فلورسينس تنشيط فرز الخلايا لعزل سكان الخلايا Scleractinian
مايو 31, 2020
وتخلق الشعاب المرجانية نظما إيكولوجية للتنوع البيولوجي هامة لكل من البشر والكائنات البحرية. ومع ذلك، ما زلنا لا نفهم الإمكانات الكاملة ووظيفة العديد من الخلايا المرجانية. هنا، نقدم بروتوكولاً تم تطويره لعزل ووسم وفصل مجموعات الخلايا المرجانية الحجرية.
وييسر هذا البروتوكول تحديد وعزل مجموعات الخلايا المرجانية الحية على مستوى وصفي لم يكن ممكنا من قبل. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح بالوصول إلى مستوى من خصوصية الخلية التي كانت حتى الآن غير قابلة للتحقيق في الغالب. وسوف يكون إثبات الإجراء الدكتور شانون سايغ، وهو باحث مشارك من تدفق المصدر المشترك استئصال الخلايا في مركز السرطان الشامل سيلفستر.
لإعداد مقياس تدفق الخلايا الخلوية الحية لفرز الخلايا المرجانية، افتح قالب مشروع جديد في برنامج مقياس التدفق الخلوي وحدد الليزر المناسب للتحليل في لوحة الليزر. ثم، إنشاء الجانب مبعثر مقابل مؤامرة مبعثر إلى الأمام في المؤامرات المناسبة لإعداد استراتيجية الغات والتحليل. لتحليل تدفق الخلايا الخلوية وفرز الخلايا المرجانية الحية، تحميل عينة الخلية غير المطّوعة في غرفة العينة في مقياس الخلايا وبدء عملية القراءة.
منذ الخلايا المرجانية هشة بشكل خاص، والحفاظ على ضغط مقياس الخلايا منخفضة لمنع تحلل الخلايا. في مؤامرة مبعثر، وضبط الجهد مضاعف الصورة إلى مركز النقاط والبدء في تسجيل الأحداث. في مؤامرة التشتت الأمامية مقابل الجانب، قم بإنشاء بوابة حول الخلايا في حوالي 10 إلى العلامة الرابعة على محور مبعثر إلى الأمام.
استبدل عينة التحكم بالعينة الأولى من الخلايا الملطخة وسجل حوالي 10000 خلية قبل التوقف المؤقت. ثم بوابة الأحداث التي هي فريدة من نوعها لمجموعة عينة ملطخة. لفرز الخلايا المرجانية الحية، بعد اختيار السكان الخلية من الفائدة في برنامج تدفق مقياس الخلايا، ووضع أنبوب واحد microcentrifuge واحد يحتوي على 250 إلى 500 ميكرولترات من الحل جمع المناسبة في غرفة جمع مقياس الخلايا لكل مجموعة لفرز.
مرة واحدة وقد مرت كمية مناسبة من الوقت لطرد الحطام، والبدء في فرز السكان المطلوب لجمع في أي مكان من 10،000 إلى عدة ملايين من الخلايا. في كل مرة يتم استخدام وصمة عار جديدة ، أو الأنواع ، أو الفرز ، وفرز ما لا يقل عن 2000 خلية من الاهتمام في 500 ميكرولترات من تلطيخ المتوسطة للسماح لفحص النقاء ليتم تنفيذها على السكان من الفائدة وإعادة تحلية الخلايا فرزها للتأكد من أن يتم قراءة الأحداث داخل البوابة المستخدمة في الفرز الأولي. للدراسات المختبرية، قم بتخزين الخلايا المخروزة على الجليد حتى يتم نقلها إلى حاضنة أو بيئة معقمة.
لجلب الجزيئات غير الخلوية الأخرى التي لا تشترك في نفس الشكل أو التفاصيل مثل الخلايا المرجانية يمكن إزالتها من التحليل عن طريق إنشاء اختيار بوابة على رسمة مبعثرة إلى الأمام والجانب. يمكن استبعاد الخلايا الميتة بمقارنة إشارة DAPI من تعليق الخلايا غير الملطخة والملطخة باستخدام الرسم البياني والبوابات خارج الخلايا عالية التعبير عن DAPI. في موازاة ذلك، يمكن إزالة الخلايا التي تستضيف سيمبيوديناسيا autofluorescence عن طريق الغاء ضد الخلايا مع إشارة عالية في القناة الحمراء البعيدة.
بعد عملية الغاء المتكررة هذه، تمثل الخلايا المتبقية مجموعات الخلايا المرجانية الحية سليمة تفتقر إلى symbiodeneasia. ويمكن بعد ذلك تصنيف هذه الخلايا إلى مجموعات فرعية مختلفة من الخلايا عن طريق التلطيخ لملامح مثل نشاط أنواع الأكسجين التفاعلية و / أو محتوى الليسوسوم. من المهم أن نتذكر أن بعض الخلايا أكثر هشاشة من غيرها وتشغيل هذه العملية بعناية قدر الإمكان.
مرة واحدة وقد تم عزل خلايا محددة، ويمكن استخدامها لمجرّفات وظيفية x-vivo مثل إنشاء ثقافات الخلية وخلق ملفات تعريف النسخ.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تناول هذه الدراسة الحاجة إلى فهم أفضل لخلايا المرجان، والتي تُعد بالغة الأهمية للتنوع البيولوجي في النظم البيئية البحرية. يقدم المؤلفون بروتوكولاً مستحدثاً لعزل وتوسيم مجموعات خلايا المرجان الصلب، محققين بذلك مستوى غير مسبوق من خصوصية الخلايا.
المكونات الرئيسية للدراسة
مجال البحث
- بيولوجيا المرجان
- تقنيات عزل الخلايا
- التنوع البيولوجي للنظام البيئي
خلفية علمية
- تشكل المرجانيات أنظمة بيئية أساسية للحياة البحرية.
- لا تزال المعرفة الحالية بوظائف خلايا المرجان محدودة.
- يعد عزل مجموعات محددة من خلايا المرجان أمراً حيوياً لإجراء المزيد من الأبحاث.
الطرق المستخدمة
- تقنية قياس التدفق الخلوي لفرز الخلايا الحية
- المرجان الصلب ككائن نموذجي
- استراتيجية تحديد النوافذ (Gating) لتحديد وعزل أنواع خلوية محددة
النتائج الرئيسية
- يتيح هذا البروتوكول تحديد وفرز مجتمعات الخلايا المرجانية الحية.
- يضمن نقاء وحيوية الخلايا المفرزة من أجل المقايسات المستقبلية.
- يسهل دراسة المجموعات الفرعية ووظائفها.
الاستنتاجات
- تقدم هذه الدراسة طريقة موثوقة لعزل خلايا المرجان، مما يعزز من إمكانات البحث العلمي.
- تساهم النتائج في تقديم رؤى قيمة حول بيولوجيا المرجان وصحة النظام البيئي.
الأسئلة الشائعة
الأهمية التنفيذية للصناعة
لا يزال عزل مجموعات خلوية محددة من الأنسجة المعقدة يمثل تحدياً حاسماً في المراحل المبكرة من التحقق من الأهداف والحد من المخاطر الميكانيكية. يتيح الفرز الخلوي المنشط بالفلورة (FACS) استجواباً خلوياً عالي الدقة، مما يدعم الثقة التنبؤية في الاستجابات الخاصة بالمسارات. وتطبق هذه القدرة بشكل مباشر في سير عمل الاكتشافات في مجال الأدوية الحيوية التي تتطلب فحوصات وظيفية دقيقة وتوصيفاً ترانسكريبتومياً لأنواع الخلايا النادرة أو الهشة.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير في مجال الأدوية البيولوجية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- القيمة العلمية: تتيح استجواب الفرضيات العلاجية بدقة الخلية الواحدة من خلال عزل المجموعات الخلوية الحية للتحقق الوظيفي.
- القيمة التشغيلية: تقلل من الغموض الميكانيكي عن طريق فصل المجموعات الفرعية من الخلايا القابلة للحياة عن الحطام، والخلايا الميتة، والإشارات المرتبطة بالكائنات المتعايشة.
- القيمة التنبؤية: تدعم فرز محفظة المشاريع من خلال توليد مدخلات منقاة للمقاييس اللاحقة التي توضح ارتباط الهدف وتعديل المسارات.
الفحص وتطوير المقايسة
- القيمة العلمية: إنتاج معلقات خلوية حيوية ومعيارية مناسبة للمقاييس الوظيفية القابلة للتكرار وتحديد ملامح الاستجابة للجرعة.
- القيمة التشغيلية: وضع استراتيجيات تحديد البوابات التي تضمن جاهزية المقاييس وتقليل التباين بين التشغيلات التجريبية.
- القابلية للتوسع: إتاحة جمع أعداد كافية من الخلايا (من 10,000 إلى عدة ملايين) لعمليات الفحص متعددة الآبار وتطبيقات الأوميكس.
الأبحاث الترجمية وما قبل السريرية
- الاستمرارية الانتقالية: يربط بين مراحل الاكتشاف والمراحل قبل السريرية من خلال تمكين عزل متسق لمجموعات الخلايا ذات الصلة بالمرض للمتابعة الآلية.
- مواءمة المؤشرات الحيوية: يسهل صبغ مؤشرات الاستجابة للإجهاد (مثل reactive oxygen species ومحتوى lysosome) لربط الأنماط الظاهرية الخلوية بالنتائج الوظيفية.
- التقدم المعدل حسب المخاطر: تعمل المجموعات المنقاة على تحسين موثوقية البيانات في النماذج قبل السريرية، مما يقلل من النتائج الإيجابية الكاذبة الناتجة عن العينات غير المتجانسة.
تكامل خطوط المعالجة وسير العمل
يتكامل نظام FACS ضمن سلسلة عمليات الاكتشاف، بدءاً من اختبار فرضيات الأهداف وصولاً إلى تحديد المركبات الواعدة ثم التحقق قبل السريري، وذلك من خلال تمكين مدخلات خلوية دقيقة في كل مرحلة.
- بيولوجيا الاكتشاف: تدعم اختبار الفرضيات من خلال عزل مجموعات خلايا المرجان الحية (أو مجموعات مماثلة من الثدييات) للاستقصاء الوظيفي الخاص بمسارات معينة.
- الفحص: توفر مجموعات خلوية مقيدة ومعيارية تعزز من إمكانية تكرار المقايسة وموثوقية القراءات الكمية.
- التحليلات: تنتج عينات عالية النقاء تتيح إجراء توصيف دقيق للنسخ أو البروتينات أو التمثيل الغذائي لمقارنة الظروف التجريبية.
- الأبحاث الانتقالية: تربط مرحلة الاكتشاف المبكر بالتحقق قبل السريري من خلال التحضير المتسق لمجموعات فرعية من الخلايا الحية والمستجيبة للإجهاد.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: تعمل كقدرة منصة قابلة لإعادة الاستخدام عبر المشاريع التي تتطلب دقة تحت خلوية، بغض النظر عن النظام النموذجي المستخدم.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: تزيد من الثقة التنبؤية عن طريق تقليل الضجيج الناتج عن الخلايا غير المستهدفة وتمكين الحد من المخاطر الميكانيكية للأهداف.
- القيمة التشغيلية: توحد تحضير العينات من خلال تحديد البوابات القابل للتكرار، والفرز منخفض الضغط، وطرق الجمع التي تحافظ على الحيوية.
- القيمة الاستراتيجية: تحسن قرارات المضي قدماً أو التوقف من خلال توفير بيانات بيولوجية أكثر دقة، مما يقلل من مخاطر الفشل في المراحل المتأخرة الناتجة عن افتراضات خاطئة حول الأهداف.
- التأثير على مجموعة المشاريع: تتيح تحديد الأولويات المعدلة حسب المخاطر من خلال بيانات موثوقة خاصة بالمجموعات الفرعية تساهم في تحديد معايير التطوير.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في إعداد قياس التدفق الخلوي، بما في ذلك اختيار الليزر، وتحسين الجهد الكهربائي، وتحديد بوابات مخططات التشتت للخلايا الهشة.
- يعتمد على وجود أجهزة قادرة على الفرز منخفض الضغط والكشف متعدد المعاملات (التشتت الأمامي/الجانبي، وقنوات الفلورة).
- يستلزم توحيد بروتوكولات الصبغ، وأوساط الجمع، وعتبات تحديد البوابات بين الفرق لضمان إمكانية تكرار النتائج.
- يجب مراعاة التباين في هشاشة الخلايا عبر الأنواع أو الظروف المختلفة، مما يتطلب تحسيناً تكرارياً لإجهاد القص ومدة الصبغ.
- يقتصر النجاح على جودة تحضير العينة؛ حيث يجب أن يحافظ التفكيك الإنزيمي أو الميكانيكي على سلامة المستضدات وحيوية الخلايا لضمان دقة الفرز.
