قياس اثار البكتيريا والمواد الكيميائية علي نفاذيه المعوية من اليجان

هذه الطريقة سوف تكون مفيدة للدراسات البيولوجية الأساسية المتعلقة بالتفاعل بين الميكروبات المعوية وصحة الأمعاء. بالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام هذا البروتوكول لفحص البروبيوتيك المحتملة وnutraceuticals لعلاج المشاكل الصحية المعوية، مثل متلازمة الأمعاء راشح وأمراض الأمعاء الالتهابية. يستخدم هذا البروتوكول نظام تصوير عالي الإنتاجية لتمكين التحليل الكمي السريع والدقيق للنفاذية المعوية في C.elegans المعالج بالبكتيريا والمواد الكيميائية المختلفة.

نوصي بأن يقوم عالم غير مطلع على هذه التقنية بالحد من عدد العينات لتجنب الأخطاء المضللة وغيرها من الأخطاء. يتكون هذا الإجراء من العديد من الخطوات التي تتطلب عرض مرئي، مثل نقل الديدان إلى 96-آبار واستخدام آلة أوبريت، فضلا عن برنامج الوئام. ابدأ بإعداد 500 ملليلتر من متوسط LB العقيم.

تلقيح مستعمرة واحدة من P.aeruginosa في الوسط، واحتضان الثقافة لمدة 14 إلى 15 ساعة في 37 درجة مئوية في حين تهتز في 150 دورة في الدقيقة. وفي اليوم التالي، يتم توزيع الثقافة البكتيرية بالتساوي في أنبوبين سعة 500 ملليلتر، والطرد المركزي عند 3، 220 مرة ز وأربع درجات مئوية لمدة 30 دقيقة. إزالة ناظر، وترك 25 ملليلتر في كل أنبوب، لحجم ما مجموعه 50 ملليلتر المتبقية، ثم إعادة تعليق بيليه البكتيريا.

تخزين ثقافة البكتيريا في أربع درجات مئوية حتى جاهزة للاستخدام. لاختبار آثار البكتيريا على نفاذية الأمعاء من C.elegans، وإزالة الثقافات من الثلاجة، ودوامة بدقة لهم. أضف ما مجموعه 800 ميكرولترات إلى كل لوحة NGM جديدة، والسماح للألواح لتجف في حاضنة 20 درجة مئوية بين عشية وضحاها.

لإعداد لوحات DIM، أضف 50 ملليلتر من اغر متوسط NGM في زجاجة من DIM تحتوي على مرق NGM، واخلط جيدا. ثم، صب 20 ملليلتر من المتوسط في كل طبق بيتري 90 في 15 ملليمتر. إعداد لوحات DMSO بإضافة 20 ملليلتر من DMSO تحتوي على متوسطة NGM لكل طبق بيتري، وترك لوحات في درجة حرارة الغرفة لمدة ثلاث ساعات على الأقل لترسيخ.

نشر 800 ميكرولتر من E.coli دوامة أو P.aeruginosa الثقافة على كل لوحة NGM الطازجة، والسماح لوحات لتجف في حاضنة 20 درجة مئوية بين عشية وضحاها. اغسل يرقات L4 المتزامنة بالعمر مع S-buffer، ونقل ما يقرب من 500 ديدان إلى لوحات NGM التي تحتوي على بكتيريا وكيميائيات مختلفة. ثم، احتضان لوحات في 20 درجة مئوية لمدة 48 ساعة.

إعداد لوحات فيتC-دكستران الملحقة عن طريق خلط مليلترين من الإشريكية القولونية المعطلة للحرارة مع أربعة ملليغرام من FITC-dextran. إضافة 100 ميكرولترات من الخليط إلى كل من 20 لوحات اجار NGM الطازجة، والسماح للألواح لتجف لمدة ساعة واحدة على مقعد مختبر نظيفة. بعد 48 ساعة من العلاج، قم بغسل الديدان بمخزن S- buffer، ونقلها إلى لوحات الملحقة بـ FITC-dextran وإلى لوحات NGM بدون FITC-dextran، واحتضان اللوحات بين عشية وضحاها.

في اليوم التالي، وغسل الديدان مع S-العازلة، والسماح لهم الزحف في لوحة NGM أجار الطازجة لمدة ساعة واحدة. إضافة 50 ميكرولترات من 4٪ الفورمالديهايد إلى كل بئر من لوحة سوداء، 96-جيدا، مسطحة القاع، ونقل ما يقرب من 50 الديدان في كل بئر. بعد دقيقة إلى دقيقتين، وإزالة جميع الفورمالديهايد، وإضافة 100 ميكرولترات من تصاعد المتوسطة في كل بئر.

الفورمالديهايد مادة كيميائية سامة وينبغي التعامل معها بعناية. لالتقاط صور الفلورسنت، اضغط على أيقونة Open Lid داخل برنامج التصوير، ثم أدخل اللوحة في الجهاز. انقر فوق الإعداد، وحدد نوع اللوحة، ثم أضف قنوات brightfield و EGFP.

لضبط التخطيط، انتقل إلى تحديد التخطيط، وحدد المسار. تعيين الصورة الأولى في ميكرومتر واحد، وعدد من الطائرات إلى 10، والمسافة إلى ميكرومتر واحد. حدد أحد آبار المعالجة و حقل التقاط واحد، واضغط على اختبار في قسم تجربة التشغيل.

إذا كانت الصور مرضية، ارجع إلى قسم الإعداد، واضغط على الرمز إعادة تعيين. ثم، حدد جميع الآبار المستهدفة وعدد مناسب من الحقول الالتقاط. انتقل إلى تشغيل التجربة، وأدخل اسم اللوحة، واضغط على ابدأ.

لقياس كثافة الفلوريس، انتقل إلى قسم تحليل الصور، أدخل الصورة، واعثر على الخلية عن طريق اختيار قناة EGFP وطريقة B.Adjust المعلمات وفقًا لاتجاهات المخطوطة، واختر المتوسط كخرج. اضغط على أيقونة تطبيق لحفظ الإعداد. الحصول على خريطة الحرارة وجدول البيانات عن طريق الذهاب إلى قسم التقييم وضبط المعلمة القراءة، ثم ابدأ التقييم.

وأظهرت C.elegans زيادة كبيرة في فلورية فيتك-دكستران بعد الحضانة مع P.aeruginosa مقارنة مع اثنين من سلالات بكتيرية أخرى, مشيرا إلى أن P.aeruginosa تسبب في أضرار أكثر حيوية لحاجز الأمعاء الظهارية وزيادة نفاذية الأمعاء. أدى بث P.aeruginosa المباشر والمبطل للحرارة إلى تأثيرات مختلفة جدًا على نفاذية الأمعاء في C.elegans. عند تعطيل الحرارة، كل من الصور الفلورية والبيانات الإحصائية تشير إلى أن P.aeruginosa لم تؤدي إلى أي سمية للنيماتودا.

48 ساعة في العلاج المشترك مع خافت انخفضت بشكل كبير فيتC-دكستران fluorescence كثافة داخل أحشاء الديدان المعرضة لP.aeruginosa, مما يدل على أن DIM يمكن اعتبار منتج طبيعي جيد لعلاج خلل نفاذية الأمعاء الناجمة عن الالتهابات البكتيرية. من المهم أن نتذكر أنه أثناء إعداد لوحات FITC-dextran المغلفة، تحتاج إلى تقليل التعرض للضوء بسبب حساسية الضوء من FITC-dextran. يمكن استخدام هذه التقنية لتحديد الآثار المسببة للأمراض والبروبيوتي من البكتيريا المعوية ومكوناتها النشطة عن طريق اختبار البكتيريا, فضلا عن تكوينها الكيميائي.