ثلاثة ملليلتر من محلول Percoll متساوي التوتر المبردة مسبقاً إلى كل عينة هضمية أو متجانسة. ودوامة بلطف العينات للتأكد من أنها مختلطة متجانسة. المقبل، الطرد المركزي العينات، وإزالة القرص الأبيض بعناية من الحطام والميلين العائمة على سطح المحلل.
عندما تم التخلص من الحطام ، وجمع كل ما عدا 100 ميكرولترات الماضي من عظمى من كل أنبوب دون إزعاج الكريات. إعادة تعليق كل بيليه في ملليلتر واحد من حل BL FACS لنقلها إلى أنابيب 1.5 ملليلتر microcentuge الفردية. بعد هذا التكامل مع حل Percoll، من المهم إزالة القرص الحطام وsupernatant بعناية فائقة دون إزاحة بيليه الخلية لتجنب فقدان العينة.
بعد الطرد المركزي، وpirate بعناية كبرى من كل أنبوب، وإعادة تعليق الكريات في 350 ميكرولترات من FACS BL الطازجة لكل أنبوب. لتحليل تدفق الخلايا الخلوية من أنواع الخلايا المعزولة، احتضان العينات مع خمسة ميكروغرام لكل ملليلتر من كتلة FC لكل أنبوب لمدة 10 دقائق في أربع درجات مئوية قبل إضافة الأجسام المضادة المناسبة لكل أنبوب وفقا للبروتوكول الدائمة المبينة في الجدول. دوامة كل أنبوب لمدة خمس ثوان لخلط.
ووضع العينات عند أربع درجات مئوية لمدة 15 دقيقة محمية من الضوء. في نهاية الحضانة، وغسل العينات مع ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني لكل أنبوب، والطرد المركزي. إعادة تعليق الكريات في الحجم المناسب من streptavidin لكل أنبوب.
بعد دوامة لخلط، احتضان العينات لمدة 10 دقائق في أربع درجات مئوية محمية من الضوء. وغسل الخلايا مع ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني لكل أنبوب كما هو موضح. بعد التخلص من super، إعادة تعليق الكريات في 300 ميكرولتر من FACS BL الطازجة لكل أنبوب.
وتسمية كل عينة مع خمسة ميكرولترات من 7-AAD. ثم تخزين العينات في أربع درجات مئوية محمية من الضوء حتى تحليل cytofluorometric. ينتج أسلوب التجانس زيادة غلة الخلايا من كل من الدماغ والحبل الشوكي بشكل عام ، ولكن غالبية الخلايا التي يتم استردادها عادة ما تكون ميتة ، مما يؤدي فقط إلى شفاء حوالي 14 ٪ من الخلايا القابلة للحياة من الدماغ ، وقرابة 10 ٪ تلتئم من الحبل الشوكي.
في المقابل, طريقة الهضم papain النتائج في الحفاظ بشكل أفضل عموما من قابلية البقاء الخلوية. تحليل تعليق خلايا الدماغ والحبل الشوكي مع تسعة لون ثنائي التدفق الخلوي، ويكشف عن وجود CD45 + CD11b + microglia، و الضامة. و CD45+CD11b-اللمفاويات في كلا النسيجين.
ويمكن بعد ذلك التمييز بين مجموعات الخلايا CD45 وفقاً لإيجابيتها بالنسبة للعلامات الفلكية، أو علامات القلة oligodendrocyte، أو تعبير علامة السطح الوحشية والبطانية. باستخدام طريقة التجانس، ما بين 32 إلى 38٪ من الخلايا القابلة للحياة هي من أصل دموي. في حين أن طريقة الهضم الأنزيمية النتائج في الحصول على جزء كبير جدا من خلايا CD45-غير مكون للدم.
من اللافت للنظر أن CD45+CD11b+microglia و الضامة تمثل الكسر الخلية الأكثر وفرة قابلة للحياة مع طريقة التجانس. طريقة الهضم، ومع ذلك، تنتج تمثيل أكثر التجانس من أنواع الخلايا بما في ذلك الخلايا الفلكية، oligodendrocytes، الخلايا البطانية، والخلايا العصبية. هذا البروتوكول متعدد الاستخدامات، ويمكن استغلاله لعدة تطبيقات في المصب مثل القياس الكمي أو عزل الخلايا الفرعية المحددة، أو الثقافة الأولية، أو الكيمياء الحيوية، أو تحليل تسلسل الحمض النووي الريبي.
لقد نفذنا هذا البروتوكول لتقييم التعبير الجيني والتوقيعات الوظيفية لمختلف سكان الجهاز العصبي المركزي أثناء هذا التقدم، أو بعد العلاج في نموذج فأر من التصلب الجانبي داخل الغدد.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تقدم هذه المقالة طريقة لقياس تدفق الخلايا لتحديد أنواع الخلايا المختلفة في وقت واحد من دماغ الفأر والحبل الشوكي. يمكن استخدام هذه التقنية لعزل أو تحديد خصائص مجموعات الخلايا النقية في الأمراض التنكسية العصبية وتقييم استهداف الخلايا بعد إعطاء النواقل الفيروسية أو النانو الجسيمات في الجسم الحي.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- بيولوجيا الخلية
- قياس تدفق الخلايا
الخلفية
- أدوات التسليم الانتقائي للجينات والعقاقير ضرورية لعلاج الاضطرابات التنكسية العصبية.
- تعد كمية وخصائص استهداف الخلايا ضرورية للعلاج الفعال.
- يوفر قياس تدفق الخلايا قدرات عالية الإنتاجية وتعدد الاستخدامات.
- تتيح هذه الطريقة تحديد أنواع الخلايا المتعددة بسهولة.
غرض الدراسة
- تطوير طريقة لتحديد أنواع الخلايا المختلفة في دماغ الفأر والحبل الشوكي.
- تسهيل عزل مجموعات الخلايا النقية للبحث.
- تقييم مدى استهداف الخلايا بواسطة النواقل الفيروسية أو النانو الجسيمات.
الطرق المستخدمة
- حصاد أنسجة الدماغ والحبل الشوكي من الفئران C57 Black 6.
- استخدام HPSS المثلج لحفظ الأنسجة.
- تقطيع عينات الأنسجة إلى قطع صغيرة للتحليل.
- استخدام قياس تدفق الخلايا لتحديد نوع الخلايا في وقت واحد.
النتائج الرئيسية
- تحديد ناجح لأنواع الخلايا المتعددة من الأنسجة المحصودة.
- ثبت فعالية قياس تدفق الخلايا في هذا السياق.
- توفير طريقة لتقييم استهداف الخلايا في الجسم الحي.
- تمكين تحديد خصائص مجموعات الخلايا ذات الصلة بالأمراض التنكسية العصبية.
الاستنتاجات
- تعتبر طريقة قياس تدفق الخلايا أداة قيمة لأبحاث علم الأعصاب.
- يمكن لهذه التقنية تعزيز فهم الأمراض التنكسية العصبية.
- تقدم إمكانية تحسين استراتيجيات توصيل الجينات والعقاقير.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
This method enables rapid, multiplexed quantification of CNS cell subtypes from mouse brain and spinal cord, supporting target validation and mechanistic de-risking in neurodegenerative disease research. By comparing homogenization and enzymatic dissociation approaches, it informs method selection based on cell yield, viability, and composition—critical for downstream applications like primary culture, gene expression, and functional assays. The workflow enhances predictive confidence in assessing viral vector or nanoparticle targeting, directly informing go/no-go decisions in early discovery pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by quantifying cell-specific targeting of viral vectors or nanoparticles in CNS tissues.
- Operational Value: Enables simultaneous identification of microglia/macrophages, lymphocytes, astrocytes, oligodendrocytes, neurons, and endothelial cells in a single assay.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by revealing differential cell viability and composition between dissociation methods.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, multiparametric readouts on cell surface markers (e.g., CD45, CD11b) for standardized immunophenotyping.
- Operational Value: Produces viable single-cell suspensions compatible with fluorescence-activated cell sorting (FACS) for downstream functional or genomic analysis.
- Scalability: Leverages flow cytometry’s high throughput to process multiple tissue samples and conditions in parallel.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-phase cell targeting data to preclinical validation via isolation of pure populations for gene expression or biochemical assays.
- Mechanistic De-risking: Clarifies which dissociation method preserves specific cell types (e.g., astrocytes, oligodendrocytes via enzymatic digestion; microglia/macrophages via homogenization), reducing ambiguity in target engagement studies.
- Disease Model Relevance: Applied to assess CNS cell populations in mouse models of neurodegenerative disease, supporting pharmacological or gene therapy evaluation.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead identification, providing quantitative cellular data that informs early go/no-go decisions before preclinical investment.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by measuring the extent and specificity of CNS cell targeting following in vivo administration of therapeutic agents.
- Screening: Delivers assay-ready, standardized cell suspensions with defined viability and composition, enabling reliable compound or vector screening.
- Analytics: Delivers multiparametric flow cytometry data (e.g., % viable cells, marker co-expression) that enables side-by-side comparison of dissociation methods and treatment conditions.
- Translational Research: Enables isolation of viable cell subtypes for downstream validation, such as RNA sequencing or functional assays, bridging discovery to preclinical mechanisms.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable immunophenotyping platform applicable across multiple CNS disease models and therapeutic modalities (viral vectors, nanoparticles, small molecules).
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in CNS target validation by providing quantitative, cell-type-specific data on therapeutic agent distribution.
- Operational Value: Standardizes tissue dissociation and immunophenotyping workflows, improving reproducibility across labs and studies.
- Strategic Value: Increases capital efficiency by enabling rapid method comparison and informed resource allocation to the most viable dissociation approach.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement decisions by clarifying which cell populations are accessible and viable under each preparation method.
Implementation Considerations
- Requires expertise in flow cytometry panel design, compensation, and multicolor immunophenotyping (9-color bio-flow cytometry used in study).
- Depends on access to a neural tissue dissociation kit (Enzyme P, Buffer X, Enzyme A, Buffer Y) and equipment for gentle tissue dissociation (Dounce homogenizer, rocking incubator, centrifuge).
- Necessitates standardized debris removal steps (e.g., Percoll gradient centrifugation) to ensure sample purity and avoid myelin or debris interference in flow cytometry.
- Must account for method-specific trade-offs: homogenization yields higher total cells but lower viability (~10–14%), while enzymatic digestion preserves viability and enriches non-hematopoietic CNS cells.
- Limited to suspended cell analysis; not suitable for spatial or anatomical distribution studies due to tissue homogenization.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:49
Enzymatic Brain and Spinal Cord Digestion
3:58
Mechanical Brain and Spinal Cord Homogenization
5:00
Debris Removal
6:19
Flow Cytometric Cell Staining
7:48
Results: Representative Relative Proportions of Different Cell Types Retrieved from the CNS According to the Tissue Homogenization Method
9:38
Conclusion
