في المختبر تقييم وظيفة القلب باستخدام خلايا القلب skinned

تتيح هذه التقنية توضيح الفيزيولوجيا المرضية لأمراض القلب من خلال التحقيق في العلاقة بين المعلمات في المختبر وفي الجسم الحي في النماذج الحيوانية والبشر. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح بدراسة وظيفة الشعيرات العضلية العميقة باستخدام خزعات صغيرة جدا أو عينات تم تخزينها مجمدة. تسمح هذه التقنية بتقييم تأثير التدخلات العلاجية في المختبر على الخيوط العضلية.

قبل محاولة التجربة ، ينصح بممارسة استخراج خلايا عضلة القلب عدة مرات لتعلم كيفية اختيار خلايا عضلة القلب ولصقها وتنشيطها بحجم وخط وشكل جيد. قبل البدء في الإجراء ، اضبط درجة حرارة جهاز الاختبار في الغرفة إلى 15 درجة مئوية وقم بتشغيل محول القوة والمحرك. قم بإذابة ثلاثة إلى خمسة ميكروغرامات من عينة عضلة القلب في طبق بتري يحتوي على 2.5 مل من محلول ISO الاسترخاء واستخدم مشرطا لتقطيع الأنسجة بدقة إلى قطع صغيرة دون التسبب في تلف غير ضروري للخلايا.

عندما يتم قطع كل الأنسجة، استخدم طرف ماصة مقطوع لنقل الحجم الكامل للمحلول وشظايا الأنسجة إلى زجاج Potter-Elvehjem واستخدم مطحنة لتعطيل الأنسجة ميكانيكيا بمعدل 30 إلى 40 دورة في الدقيقة. عندما يتم الحصول على تعليق خلوي جيد ، أضف 250 ميكرولترا من Triton إلى أنبوب سعة 15 مليلتر يحتوي على 2.25 مل من ISO الاسترخاء وأضف تعليق الخلية إلى المحلول الناتج. اقلب الأنبوب برفق ثلاث مرات للخلط واترك الأنبوب في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقة واحدة ، متبوعا بحضانة لمدة أربع دقائق على الجليد.

في نهاية حضانة الجليد ، قم بإحضار الحجم النهائي للأنبوب حتى 15 مل مع ISO إضافي للاسترخاء واخلط الأنابيب ثلاث مرات عن طريق الانعكاس كما هو موضح ، ثم قم بالطرد المركزي للخلايا ، ثم قم بإزالة جميع السوائل تقريبا باستثناء آخر ثلاثة ملليلتر من المادة الطافية. بعد الغسيل الأخير ، قم بإزالة المادة الطافية حتى حجم خمسة إلى 10 ملليلتر من تعليق الخلية. لاختيار خلايا عضلة القلب ذات الجلد ، أضف قطرة من تعليق الخلية على غطاء يوضع فوق شريحة زجاجية في حامل منزلق مجهر مقلوب واستخدم هدف 20X لتحديد خلية عضلة القلب على شكل قضيب واحد بنمط وحجم مخطط جيد.

استخدم يديك لتدوير الغطاء حتى يتم وضع خلية عضلة القلب المحددة أفقيا مع محاذاة نهاياتها مع إبرة محول القوة والمحرك واستخدم طرف ماصة لوضع خط رفيع من الغراء على طول جانب الغطاء. للصق الخلية في مكانها ، اغمر أطراف الإبرة لمحول القوة والمحرك في خط الغراء لإنشاء هالة غراء حول كلا الطرفين وتحريك طرف الإبرة لمحول القوة بسرعة لأسفل بحيث يلتصق بحافة واحدة من عضلة القلب. كرر هذا الإجراء مع طرف المحرك والطرف الآخر من الخلية.

بعد خمس إلى ثماني دقائق ، حرك كلا المتلاعبين الدقيقين في وقت واحد لرفع الإبر حوالي 15 ميكرومتر لتجنب لصق الخلية على الغطاء. لقياس القوى النشطة والسلبية وحساسية الكالسيوم ، املأ البئر التجريبي الأول ب 55 إلى 100 ميكرولتر من محلول الاسترخاء واملأ البئر التجريبي الثاني ب 55 إلى 100 ميكرولتر من محلول التنشيط. باستخدام برنامج الكاميرا ، قم بتعيين منطقة الاهتمام على منطقة من خلايا عضلة القلب بنمط واضح من التشقق واضبط طول قسيم عضلي على 2.2 ميكرومتر.

قم بقياس المسافة بين طرفي خلية عضلة القلب وسجل القيمة كطول الخلايا العضلية داخل البرنامج. بعد ذلك ، حرك الإبر أعلى قليلا وحرك مرحلة المجهر برفق بحيث تنتقل الخلية من الغطاء إلى البئر الذي يحتوي على محلول الاسترخاء في الجزء الخلفي من المسرح. حدد البروتوكول الذي يحتوي على تقصير خليتين ليحدث عندما تظهر الخلية بالتتابع في محاليل الكالسيوم والاسترخاء.

لاستنباط تقلص متساوي القياس ، حرك مرحلة المجهر بحيث ينتقل عضلة القلب من الاسترخاء إلى المحلول المنشط. عند الوصول إلى هضبة القوة ، ابدأ في تسجيل بيانات القوة. بعد 10 ثوان ، قم بتبديل الخلية إلى محلول الاسترخاء وسجل البيانات حتى يتوقف الاختبار.

لتحديد حساسية الكالسيوم ، استبدل محلول التنشيط ب 55 إلى 100 ميكرولتر من كل محلول كالسيوم وسجل البيانات كما هو موضح للتو. في نهاية القياس ، قم بتمديد أطراف محول القوة والمحرك لإزالة الإبر من الخلية واستخدم قطعة قطن مبللة بالأسيتون لإزالة هالة الغراء بعناية من أطراف الإبرة. على الرغم من توقع درجة معينة من التدهور وانخفاض القوة بعد التجارب المطولة ، إلا أن قيم التوتر النشط داخل خلايا عضلة القلب الوظيفية يجب أن تكون مستقرة نسبيا.

هنا ، يتم عرض آثار القوة التمثيلية لثلاثة من أصل ثمانية تسجيلات للقوة اللازمة لتنفيذ بروتوكول حساسية الكالسيوم للخيوط العضلى. عن طريق نقل الخلية إلى بئر تحتوي على محلول التنشيط ، تبدأ خلايا عضلة القلب في تطوير القوة حتى تصل إلى الهضبة. بعد اختبار الركود السريع ، يمكن الحصول على قيم خط الأساس للقوة الصفرية.

يمكن استخدام ميل الجزء الأخير من هذا المنحنى لتحديد قيمة معدل إعادة تطوير القوة ، وهو مقياس للمعدل الواضح لارتباط الجسر المتقاطع وانفصاله. بعد نقل الخلية مرة أخرى إلى بئر يحتوي على محلول الاسترخاء ، تسترخي الخلية وتنخفض قوتها. بالإضافة إلى حساسية الكالسيوم للخيوط العضلية وقياسات التنشيط المعتمدة على الطول ، يمكن حساب تبعيات طول القشة العضوية للتوتر السلبي وتبعيات طول قسيم الحمي للقوة المنشطة للكالسيوم لكل منطقة مقطعية والتوتر المستقل عن الكالسيوم.

أخيرا ، من المهم ملاحظة أن الطريقة التي يتم بها عزل خلايا عضلة القلب تؤثر بشكل كبير على النتائج. يعد استخدام خلايا عضلة القلب الجلدية لتقييم وظائف القلب في المختبر تقنية مهمة لتوضيح التغييرات التي تحدث على مستوى الخلية وكذلك لدراسة آليات الشعيرات العضلية في مختلف الحالات الفسيولوجية والمرضية. تتميز هذه الطريقة بأنها تتطلب كمية قليلة من عينة عضلة القلب والسماح باستخدام خلايا عضلة القلب من مجموعة واسعة من الأنواع ومواقع القلب والأمراض.