الليزر المستحثة الانبعاثات الفلورية (L.I.F.E.) كاداه جديده غير الغازية لقياسات في الموقع من العلامات البيولوجية في الموائل غلاف

ولا يكاد يجري تقييم تدفقات الكربون في الغلاف الجليدي ولكنها حاسمه فيما يتعلق بتغير المناخ. نعرض هنا نموذجا جديدا للجهاز يلتقط الإمكانات الضوئية في البيئات التي تعتمد علي تكنولوجيا الانبعاثات الفلورية المستحثة بالليزر (L.I.F.E.) والتي تقدم بيانات عاليه الطيفية والمكانية تحت ظروف الموقع.

والهدف العام من هذه الدراسة هو معايرة واختبار جهاز جديد يمكن استخدامه لإجراء قياسات في الموقع للعلامات الحيوية في موائل الغلاف الجليدي. ويستند الجهاز على تكنولوجيا الانبعاثات الفلورية التي يسببها الليزر، ويشار إليها باسم LIFE. وتؤدي أساليب أخذ العينات القياسية الحالية إلى آثار مادية على العينة بسبب المحاجر، وتفكك العينات عن طريق التقطيع والمنشار، وتحول درجة الحرارة عن طريق الذوبان.

وكثيرا ما تؤدي هذه الأساليب إلى تزوير الظروف في الموقع. ولذلك، فإن وضع منهجية جديدة للكشف عن الحياة الميكروبية وتحديد خصائصها في الموقع أمر بالغ الأهمية. لقد طورنا طريقة جديدة غير الغازية وغير المدمرة مع دقة مكانية وزمنية عالية.

ويستند تطبيق تقنية انبعاث الفلورس الناجم عن الليزر إلى حقيقة أن البيئات فوق الجليدية مأهولة، من بين أمور أخرى، بكائنات ضوئية. ويمكن تتبع هذه الكائنات عن طريق الكشف عن أنماط الفلورسنت من أصباغ الإكسسوارات القائمة على البورفيرين الكلوروفيرل A وphycoerythrin التي هي متحمسون من قبل الليزر الأزرق والأخضر على التوالي. يبلغ وزن مجموعة الطول الموجي المزدوج المحمولة 4.5 كيلوغرامات وتستخدم على حامل ثلاثي القوائم بالاقتران مع جهاز كمبيوتر خارجي.

يتم توجيه أنبوب العدسة نحو العينة. ثم، ليزر أخضر خمسة ملليوات يضرب العينة بعد تمرير تقسيم شعاع الاستقطاب الذي يعيد توجيه الضوء المستقطب نحو المحور البصري للمطياف. تعرض العينة ضوء فلوري موضح باللون الأحمر.

نصف الضوء التكولي يمر مقسّم شعاع الاستقطاب ويركز من خلال مرشح تمريرة طويلة الذي يزيل إشارات الليزر. بعد ذلك، تصل الإشارة إلى فتحة الفتحة التي تتكون من شفرات حلاقة قابلتين للتعديل. يفصل المُنشور بشكل طيفي خطًا رفيعًا من متعامد الضوء إلى فتحة الفتحة قبل التقاط الإشارة على جهاز استشعار.

يتم تكرار الإجراء مع الليزر الأزرق. يتم نقل البيانات الأولية تلقائيا إلى جهاز كمبيوتر محمول والذي يستخدم أيضا لتشغيل البرنامج. وتنقسم إلى ثلاثة أقسام رئيسية.

يتم تعديل التعرض يدويا. هنا، التصحيح بين وقت التعرض وكثافة الإشارة خطي. يتم استخدام حقل التعليق لوصف نموذج.

في القسم الأيمن، يتم عرض الصور الخام بمجرد الانتهاء من القياس. هذه الميزة حاسمة لتقييم البيانات الفوري في الميدان. تشير المناطق الحمراء إلى وحدات البكسل التي تم تعريضها بشكل زائد والتي يمكن تجنبها عن طريق تقليل وقت التعرض.

تظهر الصور الخام الرمادية 12 بت مكونًا مكانيًا بسبب فتحة أحادية البعد ومكون طيفي بسبب المنشور أمام CCD. استجابة للقيود البصرية، يتم تشويه الصور الخام. ولذلك، فإنها تحتاج إلى اقتصاص و dewarped عن طريق تطبيق رمز الذي يعترف درجة التشويه.

بعد ذلك ، تتم معايرة الطول الموجي بمساعدة ليزر 532 نانومتر. يتم إنتاج الضوء الأخضر عن طريق مضاعفة التردد من 1، 064 نانومتر الأشعة تحت الحمراء الليزر. يمكن الكشف عن كلا الأطوال الموجية من قبل اتفاقية مكافحة التصحر وبالتالي يمكن حساب الموضع الطيفي لكل بكسل في الصور dewarped.

ثم، يتم اقتصاص الصورة وصولاً إلى نطاق طول موجي معين. يتم حساب القيم الرمادية من كل بكسل في خط بكسل محدد ويتم تلخيصها. يمكن أن تتراوح قيمة الرمادي من صفر إلى 255.

بعد ذلك، كل بند بكسل حسابات رقم واحد. في هذا الرسم البياني، يتم رسم قيمة الرمادية من كل خط بكسل مقابل الإحداثيات المكانية. وهذا يسمح التمييز المكاني الكمي من الكلوروفيرل وفيكوريثرين في وقت واحد داخل العينة.

بالإضافة إلى ذلك، يمكن رسم الخصائص الطيفية لعينة من خطوط بكسل محددة. إعداد الحقل سريع وسهل. إرفاق الصك على ترايبود.

قم بتوصيل أنبوب العدسة بالجهاز. قم بتوصيل كابل اردوينو USB وكابل الكاميرا. قم بتوصيل الكمبيوتر الخارجي مع الأداة باستخدام كبل USB.

ضبط الساقين ترايبود بطريقة أن أنبوب العدسة يغطي العينة. قم بتشغيل البرنامج، ووصف العينة، وبدء تشغيل القياس. لمعايرة الصباغ، إعداد سلسلة صف التخفيف من محلول الأسهم كما هو معروض.

الكلوروفيرت محلول الأسهم يحتاج إلى تخفيف مع الأسيتون ويتم تنفيذ تخفيف فيكويريثرين مع الماء المقطر المعقم. وسوف تكون هناك حاجة إلى خمسة عشر ملليلتر من كل خطوة التخفيف في وقت لاحق. حماية أصباغ من الضوء عن طريق التفاف عليها تحت رقائق الألومنيوم.

تخزين الكلوروفيرل في الثلاجة وفيكويريثرين في الثلاجة حتى مزيد من الاستخدام. بعد ذلك، قم ببناء رف كما هو موضح مع فارق في الارتفاع يبلغ 1.5 سنتيمتر. إضافة خمسة ملليلتر من أعلى تخفيف مركزة في قارورة بلاستيكية poly-تلأل.

هذا الحجم يعادل 15 ملليمتر عمود المياه عالية في القارورة وقياس شدة الفلور. ثم، ضع القارورة في الوضع الأوسط للرف وأضف خمسة ملليلترات أخرى من نفس الحل. كرر الإجراء مع 5 ملليلترات أخرى تساوي 45 ملليمتر في ارتفاع العمود.

كرر الإجراء مع جميع خطوات التخفيف للكلوروفير وفيكويريثرين. رف وارتفاع العمود تلعب دورا هاما للقياس منذ سطح السوائل تكمن في نقطة محورية من أداة الحياة. جمع عينات الثلج والجليد من نهر جليدي.

بالإضافة إلى ذلك، جمع عينات حصيرة الميكروبية من أمام الجليدية. في هذه الدراسة، تم اختيار ميدتر لوفينبرين، وهو نهر جليدي قريب من مرافق البحوث في ني ألسوند في أرخبيل سفالبارد في القطب الشمالي العالي. تذوب عينات الثلج والجليد وتصفية فراغ لهم تحت GF / F مرشحات.

لاحظ وحدة التخزين التي تمت تصفيتها. ثم، قياس المرشحات مع جهاز LIFE على أربع مناطق عشوائية كل في ثلاث ية باستخدام الليزر الأخضر والأزرق. حساب تركيز الصباغ الكلي بضرب كثافة المنطقة مع المساحة المصفاة وحجم المصفاة.

تطبيع تركيز الصباغ إلى حجم لتر واحد. وضع المرشحات في قارورة مع 30 ملليلتر من الأسيتون وتخزينها في الظلام في أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها. المقبل، واتخاذ قارورة ووضعها على الجليد قبل sonication لمدة دقيقتين في 50٪ السلطة في وضع مستمر.

الضغط على المرشح وإزالته من القارورة. لم تعد هناك حاجة إلى عامل التصفية. إرفاق Tygon أنابيب لحقنة وإزالة مزيج الأسيتون استخراج الكلورو من القارورة.

استبدال أنابيب Tygon مع حامل مرشح GF5. نقل الحل إلى cuvette الكوارتز. بعد معايرة مطياف الامتصاص للأسيتون، ضع العينة التي تحتوي على cuvette في المطياف وقياس ميزات الامتصاص بين 400 و 750 نانومتر.

بعد ذلك، قم بإزالة cuvette من مطياف وإضافة 200 ميكرولترات من حمض الهيدروكلوريك المولار إلى العينة. ثم، كرر قياس الامتصاص من أجل قياس محتوى pheophytin في العينة. لم يتم وصف تأثير قياس الليزر على نشاط المجتمعات البكتيرية بالتفصيل حتى الآن.

ولذلك، تم التحقيق في التأثير عن طريق الإنتاج الأولي والثانوي. لإنتاج البكتيريا، واتخاذ خمسة aliquots من حصيرة البكتيريا لدينا. وتستخدم ثلاثة aliquots لاتم امتصاص اللوسين المسمى التريتيوم واثنين من aliquots تستخدم كضوابط.

إلغاء تنشيط عناصر التحكم مع الفورمالديهايد. إضافة اللوسين المسمى التريتيوم إلى جميع aliquots. كرر هذا الإجراء مع كل العينات.

هنا، يتم عرض كمية العينة المطلوبة لتصميمنا التجريبي. بعد ذلك، فضح حصيرة البكتيرية مع الليزر الأخضر والأزرق كما هو مبين في الإعداد التجريبي. ثم، تعطيل كافة العينات التي لم يتم التعامل معها بعد مع الفورمالديهايد.

نقل العينة إلى اكريابية وإضافة حمض ثلاثي الكلور أوسيتيك أو TCA. الطرد المركزي القارورة في 10،000 غرام لمدة خمس دقائق. إضافة السائل التلألؤ ووضع cryovial في قارورة poly-scintillation.

تحليل العينات مع عداد مُلألؤ سائل وحساب معدلات الامتصاص. بالنسبة لعملية التمثيل الضوئي، قم بإعداد خمسة اسكوت كما كان الحال من قبل، وهما معتمتان. إضافة المتتبع المشع NaH14 CO3 واحتضان لمدة أربع ساعات.

بعد الحضانة، ووقف رد فعل عن طريق التفاف العينات في رقائق الألومنيوم. قياس التفكك في الدقيقة الواحدة عن طريق التلألؤ السائل كما هو موضح من قبل. بعد تسوية البيانات لوقت التعرض لثانية واحدة وارتفاع عمود عينة 15 ملليمتر، تم حساب خط المعايرة النهائية باستخدام الانحدار Poisson.

وللارتباط بين كثافة المنطقة وعدد الفوتونات حرف خطي. ميل المنحنى هو 81.04 وهذا يعني أن معدل عدد الفوتونات 8، 104 في عينة مكشوفة لثانية واحدة يساوي كثافة مساحة 100 نانوغرام لكل سنتيمتر مربع من فيكويريثرين.

يمكن تفسير الانحراف المعياري في العينات المركزة الأعلى من خلال عملية الاستيعاب الذاتي داخل العينة. يُظهر منحنى الكلوروفير المعايرة خصائص متشابهة وله طابع خطي مع ميل 8.94. تم قياس ست عينات من الثلج والثلج المصفاة باستخدام أداة LIFE قبل استخراج الكلوروفير وقياس طيف الامتصاص اللاحق لتحليل محتوى الكلوروفيرل.

يتم طلب العينات من قبل محتوى الكلورو التي اكتسبها القياس الطيفي امتصاص. وتظهر بيانات "الحياة" انحرافات معيارية صغيرة تشير إلى أن المادة على المرشح قد تم توزيعها بالتساوي نسبياً. تقلل أداة LIFE من محتوى الكلوروفير من المرشحات الثلاثة الأولى.

الفلاتر الثلاثة الأخيرة ، والتي تظهر محتوى أقل من الكلورو ، يتم المبالغة فيها من قبل أداة LIFE. يمكن تفسير سبب التفاوت في البيانات بسمك كعكة التصفية. في كعك مرشح رقيقة، يتضح في البرتقال، يتم التقاط إشارات الفلورس المنخفضة بسبب كثافة المنطقة المنخفضة من الأصباغ.

ويتضح من الكلوروفير إشارات باللون الأحمر في هذه الصورة الخام. تشير جميع المناطق الرمادية في هذه الصورة الخام إلى أن المرشح نفسه يعرض إشارات مستحثة بالليزر بعد اجتياز فلتر التمرير الطويل 450 نانومتر. البرنامج عد بشكل مضلل هذه الإشارة كما الكلورو A fluorescence.

تم التقليل من محتويات الصباغ عالية لأن الليزر لا يمكن أن تحفز استجابة الفلوريسين في جزيئات الكلوروفيرل في طبقات أعمق من كعكة التصفية. تشير تجربة التعرض بالليزر إلى عدم وجود تأثير كبير على الإنتاجية الأولية والثانوية للفرش البكتيرية. ولم يُظهر أي تأثير على نتائج الإنتاجية في وقت التعرض من خمس إلى 60 ثانية ولا كثافة الليزر التي تتراوح بين 5 و50 مللي واط.

وهذا يعني ضمناً أن الكثافة الأعلى وأوقات التعرض المطلوبة لإنتاج إشارات أفضل لن تضر الخلايا. تم قياس أربعة cryoconites في الموقع ويتم مقارنتها مع محلول الكلوروفيلي القياسية التي تم قياسها في ظل الظروف المختبرية أظهرت باللون الأحمر. وتتطابق ذروة الفلور الطيفي باللون الأزرق مع الطيف المعياري للكلورو فيل، مما يوفر مفهوم القياسات في الموقع.

وقد أجريت قياسات الحياة على التربة والحصير البكتيرية والأغشية الحيوية و cryoconites. قياسات الحياة من cryoconites مع طبقة الرواسب سميكة ممكنة إذا كانت مساحة سطح تغطي التبريد تتجاوز 12.5 سنتيمتر مربع. هذا النوع من كتل cryoconite ضوء ضال من تحت الجليد.

في طبقات التبريد الرقيقة، تكون إشارات الفلورسين محاطة بالضوء المحيط. وبناء على ذلك، فإن قياسات الحياة لأسطح الجليد العارية غير ممكنة في حين أن جميع أنواع العينات الأخرى يمكن تحليلها بواسطة أداة LIFE. وتؤدي التغيرات في درجة الحرارة إلى زيادة توافر المياه السائلة مما يؤدي إلى زيادة النشاط البيولوجي على أسطح الأنهار الجليدية.

ونتيجة لذلك، قد يزيد تركيز الصباغ. ومن الأهمية بمكان رصد هذه التغيرات والتنبؤ بالسيناريوهات المحتملة والمرجحة في المستقبل.