المجهر الجر المتكاملة مع ميكروفلويديكس للهجرة الجماعية الكيميائية
أكتوبر 13, 2019
وغالبا ما تسترشد هجره الخلايا الجماعية في التنمية ، والتئام الجروح ، وورم خبيث السرطان من التدرجات من عوامل النمو أو الجزيئات الإشارات. وصف هنا هو نظام تجريبي الجمع بين المجهر الجر مع نظام ميكروفلويدريك ودليلا علي كيفيه قياس أليات الهجرة الجماعية تحت التدرج البيوكيميائية.
وغالبا ما تسترشد الهجرة الجماعية الخلية من قبل التدرج من جزيئات الإشارة. في هذا الفيديو، نُظهر كيفية قياس القوى الخلوية خلال الهجرة الجماعية مسترشدة بالتدرج الكيميائي الحيوي. لذلك، نحن دمج رقاقة microfluidic مع مجهر الجر، ثم نستخدم رقاقة microfluidic لتوليد التدرج البيوكيميائي، ونستخدم المجهر الجر لقياس القوة الخلوية.
الدكتور هوانسيوك جانغ، بعد غراد في مختبري، سوف تظهر الإجراء. إعداد حل PDMS عن طريق خلط عامل مِعَد القاعدة و العامل العلاجي بنسبة عشرة إلى واحد. ضع 15 ملليلتر من مليسومر القاعدة في أنبوب مخروطي 50 ملليلتر ، وأضف 1.5 ملليلتر من عامل المعالجة.
إعداد اثنين من هذه الأنابيب. دوامة خليط PDMS لمدة خمس دقائق قبل الطرد المركزي في 196 ز الوقت لمدة دقيقة واحدة لإزالة فقاعات. لتصنيع استنسل PDMS، صب ما يقرب من ملليلتر من خليط PDMS على رقاقة مع تجنب المناطق SU-8 منقوشة بحيث تلامس PDMS جانب أعمدة SU-8 ولكن ليس الجزء العلوي من نمط SU-8.
ضع الرقاقة على سطح مستو لأكثر من 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، ثم عالج جهاز PDMS في فرن جاف عند 80 درجة مئوية لأكثر من ساعتين. قشر بعناية قبالة PDMS من قالب SU-8، وتقليم غشاء PDMS رقيقة باستخدام لكمة جوفاء 14 ملليمتر. قم بإزالة الغبار على سطح قطع PDMS باستخدام الشريط اللاصق قبل التكlaving في استنسل PDMS.
لتصنيع قناة مجهرية PDMS ، صب ما يقرب من 30 ملليلتر من خليط PDMS على قالب SU-8. ديغا لمدة 30 دقيقة في غرفة فراغ، ومن ثم علاج PDMS في فرن جاف في 80 درجة مئوية لأكثر من ساعتين. قشر بعناية قبالة PDMS من قالب SU-8، وقطع PDMS إلى حجم 24 ملليمترا من 24 ملليمتر.
في كل كتلة PDMS، إنشاء منفذ واحد وثلاثة مداخل باستخدام لكمة خزعة ملليمتر واحد. تصنيع وsilanize الشرائح الزجاجية كما هو موضح في بروتوكول النص. تغطية السطح ذو الحواف من الزجاج السفلي مع 100 ميكرولترات من حل ربط سيلاني.
بعد ترك الزجاج في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة ، شطف الزجاج ثلاث مرات بالماء غير المؤين. ثم اسمحوا الزجاج الجاف في درجة حرارة الهواء المحيط أو عن طريق تهب الهواء المضغوط. إعداد حل هلام polyacrylamide كما هو موضح في بروتوكول النص.
ثم نقل ل10 ميكرولترات من حل هلام مختلطة على microwell مستطيلة ووضع زلة غطاء دائري على القمة. إصلاح الجمعية من الزجاج المخصص، حل هلام، وزلة غطاء على غلاف لوحة ستة جيدا مع شريط لزجة والوجه عليه. ثم الطرد المركزي لمدة 10 دقائق في 96 مرات ز لجلب جزيئات الفلورسنت إلى الطبقة العليا من هلام بوليكريلاميد.
إزالة التجميع من جهاز الطرد المركزي ووضعها على سطح مستو مع زلة الغطاء متجهة إلى أسفل. بعد 30 دقيقة، الوجه التجمع ووضعها في طبق بيتري 35 ملليمتر. ملء الطبق مع مليلتر اثنين من المياه الأيونية.
باستخدام ملقط، قم بإزالة زلة الغطاء بلطف عن طريق تحريكها إلى جانب واحد. لرمز الكولاجين على هلام البولي أكريلاميد، حل مليغرام واحد لكل ملليلتر sulfo-SANPAH في عازلة HEPES 50 ملليمترا الحارة. إسقاط 200 ميكرولترات من الحل على سطح هلام وتنشيطها عن طريق ضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة 10 دقيقة.
بعد تنشيط الأشعة فوق البنفسجية، شطف هلام مرتين مع 0.1 مولا HEPES العازلة، ومن ثم مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني. رمز هلام البولي أكريلاميد مع محلول الكولاجين في أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها. في اليوم التالي، غسل الجل ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني.
انغمس في استنسل PDMS المُتَوَغَل في حل F-127. احتفظ بها في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. اغسل استنسل PDMS مع PBS ثلاث مرات ، وازيل السائل من كل من استنسل PDMS وجل polyacrylamide.
ثم ضع استنسل PDMS على هلام البولي أكريلاميد، وأضف برنامج تلفزيوني إلى الاستنسل. إزالة فقاعات في ثقوب الاستنسل PDMS عن طريق الأنابيب بلطف. بعد إزالة الفقاعات، مسح برنامج تلفزيوني من سطح استنسل PDMS.
الآن إضافة 200 ميكرولترات من حل الخلية على استنسل PDMS ووضع الجل في حاضنة لمدة ساعة واحدة بحيث تعلق الخلايا على هلام polyacrylamide. بعد الحضانة، وغسل بلطف قبالة حل الخلية مع وسائل الإعلام ثقافة الخلية وإضافة المزيد من وسائل الإعلام ثقافة الخلية. إزالة الاستنسل PDMS، والتحقق من تشكيل الجزر الخلية تحت المجهر.
بعد ذلك، علاج سطح القناة الدقيقة PDMS مع بلازما الأكسجين لمدة 30 ثانية. بعد إزالة أي سائل على الزجاج السفلي المليء بالجل، ضع القناة الدقيقة PDMS فوق الزجاج السفلي، ووضع الجمعية على حامل الزجاج المخصص. تعبئة القناة الصغيرة مع خلية ثقافة المتوسطة.
لتحضير أنابيب مدخل نظام microfluidic المتكاملة، قم بتوصيل إبرة مشذبة وخط حجم صغير 30 سنتيمتر مع stopcock ثلاثية الاتجاه. إعداد ثلاثة من هذه الترتيبات. بالنسبة لموابيب المنفذ، قم بتوصيل إبرة مشذبة وخط حجم صغير طوله 75 سنتيمترًا مع stopcock ثلاثي الاتجاه.
تعبئة خطوط الأنابيب مع الوسيطة التي تم تسخينها مسبقاً لمدة ساعة واحدة. إعداد الخزانات عن طريق إزالة المكبس من المحاقن وربط خطوط أنابيب المدخل. قم بتوصيل موصلات الإبر لكل خط أنابيب في المداخل الثلاثة ومأخذ واحد من الجهاز microfluidic.
املأ كل خزان بثلاثة ملليلترات من المتوسط الطازج أو المتوسط المُشروط. بالنسبة لاختبار التدرج، املأ خزان المدخل الأيسر بـ 20 نانوغرام لكل ملليلتر معامل نمو كبدي، أو HGF، في وسط ثقافة الخلية. للتصور من التدرج التركيز، إضافة 200 ميكروغرام لكل ملليلتر من صبغة الفلورسنت إلى خزان مدخل اليسار.
قم بتوصيل خط أنابيب المنفذ بمضخة حقنة. ضع نظام microfluidic المتكامل على خشبة المسرح من المجهر الظهارة التقليدية. التقط الصور كل 10 دقائق لمدة تصل إلى 24 ساعة باستخدام مجهر آلي في حاضنة.
في كل نقطة زمنية، خذ مجموعة من الصور باستخدام عدسة هدف 4X في ثلاث قنوات مختلفة، بما في ذلك صورة المرحلة لتصور هجرة الخلايا، وصورة فلورية خضراء لتصور الخرز الفلورسنت المدمج في الجل، وصورة فلورية حمراء لتصور تدرج تركيز المادة الكيميائية. بعد أخذ الصور الفاصل الزمني، ضخ 0.25٪ تريبسين-EDTA حل في القنوات الدقيقة لفصل الخلايا من هلام بوليكريلاميد. عند إزالة الخلايا من الجل تمامًا ، خذ صورة فلورسنت خضراء لاستخدامها كصورة مرجعية للمجهر الجر.
تابع تحليل البيانات كما هو موضح في بروتوكول النص. لقياس قوة الانقبال والإجهاد بين الخلايا، تم الجمع بين المجهر الجر والمجهر الإجهاد أحادي الطبقات مع قناة microfluidic. وقد رسمت الخرائط في تنسيق الراديو مع الجر الخارجي باستخدام اللون الدافئ والجر إلى الداخل باستخدام اللون البارد.
في الوقت صفر، وأظهرت جميع الجزر توزيعات الجر مماثلة مع الجر الداخلي قوية على الحافة وتقلبات داخل الجزيرة. بعد 10 ساعات من تطبيق التدرج HGF، في حين كانت درجة توسع الجزيرة مختلفة في كل عمود، كانت توزيعات الجر مشابهة إلى حد كبير إلى الصفر الوقت. ولم يتغير متوسط الجر لمدة 10 ساعات.
عند حساب الإجهاد أحادية الطبقة، ومع ذلك، أظهر كل عمود اتجاهات مختلفة. حيث كان تركيز HGF منخفضًا ، تم الحفاظ على متوسط التوتر داخل الجزر حوالي 200 باسكال خلال فترة 10 ساعات. حيث كان تركيز HGF مرتفعًا ، انخفض متوسط التوتر داخل الجزر تدريجيًا من 230 باسكال إلى 100 باسكال على مدار 10 ساعات ، كما هو موضح سابقًا.
حيث كان تركيز HGF مرتفعًا على النصف الأيسر ومنخفضًا في النصف الأيمن من الجزيرة ، تم الحفاظ على متوسط التوتر حول 150 باسكال. ملء قناة microfluidic يجب أن يكون لطيف. من المهم إزالة فقاعات المحاصرين في القناة في حين لا تعطيل في وقت واحد الجزر الخلية الأم الصغيرة.
باستخدام هذا النظام المتكامل، يمكن للمرء أن التحقيق في كيفية استجابة جماعية الخلية ميكانيكيا لمختلف التدرجات الكيميائية، مثل جذب المواد الكيميائية أو عوامل النمو. وستساعدنا هذه المنصة على مواصلة استكشاف آليات هجرة الخلايا الجماعية تحت التدرجات الكيميائية، والتي هي المفتاح لفهم التجديد، وانبثاث السرطان، والتنمية.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
النظرة العامة
تناقش هذه المقالة آليات الهجرة الجماعية للخلايا، التي تتأثر بالتدرجات الكيميائية الحيوية. يدمج النظام التجريبي بين فحص الشد مع إعداد مجهري سائل لتحديد القوى الخلوية أثناء هذه العملية.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلوم
- بيولوجيا الخلية
- الفيزياء الحيوية
- التدفق المجهري
الخلفية
- الهجرة الجماعية للخلايا حاسمة في العديد من العمليات البيولوجية.
- إنها موجهة بتدرجات من الجزيئات المرسالة.
- فهم الميكانيكا يمكن أن يساعد في توفير رؤى حول التطور والمرض.
- تستخدم هذه الدراسة تقنيات متقدمة لقياس القوى الخلوية.
هدف الدراسة
- لتحديد القوى الخلوية أثناء الهجرة الجماعية.
- لإظهار دمج فحص الشد والتدفق المجهري.
- لدراسة تأثيرات التدرجات الكيميائية الحيوية على حركة الخلايا.
الطرق المستخدمة
- دمج شريحة تدفق مجهري مع فحص الشد.
- توليد تدرجات كيميائية حيويّة باستخدام نظام التدفق المجهري.
- قياس القوى الخلوية أثناء الهجرة.
- تحضير محلول PDMS لتصنيع شريحة التدفق المجهري.
النتائج الرئيسية
- تبيين ناجح للإعداد التجريبي.
- تحديد القوى الخلوية تحت التدرجات الكيميائية الحيويّة.
- رؤى حول ميكانيكا الهجرة الجماعية للخلايا.
- تطبيقات محتملة في فهم التئام الجروح وانتشار السرطان.
الاستنتاجات
- توفر الدراسة نهجًا جديدًا لتحديد ميكانيكا الخلايا.
- تسلط الضوء على أهمية التدرجات الكيميائية الحيويّة في هجرة الخلايا.
- يمكن أن يعتمد البحث المستقبلي على هذه النتائج لاستكشاف التطبيقات العلاجية.
الأسئلة المتداولة
Executive Industry Relevance
Understanding how chemical gradients influence collective cell migration provides critical insights into cancer metastasis and tissue regeneration. This integrated microfluidic-traction microscopy system enables quantitative assessment of intercellular forces and traction dynamics under controlled biochemical gradients, supporting mechanistic de-risking in target validation for anti-metastatic therapies. The platform offers a reproducible, scalable approach to evaluate how growth factor gradients alter collective cell behavior, informing early discovery decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by linking HGF gradient exposure to changes in intercellular stress and collective migration patterns.
- Operational Value: Enables functional target validation by quantifying how HGF signaling modulates monolayer tension and cell-cell coordination in MDCK islands.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying whether a target influences collective migration mechanics, a key determinant in metastasis potential.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems (micropatterned MDCK islands) for downstream compound screening under gradient conditions.
- Reproducibility: Standardizes microfluidic gradient generation and traction measurement, ensuring consistent quantitative outputs across experiments.
- Scalability: Supports platform reuse for testing multiple growth factors or inhibitors in a controlled microenvironment.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models chemotactic collective migration relevant to wound healing and cancer metastasis, aligning with translational biomarker strategies.
- Preclinical Continuity: Bridges discovery-phase mechanistic insights with preclinical validation by quantifying force changes that predict invasive potential.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports go/no-go decisions by revealing whether a compound reduces HGF-driven intercellular stress disruption in collective migration.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification, providing mechanistic insights that inform preclinical continuity in metastasis-related programs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by quantifying how biochemical gradients alter intercellular stress and collective migration in epithelial cell islands.
- Screening: Enables assay-ready, reproducible systems for evaluating compound effects on traction and stress dynamics under controlled HGF gradients.
- Analytics: Generates quantitative traction and monolayer stress maps that allow teams to compare force distributions across gradient conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by modeling collective migration mechanics relevant to metastasis and regeneration.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for testing multiple chemotactic stimuli across different cell types and disease models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in how growth factors regulate collective cell migration.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility through integrated microfluidic gradient control and traction microscopy readouts.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of targets involved in metastasis pathways.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted prioritization by identifying compounds that normalize intercellular stress in chemotactic collective migration.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidic device fabrication, PDMS handling, and traction microscopy data analysis.
- Depends on access to fluorescent microscopy, UV activation systems, and controlled incubators for long-term time-lapse imaging.
- Necessitates cross-team standardization of gradient preparation, gel coating, and cell seeding protocols to ensure reproducibility.
- Involves adaptation considerations when extending the system to other cell types or extracellular matrix proteins beyond collagen-coated polyacrylamide gels.
- Includes practical limitations such as the need for careful bubble removal in microfluidic channels and gentle medium exchange to avoid disrupting micropatterned cell islands.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:47
Fabrication of Polydimethylsiloxane (PDMS) Stencil and Microchannel
2:39
Preparation of Bottom Glass with Polyacrylamide (PA) Gel
4:41
Micropatterning of Cell Islands and Assembly of PA Gel with PDMS Microchannel
6:14
Integrated Microfluidic System
7:32
Image Acquisition
8:27
Results: Mechanical Interactions of MDCK Cell Islands
9:55
Conclusion
