التحوير الجيني لبكتيريا السيانيد بالاقتران باستخدام مجموعه أدوات الاستنساخ النموذجية السيسونات

Cyanobacteria هي فيبلوم مهم من الميكروبات الضوئية التي يتم الاعتراف بها بشكل متزايد كمنصات مفيدة لبيولوجيا التركيبية وتطبيقات التكنولوجيا الحيوية المتجددة. لذلك من المهم تطوير تقنيات قوية لتبسيط التصميم والاستنساخ وإدخال الحمض النووي غير المتغاير في الأنواع الزرقاء المختلفة. لذلك هذه التقنية يوضح طريقة راسخة تسمى الاقتران أو التزاوج ثلاثي الأعراق لإدخال الحمض النووي في الأنواع الزرقاء التي ليست قابلة للتحويل بشكل طبيعي.

وقد أجريت بنجاح في اجتان في مجموعة واسعة من سلالات البكتيريا الزرقاء من خلية واحدة إلى الأنواع خيوط متعددة الخلايا. إذا كنت تحاول هذه التقنية للمرة الأولى، يرجى الحرص على التعامل مع كل من البكتيريا الزرقاء الخاصة بك وسلالات الإشريكية القولونية الخاصة بك مع الرعاية. على سبيل المثال، لا الطرد المركزي فوق القيم الواردة في البروتوكول ولا دوامة.

خلط البكتيريا والبكتيريا الزرقاء قد يبدو غريبا للمستخدمين لأول مرة. ونأمل أن نساعد على توضيح ذلك من خلال إظهار عملية الاقتران. بعد إنشاء تجميعات مستوى واحد، اختر مستوى مناسب T acceptor المتجه.

اختيار وصلة نهاية مناسبة لligate ثلاثة رئيس نهاية النهائي من مستوى واحد إلى مستوى العمود الفقري T. لتجميع تجميع واحد أو أكثر من مستوى واحد في المستوى T، قم بإعداد مزيج تفاعل مع PBI1 و متجه الارتباط النهائي المطلوب. إعداد برنامج دورة الحرارية والمضي قدما وفقا للمخطوطة.

في اليوم الأول ، تنمو الثقافة البكتيريا الزرقاء من خلال إنشاء ثقافة جديدة من Synechocystis PCC 6803 أو Synechococcus elongatus UTEX 2973. مع حلقة معقم الحرارة، كشط الخلايا من لوحة أجار axenic BG-11 ووضعها في قارورة مخروطية 100 ملليلتر مليئة 50 ملليلتر من الطازجة BG-11 المتوسطة إلى تلقيح. ضع القارورة في حاضنة تهتز مع الإضاءة لتنمو Synechocystis PCC 6803 الثقافات الخلية في 30 درجة مئوية في 100 دورة في الدقيقة.

بالنسبة لـ Synechococcus elongatus UTEX 2973، تنمو ثقافات الخلايا عند 40 درجة مئوية عند 100 دورة في الدقيقة. بعد يوم إلى يومين، رسم ملليلتر واحد من ثقافة الخلية وقياس على مقياس الطيف. امتصاص في OD 750 تصل إلى 0.5 إلى 1.5.

في اليوم الثاني، تلقيح سلالة مساعدة MC1061 E.coli التي تحتوي على ناقلات PRK24 وPRL528 في خمسة ملليلتر من LB المتوسطة مع الأمبيسيلين بتركيز 100 ميكروغرام لكل ملليلتر وكلورامفينيكول بتركيز 25 ميكروغرام لكل ملليلتر. تنمو عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها في 225 دورة في الدقيقة في حاضنة تهتز. ثم تلقيح خمسة ملليلترات من متوسطة LB تحتوي على المضادات الحيوية المناسبة مع ثقافة الإشريكية القولونية التي تحمل متجه البضائع T المستوى.

تنمو الثقافة في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها في 225 دورة في الدقيقة في حاضنة تهتز. في اليوم الثالث، الطرد المركزي المساعد والبضائع E.coli الثقافات بين عشية وضحاها في 3، 000 غرام لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. تجاهل المناط دون إزعاج بيليه الخلية.

غسل الكريات بإضافة خمسة ملليلتر من متوسطة LB الطازجة دون المضادات الحيوية. إعادة تعليق بيليه عن طريق الأنابيب بلطف صعودا وهبوطا والطرد المركزي لإزالة الفائق. كرر هذه الخطوة غسل ثلاث مرات لإزالة المضادات الحيوية المتبقية من ثقافة بين عشية وضحاها.

بعد الغسيل الأخير، resuspend بيليه الخلية في نصف حجم متوسطة LB من حجم الثقافة الأولية. ثم الجمع بين 450 ميكرولترات من سلالة المساعد مع 450 ميكرولترات من سلالة البضائع في أنبوب ملليلتر اثنين وترك في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، إعداد ثقافة البكتيريا الزرقاء عن طريق الطرد المركزي ملليلتر واحد من الثقافة البكتيريا الزرقاء في 1، 500 غرام لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.

ثم تجاهل المابير بعناية دون إزعاج بيليه الخلية. غسل بيليه أربع مرات عن طريق إضافة الطازجة BG-11 المتوسطة من نفس الحجم الأولي. أضف 900 ميكرولترات من ثقافة البكتيريا الزرقاء المغسولة إلى 900 ميكرولترات من سلالات الإشريكية القولونية مجتمعة في أنبوب ملليلتر اثنين.

اخلط الثقافات عن طريق الخفقان بلطف صعودا وهبوطا. احتضان الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة لSynechocystis PCC 6803 أو ساعتين لSانيتشيككوس elongatus UTEX 2973. الطرد المركزي الخليط في 1, 500 غ لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.

إزالة 1.6 ملليلتر من عظمى و resuspend بيليه في عظمى المتبقية. ضع فلتر غشاء 0.45 ميكرون على صفيحة LB BG-11 agar بدون مضادات حيوية. انتشار بعناية 200 ميكرولترات من مزيج ثقافة E.coli/cyanobacterial على الغشاء مع موزع معقمة أو طرف منحنى العقيمة.

ختم لوحة مع فيلم البارافين ووضع لوحة في حاضنة مضيئة لمدة 24 ساعة. بعد 24 ساعة، نقل بعناية الغشاء باستخدام ملقط معقمة لهب إلى لوحة Agar BG-11 الطازجة التي تحتوي على المضادات الحيوية المناسبة لتحديد لناقلات البضائع. ختم لوحة مع فيلم البارافين واحتضان تحت نفس الظروف كما في السابق حتى تظهر المستعمرات.

تظهر المستعمرات عادة بعد 7-14 يومًا لـ Synechocystis PCC 6803 و 3-7 أيام لـ Synechococcus elongatus UTEX 2973. لتحديد الاقتران، وذلك باستخدام قضيب التلقيح معقمة الحرارة، حدد ما لا يقل عن اثنين من المستعمرات الفردية من الغشاء و streak على لوحة Agar BG-11 الجديدة التي تحتوي على المضادات الحيوية المناسبة. ثم تلقيح سلسلة من الثقافة البكتيريا الزرقاء في أنبوب طرد مركزي 15 ملليلتر يحتوي على خمسة ملليلتر من LB المتوسطة واحتضان في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها في 225 دورة في الدقيقة في حاضنة تهتز.

الثقافة الواضحة تؤكد عدم وجود تلوث الإشريكية القولونية. بعد فترة نمو كافية من سبعة أيام، واختيار المستعمرات أكسل الفردية لاقامة الثقافات السائلة لتخزين التبريد على المدى الطويل أو التجارب اللاحقة. في هذه الدراسة، تم إظهار سير عمل تجميع البوابة الذهبية.

بعد تحول من تفاعل الجمعية، تم تحديد الجمعيات الناجحة باستخدام الفحص الأبيض الأزرق القياسي لمستعمرات الإشريكية القولونية. ثم تم تجميع الكاسيت التعبير eYFP في المستوى واحد متجه ونهاية وصلة متجه واحد في مستوى T acceptor ناقلات لإعطاء متجه cpcBA-eYFP. تم التحقق من ناقل cpcBA-eYFP المجمعة عن طريق الهضم المقيد.

أدى النقل الزوجي الناجح لل cpcBA-eYFP أو متجه pPMQAK1-T إلى نمو ما يصل إلى عدة مئات من المستعمرات على الغشاء لـ Synechocystis PCC 6803 وSyechococcus elongatus UTEX 2973. كما هو متوقع للمروج Pcpc560 قوية، كانت قيم لفلورسينسي eYFP تطبيع من قارئ لوحة وeYFP fluorescence لكل خلية من تدفق مقياس الخلايا عالية بالمقارنة مع السيطرة السلبية. مع كل من قارئ لوحة ومقياس التدفق، كانت قيم الفلوريسين أعلى في Synechococcus elongatus UTEX 2973 مما كانت عليه في Synechocystis PCC 6803.

تأكد من احتضان الحد الأدنى من الوقت وفقا لأي سلالة كنت مترافق.