منصة مختبر علي القرص المضغوط لتوليد خزان ثلاثي الابعاد متعدد الخلايا

يمكن استخدام هذه التقنية لتوليد الخلايا من الخلايا الفردية وأنواع متعددة من الخلايا باستخدام نظام أساسي مختبر على قرص مضغوط ، وهو نظام رائد للجيل السريع من الزفيرويدات. تستخدم هذه التقنية قوة الطرد المركزي لإيداع الخلايا في الwell الدقيقة المعينة ، مما يسمح بالغبطة المتتالية لأنواع الخلايا المتعددة لإنتاج الcroheroids المتنوعة. لCMS الثقافة رقاقة التصنيع ، أولا جعل قوالب البولي لطبقات أعلى وأسفل من رقاقة الثقافة عن طريق الكمبيوتر التحكم العددي الآلات.

المقبل مزيج قاعدة PDMS وعامل علاج PDMS بنسبة 10 إلى واحد لمدة خمس دقائق قبل وضع الخليط في مجفف لمدة ساعة واحدة لإزالة فقاعات الهواء. صب خليط دياوسد بي إم اس في قوالب رقاقة ثقافة CMS، ووضع القوالب في مجفف لمدة ساعة واحدة أكثر لإزالة أي فقاعات الهواء. في نهاية إزالة الغاز الثاني ، علاج الخليط في غرفة الحرارة في 80 درجة مئوية لمدة ساعتين قبل وضع رقائق في مكنسة البلازما المكنسى مع الأسطح التي يتعين المستعبدين التي تواجه ما يصل.

يعرض رقائق الثقافة إلى البلازما بمساعدة الهواء بقوة 18 واط لمدة 30 ثانية ، وسندات طبقتين من الرقاقة في غرفة الحرارة عند 80 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة لزيادة قوة التصاق. ثم تعقيم شريحة ثقافة CMS في الأوتوكلاف عند درجة 121 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. لتحضير الخلايا لتشكيل الزفير، اذيب قارورة من ملليلتر تحتوي على خمس إلى 10 مرات 10 إلى الخلايا الخمس ذات الأهمية في حمام مائي 36.5 درجة مئوية لمدة دقيقتين قبل إضافة ملليلتر واحد من DMEM إلى الخلايا مع خلط لطيف.

بعد ذلك إضافة الخلايا إلى طبق بيتري قطره 150 ملليمترًا يحتوي على 15 ملليلترًا من متوسط 36.5 درجة مئوية ، ووضع الطبق في حاضنة لثقافة الخلية لمدة 24 ساعة. في اليوم التالي، استبدل المابير بـ 15 ملليلتر من DMEM الطازجة، ثم أعد الخلايا إلى الحاضنة. لفصل الخلايا، وخلق ثقافة مع أربعة ملليلتر من التربسين لمدة أربع دقائق في 36.5 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون، ووقف التفاعل مع المتوسطة الطازجة عندما رفعت الخلايا من الجزء السفلي من الطبق.

لتسمية الخلايا، تسخين صبغة فلورية الخلايا المناسبة لدرجة حرارة الغرفة قبل إضافة 20 ميكرولترات من أكسيد ثنائي الفينيل اللاهيدروين إلى القارورة للحصول على محلول ملليمتر واحد. تخفيف الفلور إلى تركيز العمل النهائي من مجهر واحد في DMEM، وإضافة صبغة إلى تعليق الخلية من الفائدة مع خلط لطيف. ثم ضع الخلايا في حاضنة ثقافة الخلية لمدة 20 دقيقة.

لتكوين أحادية الزراعة spheroid، أولا إضافة 2.5 ملليلتر من 4٪ بلورونيك F-127 حل لثقب مدخل شريحة ثقافة CMS أثناء تدوير الشريحة في 500 إلى 1، 000 التناوب في الدقيقة الواحدة. عندما تم إضافة كل من الحل، تدوير رقاقة في 4، 000 دوران في الدقيقة لمدة ثلاث دقائق باستخدام نظام CMS. في نهاية التناوب، احتضان رقاقة الثقافة بين عشية وضحاها في 36.5 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد الكربون.

في صباح اليوم التالي، وإزالة حل Pluronic، وغسل رقاقة الثقافة مع DMEM. بعد تجفيف الشريحة لمدة 12 ساعة على مقعد نظيف، أضف 2.5 ملليلتر من المتوسط إلى منفذ المدخل، وتناوب الشريحة على 4000 دوران في الدقيقة لمدة ثلاث دقائق. في نهاية التناوب، استبدال 100 ميكرولترات من المتوسطة في منفذ مدخل مع 100 ميكرولترات من تعليق الخلية المعدة في حين أن رقاقة تدور في 500 إلى 1، 000 التناوب في الدقيقة الواحدة.

ثم تدوير رقاقة في 3،000 التناوب في الدقيقة لمدة ثلاث دقائق لاعتراض الخلايا في كل microwell بالقوة الطرد المركزي قبل وضع رقاقة في خلية الحاضنة ثقافة لمدة ثلاثة أيام، منعش المتوسطة كما هو موضح كل يوم. لتوليد coheroid coheroid متحدة المركز، إضافة السكان الأولى من الخلايا في 100 ميكرولتردات المتوسطة إلى منفذ مدخل من رقاقة في حين أن رقاقة تدور في 500 إلى 1، 000 التناوب في الدقيقة تليها ثلاث دقائق من التناوب في 3، 000 التناوب في الدقيقة الواحدة. في نهاية التناوب، إضافة 100 ميكرولترات من السكان الخلية الثانية في حين أن رقاقة تدور في 500 إلى 1، 000 التناوب في الدقيقة الواحدة، وتدوير رقاقة في 3، 000 التناوب في الدقيقة الواحدة لمدة ثلاث دقائق أخرى.

عندما تم حقن كل من وحدات التخزين من الخلايا، ضع الرقاقة في حاضنة ثقافة الخلية في 1، 000 إلى 2، 000 تناوب في الدقيقة لمدة 24 ساعة. لتشكيل يانوس spheroid، إضافة 100 ميكرولترات من السكان الأولى من الخلايا في حين أن رقاقة تدور في 500 إلى 1،000 التناوب في الدقيقة تليها ثلاث دقائق في 3،000 التناوب في الدقيقة الواحدة. في نهاية التناوب، ضع الرقاقة في حاضنة ثقافة الخلية للتناوب عند 1000 إلى 2000 دوران في الدقيقة لمدة ثلاث ساعات.

في نهاية الحضانة، إضافة 100 ميكرولترات من السكان الثاني من الخلايا في حين أن رقاقة تدور في 500 إلى 1، 000 التناوب في الدقيقة قبل تدوير رقاقة في 3، 000 التناوب في الدقيقة لمدة ثلاث دقائق. ثم ضع الخلايا في حاضنة ثقافة الخلية في 1، 000 إلى 2، 000 دوران في الدقيقة لمدة 24 ساعة. لتشكيل spheroid شطيرة، أولا إضافة 100 ميكرولترات من السكان الخلية الأولى في حين أن رقاقة هو الدورية في 500 إلى 1، 000 التناوب في الدقيقة تليها ثلاث دقائق من التناوب في 3، 000 التناوب في الدقيقة الواحدة.

في نهاية التناوب، ضع الرقاقة على دوار في حاضنة ثقافة الخلية لمدة ساعتين في 1،000 إلى 2،000 التناوب في الدقيقة الواحدة قبل إضافة 100 ميكرولترات من السكان الثاني من الخلايا في حين أن رقاقة تدور في 500 إلى 1،000 التناوب في الدقيقة الواحدة. قم بتدوير الشريحة في 3000 دورة في الدقيقة لمدة ثلاث دقائق، ثم ضع الرقاقة مرة أخرى في الحاضنة لمدة ثلاث ساعات مع التناوب. ثم إضافة 100 ميكرولترات إضافية من السكان الخلية الأولى في حين أن رقاقة تدور في 500 إلى 1،000 التناوب في الدقيقة الواحدة، وتدوير والثقافة الخلايا كما أظهرت فقط لمدة 12 ساعة.

بعد البروتوكول كما هو موضح، يمكن أن تكون رقاقة ثقافة CMS قطرها ستة سنتيمترات ملفقة بنجاح. قناة شريحة ثقافة CMS تضم منفذ مدخل، والمناطق المركزية، والشرائح، وmicrowell. صور الفاصل الزمني من نوعين من ثقافة الخلية التي اتخذت في 2، 000 التناوب في الدقيقة الأولى 24 ساعة من الثقافة داخل شرائح CMS الفردية، كما هو مبين، تظهر التكوين الناجح للpheroids.

التصوير من microwells بعد ثلاثة أيام من الثقافة تبين أن الزفيرويدات تظهر التوحيد ممتازة والزخرة. يمكن أيضاً إنشاء الـ"ثرثرة" مع بنيات الخنتريك و Janus وساندويتش. وبالإضافة إلى ذلك، فإن الثقافات الخلية المعرضة لجاذبية عالية لمدة سبعة أيام، تليها تلطيخ حية / ميتة، تثبت أن معظم الخلايا البقاء على قيد الحياة على المدى الطويل الثقافة داخل رقائق.

يجب أن تكون الطبقات العليا والسفلى من شريحة ثقافة CMS محاذية بعناية عندما تكون مستعبدة ، وإلا فإن عدد الخلايا في كل ميكروويل قد لا يكون متساويا. يمكن لهذه الدراسة أن تخفض حاجز الدخول لأبحاث الاستزراع النخاعي ويمكن استخدامها على نطاق واسع في دراسات الاستزراع المشترك ، على سبيل المثال ، لفحص الأدوية الجديدة ذات الاهتمام.