زيادة متانة مزارع الخلايا العصبية المنفصلة باستخدام مصفوفة المرجان النشطة بيولوجيا

تكمن أهمية هذا البروتوكول في أنه يوفر طريقة جديدة لزيادة متانة ونمو الخلايا العصبية والخلايا الدبقية والخلايا الجذعية في المختبر. كما أنه ينطبق على الخلايا الأخرى. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي استخدام مصفوفة مصنوعة من الهيكل العظمي المرجاني.

تغذي هذه المصفوفة الخلايا العصبية وتحميها وتعزز إعادة النمو. نظرا لكونه داعما للخلايا العصبية في المختبر ، فقد يعمل الهيكل العظمي المرجاني بشكل مشابه كغرسة متجددة في مواقع إصابات الدماغ. للبدء ، استخدم مطرقة لكسر الهيكل العظمي المرجاني ، وقسمه إلى 0.5 إلى شظايا من 0.5 إلى سنتيمترين.

من أجل إذابة المخلفات العضوية وغير العضوية ، نقع شظايا الهيكل العظمي المرجاني في محلول هيبوكلوريت الصوديوم بنسبة 10٪ لمدة 10 دقائق. ثم يغسل مرة واحدة بالماء المقطر المزدوج. لإزالة البقايا العضوية المتبقية ، انقع الأجزاء في محلول هيدروكسيد الصوديوم المولي لمدة خمس دقائق ، ثم اغسلها مرة واحدة بالماء المقطر المزدوج.

استمر في إزالة الرواسب العضوية عن طريق نقع الأجزاء في محلول بيروكسيد الهيدروجين بنسبة 30٪ لمدة 10 دقائق ، واغسل الشظايا ثلاث مرات بالماء المقطر المزدوج. قم بإزالة أكبر قدر ممكن من الماء المقطر المزدوج الزائد واترك شظايا المرجان في الغطاء حتى تجف. ثم قم بتنظيف زلات الغطاء الزجاجي عن طريق نقعها في 10 مل من 95٪ إيثانول في طبق بتري زجاجي 100 ملم.

بعد 15 دقيقة ، قم بإزالة الإيثانول واغسله بالماء المقطر المزدوج ثلاث مرات ، مع الانتظار لمدة 10 دقائق بين كل غسلة. قم بإزالة الماء المقطر المزدوج وضع الطبق على لوح تسخين مسخن مسبقا بدرجة حرارة 80 درجة مئوية. ثم حرك الغطاء برفق حتى يتبخر الماء المقطر المزدوج.

الأوتوكلاف زلات الغطاء. طحن شظايا الهيكل العظمي المرجاني باستخدام الهاون والمدقة حتى الانهيار الكامل. يتم الحصول على خليط من الحبوب بأحجام تتراوح من 20 إلى 200 ميكرومتر.

بدلا من ذلك ، قم بطحن شظايا الهيكل العظمي المرجاني باستخدام آلة طحن كهربائية بطول شفرة يبلغ ستة سنتيمترات وعرضها من 0.5 إلى سنتيمتر واحد ، بسرعة 1000 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية. لتنقية الحبوب ، انقل الحبوب إلى مصفاة شبكية كهربائية 40 ميكرون. اضبط إعدادات المصفاة الكهربائية على الاهتزاز بمعدل 600 سعة في الدقيقة ، والارتداد ست مرات في الثانية.

ثم الأوتوكلاف الحبوب. في ظل ظروف معقمة ، أضف حبيبات الهيكل العظمي المرجاني إلى 20 ميكروغرام لكل مليلتر PDL ، مذابة في محلول هانك لتحقيق تركيز خمسة ملليغرام أو 10 ملليغرام من الحبوب لكل مليلتر واحد من محلول PDL. صب المحلول في قوارير وأطباق بتركيز ملليلتر تقريبا لكل 25 سم مربع ، واحتضانه طوال الليل عند أربع درجات مئوية.

تغرق الحبوب وتلتصق بالقاع. في اليوم التالي ، اغسل القوارير والأطباق مرة واحدة بالماء المقطر المزدوج المعقم. دع القوارير والأطباق تجف في الغطاء.

لتغطية زلة الغطاء الزجاجي ، أضف أولا حبيبات الهيكل العظمي المرجاني إلى الماء المقطر المزدوج بتركيز خمسة أو 10 ملليغرام لكل ملليلتر. ضع زلات الغطاء على لوح تسخين مسخن مسبقا إلى 80 درجة مئوية. ثم قم بتقطير 40 ميكرولترا من محلول الحبوب في وسط زلة الغطاء ، وانتظر 15 دقيقة للتبخر الكامل.

سيؤدي ذلك إلى التصاق الحبوب بزلة الغطاء. قم بالتعقيم بزلات الغطاء المطلي ، وتخزينها في ظروف معقمة. بعد ذلك ، ضع زلات الغطاء على غطاء صفيحة معقمة 24 جيدا ، وأضف 100 ميكرولتر من محلول PDL 20 ميكروغرام لكل مليلتر إلى كل زلة غطاء.

استخدم الطرف للتأكد من أن السائل يغطي منطقة الحبوب بأكملها وبقية سطح انزلاق الغطاء. غطي الغطاء بقاع الطبق ، ولف جوانب المكان بغشاء البارافين. احتضن بين عشية وضحاها عند أربع درجات مئوية.

في اليوم التالي ، اغسل الغطاء مرة واحدة بالماء المقطر المزدوج وجففه في الغطاء. بعد تحضير رؤوس جرو الفئران ، أمسكها من الفم باستخدام ملاقط كبيرة. قطع الجلد الذي يغطي الجمجمة بمقص صغير.

باستخدام مقص نظيف ، أدخل أسفل الجمجمة على جانب المخيخ واقطع الجمجمة إلى اليمين واليسار لتمكين إزالتها. باستخدام ملاقط صغيرة ، انزع الجمجمة من الدماغ. افصل الدماغ عن الرأس وضعه في طبق بتري 60 ملم يحتوي على ملليلترين من MEM البارد.

تحت المجهر الاستريو ، استخدم ملاقطين صغيرتين لتشريح الحصين. انقل الحصين إلى طبق 35 ملم مجهز يحتوي على MEM. قطع الحصين إلى شرائح ملليمتر واحد تقريبا باستخدام مشرط.

أضف 200 ميكرولتر من محلول التربسين. تخلط بلطف وتحتضن عند 37 درجة مئوية وخمسة إلى 10٪ من ثاني أكسيد الكربون لمدة 30 دقيقة. بعد الحضانة ، أضف ملليلترين من MEM البارد إلى الطبق لإلغاء تنشيط التربسين.

ثم استخدم ماصة باستور زجاجية بقطر أكبر لنقل الأنسجة المعلبة بالتربسين إلى أنبوب سعة 15 مليلتر يحتوي على مليلتر واحد من وسط اليوم الأول، مسخن مسبقا إلى 37 درجة مئوية. قم بإخراج الأنسجة عن طريق تمريرها عبر أكبر ماصة زجاجية ذات قطر أكبر من 10 إلى 15 مرة. ثم كرر هذه العملية باستخدام الماصة الزجاجية ذات القطر المتوسط.

استمر في التجربة باستخدام ماصة أصغر قطر. تجنب الفقاعات لتقليل موت الخلايا. دع قطع الأنسجة المنفصلة تغرق لمدة دقيقتين إلى خمس دقائق.

ثم انقل المادة الطافية إلى أنبوب آخر سعة 15 مل. عد الخلايا باستخدام مقياس كثافة الدم. لتحقيق كثافة الخلية المفضلة بين 200 ، 000 و 400 ، 000 خلية لكل مليلتر.

استخدم اليوم الأول المتوسط للتخفيف. بعد ذلك ، قم بزرع 100 ميكرولتر من الخلايا على كل زلة غطاء زجاجي. تأكد من تغطية زلة الغطاء بالكامل بالخلايا.

احتضان عند 37 درجة مئوية وخمسة إلى 10٪ ثاني أكسيد الكربون. في اليوم التالي ، أضف 500 ميكرولتر من وسط نمو الخلايا العصبية إلى الآبار. باستخدام الملقط ، قم بإزالة وسط اليوم الأول عن طريق إمالة زلة الغطاء ، ونقل كل زلة غطاء برفق إلى البئر المناسب لها.

شفط الوسائط المتبقية من الغطاء. احتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية وخمسة إلى 10٪ ثاني أكسيد الكربون. حافظ على الحاضنة رطبة إلى أقصى حد باستخدام صينية من الماء في قاع الحاضنة.

لا تستبدل الوسيط. يمكن الحفاظ على الثقافات في ظل هذه الظروف لمدة تصل إلى شهر واحد. في هذه الدراسة ، أسفرت آلات الطحن اليدوي والطحن الكهربائية عن نتائج متشابهة ، مع مزيج من الحبوب يتراوح حجمه بين 20 إلى 200 ميكرومتر.

أنتجت المصافي اليدوية أو الكهربائية نوعين من مخاليط الحبوب. أحدهما بحبوب يتراوح حجمها من 40 إلى 200 ميكرومتر ، والثاني بحجم 40 ميكرومتر أو أقل. تظهر الصور المجهرية لتباين الطور أن زراعة خلايا الحصين على زلات الغطاء المغلفة بحبيبات الهيكل العظمي المرجانية شكلت شبكات عصبية معقدة في غياب المصفوفة ووجودها.

أشار تلطيخ نوى الخلية إلى أنه بعد 14 يوما من البذر ، كانت كثافة الخلايا أعلى على المصفوفة منها على زلات الغطاء غير المطلية. أظهر التلوين بالبروتين الثاني المرتبط بالأنابيب الدقيقة أن شبكة عصبية وتغصنية معقدة تشكلت على المصفوفة مقارنة بعنصر التحكم. بالإضافة إلى ذلك ، خضعت الخلايا الدبقية المزروعة على مصفوفة الهيكل العظمي المرجاني التي تم تصورها باستخدام البروتين الحمضي الليفي الدبقي لتغييرات مورفولوجية كبيرة.

لقد اكتسبوا مظهرا أكثر إثارة ، مع عمليات أطول ، من الخلايا الدبقية التي نمت على ركيزة التحكم ، حيث بدت أكثر استدارة وتملقا. أثناء عزل الخلايا, من المهم أن تتذكر أن تعمل بسرعة, الحفاظ على الرقم الهيدروجيني عن طريق إضافة ثاني أكسيد الكربون2 إذا لزم الأمر, والعمل بلطف قدر الإمكان من أجل منع انفصال الحبوب المرجانية.