تصنيع وتنفيذ منصة المجهر قوه السحب المرجعية الحرة

ويستخدم المجهر قوة الجر لقياس القوات التي تولدها الخلية. ويبسط هذا البروتوكول تحليل جمع بيانات قوة الجر، من أجل جعلها أكثر سهولة للمستخدمين عديمي الخبرة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على منصات المجهر قوة الجر الخالية من المرجعية الحالية ، هي أن الطباعة الحجرية متعددة الصور تسمح بإعادة تصميم إعداد النقش السريع والسهل وفقًا للاحتياجات التجريبية الفردية.

هناك العديد من الخطوات الرئيسية في تصنيع وتنفيذ منصة الجر الجديدة الخالية من المراجع التي يسهل فهمها من خلال التمثيل المرئي بدلاً من النص وحده. بالنسبة للوثنية من الهيدروجيل الأساسي ، أضف أولاً ثلاثة ميكروليترات من محلول ما قبل البوليمر على ورقة رقيقة ومسطحة من الككانات البيرفلوروالكوكسي ، ووضع شرائط PDMS سميكة 150 ميكرومتر مسطحة تحيط ، ولكن ليس على اتصال ، قطرة محلول ما قبل البوليمر. ضع غطاءً سيلانيز سيلانيت أكريليت على PDMS، مع أن تكون قطرات ما قبل البوليمر مركزة تحت الغطاء لتسطيح قطرات ما قبل البوليمر بسماكة تباعدات PDMS.

يعرض حل ما قبل البوليمر إلى ضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة دقيقة واحدة. عندما يتم تشكيل هيدروجيل بالكامل، يفصل بعناية الغطاء عن الفواصل PDMS. استخدام عالية الأداء الاكريليك من جانبين لاصقة لإرفاق مفتوح أسفل طبق بيتري إلى coverslip.

خذ عناية خاصة عند التمسك غطاء الهيدروجيل محملة بطبق بيتري. طبق الرطب أو ضغط قليل جدا أثناء تطبيق سوف تسمح التسريبات لتشكيل، وتدمير العينة. تطبيق الضغط على سطح لاصقة لخلق ختم كامل بين غطاء لاصق، لاصق، وطبق بيتري، مع الحرص على عدم كسر الزجاج.

استخدام برنامج تلفزيوني معقم مصفاة لشطف الهيدروجيل. ثم إضافة ثمانية ميكرولترات من NVP إلى 800 ميكرولترات من محلول المختبر المعدة لتوليف هيدروجيل. لتحويل صورة ثنائية إلى قناع رقمي، افتح MATLAB وافتح و قم بتشغيل runscript.

m MATLAB النصي. حدد ملف TIF ثنائي للتحويل وحدد مجلد لحفظ ملفات المنطقة. إدخال الحجم النهائي المطلوب في ميكرون من الصورة المختارة.

سيتم تحجيم صورة الإدخال و أبعادها لمطابقة هذه المعلمات. لإنشاء صفيف بكسل واحد، في منطقة من خيارات مولد الفائدة، قم بإلغاء تحديد مربع إزالة tic ضمن وحدات بكسل صغيرة/مفردة، حدد مربع الساحات تيك ثم ألغ تحديد استخدام ضمن خطوط فاصل أفقي. ثم انقر فوق موافق. سيتم العثور على الملف OVL في المجلد المحدد مسبقاً.

افتح الملف في برنامج المجهر وحمّل المناطق المطلوبة التي تتحكم في مصراع الليزر أثناء التصوير الحجري بالليزر الفوتونين. يجب تنفيذ الخطوات التالية في ظروف مع الحد الأدنى من الضوء. لتصنيع صفائف علامة fiducial في ظل ظروف الإضاءة المنخفضة، مزيج دقيق 200 ميكرولترات من محلول مختبر NVP المعدة مسبقا مع 20 ملليغرام من فلور اليكسا 633 وإزالة كل من برنامج تلفزيوني من الطبق الذي يحتوي على هيدروجيل.

أضف خليط PEG-633 إلى الهيدروجيل كقطيرة تشمل تماماً الهيدروجيل الأساسي وتحميل طبق بيتري على حامل العينة من مرحلة المجهر. ثم تغطية الطبق والسماح لمحلول النقش لامتصاص في الهيدروجيل لمدة 30 دقيقة على الأقل، محمية من الضوء. لتكوين المجهر للتصوير، حدد الليزر المناسب والفلاتر لتصور فلور أليكسا 488.

حدد موقع الهيدروجيل باستخدام إشارة PEG-488 وحظر جمع أطوال موجية أطول من الكاشف. استخدام لوحات عمودية وأفقية بمسح لتحديد موقع مركز الهيدروجيل في الطائرة س ص وصفر المرحلة في هذا الموقف. استخدام خط المسح الضوئي في دالة Z-المكدس لتحديد موقع سطح الهيدروجيل وصفر التركيز في هذا الموقف.

مستوى الهيدروجيل عن طريق تكرار خط بمسح بعيدا عن مركز XY لتحديد موضع السطح، وضبط مجموعة مسامير لمرحلة المجهر، حسب الضرورة. ضمن مساحة عمل برنامج المجهر، قم بإنشاء ملف تجربة منفصل للتصوير الضوئي وتعيين الطاقة متعددة الفوتونات إلى 1.8٪ وسرعة المسح الضوئي إلى ستة. اضبط حجم إطار الصورة والبكسل لتحقيق حجم بكسل 0.1 ميكرومتر لكل بكسل ونسبة عرض إلى ارتفاع 100 إلى واحد، ثم قم بتحميل ملف المناطق في علامة تبويب المنطقة.

استخدام ماكرو لتعيين كافة المناطق للحصول على وتشغيل دالة Z-مكدس. تعيين التباعد إلى 3.5 ميكرومتر لعمق إجمالي 28 ميكرومتر والعدد الإجمالي لشرائح Z من تسعة. ثم استخدم وظيفة المواضع لتعيين مواقع محددة على الهيدروجيل حيث سيتم صفائف علامة fiducial يكون photopatterned.

مع اقتراب وقت الناقع من علامة 30 دقيقة ، احصل على مسح متتالي لخط Z -stack لسطح الهيدروجيل كل خمس دقائق للتحقق من وجود تورم استنادًا إلى التغييرات في موقع السطح نسبة إلى موضع التركيز الصفري. إذا لم يحدث أي تغيير في موضع السطح على مدى الفاصل الزمني لمدة خمس دقائق، تشغيل إعدادات النقش واستخدام الليزر 488 نانومتر للتحقق من أن سطح الهيدروجيل لم يتحرك أثناء النقش. ثم قم بإزالة الهيدرجيل من المجهر، وقم بتبخر محلول PEG-633 من طبق بيتري، وشطف الطبق بـ PBS العقيمة المصفاة.

للحصول على خلية وصور علامة fiducial، والعودة طبق بيتري إلى حامل العينة لتحديد المناطق منقوشة. تحديد موقع خلية ذات أهمية والحصول على صورة منقولة أو فلورية من الخلية. ثم الحصول على Z-المكدس من مجموعة منقوشة تحت الخلية كما هو موضح، والحصول على مجموعة ثانية من الصور المرسلة أو الفلورية الخلية.

عند تجميع مجموعة صور، يجب أن تعرض الصور الناتجة مجموعة منتظمة من الميزات المنقوشة التي تتذبذب في شدتها كدالة لموضع Z داخل مجموعة الصور. التعقب m البرنامج النصي يوفر عدة صور التشخيص، بما في ذلك الإسقاط Z من علامات الفلورسنت فيدوسي لتقييم جودة المعالجة المسبقة، مؤامرة من المركزية المكتشفة، واللون مرمزة كدالة من موقف Z لتقييم جودة الكشف عن الكائن، ومؤامرة من المسارات التي تمثل تمركز علامة الكشف التي تم ربطها في أعمدة في الاتجاه Z لتقييم جودة تتبع الكائن.

يوفر البرنامج النصي 3D .M DISP مؤامرة من الكثافة كدالة للموقف Z لكل عمود من الميزات المكتشفة في مجموعة صور معينة لتقييم جودة التشكيلات كثافة علامة fiducial. كلا DISP 3D.

م و DISP القص. m معا توفير المدرجات البيانية للضوضاء النزوح قياس في كل من الأبعاد الإحداثية الديكارتية فضلا عن الخرائط الحرارية المستقَدّلة من النزوح. وبالإضافة إلى ذلك، final3D_2 تداخل.

m يوفر خرائط الحرارة من الجر السطح تحسب باستخدام التعليمات البرمجية الاستعانة بمصادر خارجية. أهم شيء يجب تذكره أثناء هذا الإجراء هو أن الحلول التي تحتوي على LAP حساسة للضوء ويجب أن تكون محمية قدر الإمكان من مصادر الضوء المحيط. تذكر أن NVP هو مركب عضوي متطاير ويجب التعامل معه دائمًا في غطاء للتدفق الكيميائي.