باستخدام Tg (Vtg1:mcherry) أجنة حمار وحشي لاختبار الآثار الإستروجين من المركبات تعطيل الغدد الصماء

هناك عدد كبير من المواد الكيميائية EDC في بيئتنا، أساسا المواد الإستروجين. إن التنوع الكيميائي للمواد التي تنتمي إلى المجموعة يجعل اختبارها صعباً، حيث أن هناك حاجة إلى طرق مختلفة للكشف عنها. استناداً إلى التركيب الكيميائي، فمن الصعب حقاً تحديد ما إذا كانت مادة قادرة فعلاً على العمل كإستروجين.

وبالإضافة إلى ذلك، هذه المواد ليست موجودة أبدا في شكل نقي في البيئة، لذلك قد تتأثر آثارها من قبل مركبات أخرى، أيضا. يتم حل هذه المشكلة عن طريق تأثير أساليب لهجة مثل استخدام أجهزة المعالجة الحيوية، الكائنات الحية الحيوية التي تظهر تأثير هرمون الاستروجين. ومن المعروف أن بعض الجينات تتفاعل بحساسية مع الإستروجين في الكائنات الحية.

كما أن الكشف عن المنتجات الجينية بالطرق الجزيئية ممكن أيضاً على مستوى البروتين أو الحمض النووي الريبي، ولكنه ينطوي عادة على التضحية بالحيوان. وقد أصبحت قوانين حماية الحيوان أكثر صرامة، وهناك طلب متزايد على نظم الاختبار البديلة. وتمثل التكنولوجيات الجينية المشتركة الإمكانية مع هذا التطور ومع اكتشاف البروتينات الفلورية، تم تمهيد الطريق لإنشاء العلامات البيولوجية.

بمساعدة مثل تنشيط الجينات الحساسة هرمون الاستروجين يمكن اختبارها في الجسم الحي. في هذا الفيديو، يتم عرض طريقة ممكنة لاستخدام vtg:1mCherry حمار وحشي أجنة لاختبار المواد الإستروجين بمساعدة مركبين. يمكن أن يكون البروتوكول بمثابة خلفية لدراسة تأثير هرمون الاستروجين للعينات الكيميائية أو البيئية المختلفة على أجنة العلامات البيولوجية.

خط الحمار الوحشي المستخدم في تجاربنا هو خط حمار وحشي محورة vitellogenin. تم إنشاء الخط باستخدام نظام Transposon Tol2. حمل بناء transgene المستخدمة في التطوير تسلسل المروج vitellogenin-1 الطبيعية الطويلة ، مع عدد كبير من الجانبين ERI.

التعبير عن إشارة الفلورسنت في الإناث ناضجة جنسيا هو مستمر. ومع ذلك ، في الذكور في الأجنة ، فإنه يظهر فقط من خلال العمل أو وجود مواد استروجين ، وبالتالي فإن هذا الأخير أكثر ملاءمة للاختبار. وقد تم اختبار حساسية وسهولة الاستخدام من أجنة الخط على العديد من المركبات استروجين وكذلك على عينات البيئية.

وقد أجريت جميع التجارب على الحيوانات الحية وفقا لقانون رعاية الحيوان الهنغاري، وتم الانتهاء من جميع الدراسات قبل أن تصل الحيوانات إلى مرحلة التغذية المجانية. ملء خزانات التزاوج مع المياه النظام وإعداد الأسماك للتزاوج قبل حصاد البيض. وضع الأسماك الذكور والإناث في الخزان، وفصلهم بمساعدة من المقسم.

إزالة المقسم من الدبابات كما يتحول الضوء في صباح اليوم التالي. تحقق من خزانات التزاوج للبيض كل 15 إلى 20 دقيقة. حصاد جميع الأجنة باستخدام مصفاة الشاي، أو المنسوجة بكثافة، وشبكة غرامة، والجمع بينها في طبق واحد بيتري كبيرة مع العازلة E3، أو المياه نظام واضح.

ضع الأجنة في الحاضنات التي تم تعيينها إلى 25.5 درجة مئوية. بعد ساعة إلى ساعة ونصف، قم بإزالة وتجاهل البيض غير المخصب، أو غير المقسمة بشكل غير كاف مع ماصة نقل بلاستيكية تحت مجهر تشريح. ضع الأجنة المختارة في أوعية العلاج، على سبيل المثال في أطباق بيتري أو لوحات زراعة الأنسجة، التي تم تصنيفها بالفعل وملئها بتركيزات مختلفة من مادة الاختبار.

احتضان الأجنة في 25.5 درجة مئوية حتى نهاية التجربة. تحديث حل الاختبار إذا كان ذلك ضروريا من أجل الحفاظ على تركيز العلاج. كن حذرا عند تغيير حل الاختبار، من أجل تجنب إتلاف الأجنة.

إعداد أربعة في المئة الميثوسيلادوس مع MS 222 مسبقا. ضع اليرقات القديمة لمدة خمسة أيام في طبق بيتري لمدة خمسة سنتيمترات لكل مجموعة معالجة مع ماصة بلاستيكية. إزالة محلول العلاج من اليرقات مع ماصة بلاستيكية، ثم ملء طبق بيتري مع ملليلتر اثنين من 0.02 في المئة مللي ثانية 222 محلول مخدر.

ملء كل مربع من طبق بيتري مصممة خصيصا 10 سنتيمترا مع أربعة في المئة الميثوسيلادوس ms 222. نقل اليرقات تخدير إلى الميثهوسيلادوس مع القليل من الماء في واحدة من المربعين. من المربع الأول ، نقل اليرقات إلى المربع الثاني.

في المربع الثاني ، قم بتدوير وتوجيه اليرقات إلى جانبها الأيسر واضغط عليها بلطف إلى أسفل رأس ماصة microloader مقطعة إلى سنتيمترين. من أجل تقييم إشارة المراسل المعبر عنها، تصور الأجنة في نفس المنظر والإعدادات. ضع طبق بيتري على خشبة المجهر.

التركيز على الكبد من الجنين، والتقاط صورة حقل مشرق باستخدام البرامج المرتبطة بها. قم بتبديل المجهر إلى مرشح mCherry، واصطح صورة من الكبد تحت ضوء الفلورسنت باستخدام البرامج المرتبطة به. كرر الخطوتين السابقتين حتى يتم التقاط جميع الأجنة في التجربة.

افتح ImageJ، ثم قم بتحميل صورة الفلورسنت ليتم تحليلها إما بسحب الصورة وإفلاتها، أو النقر على فتح الملف. انقر على الصورة، اللون، قنوات الانقسام لتقسيم الصورة التي أدلى بها مرشح فلوريسنت وفقا ل RGB لون الرسم البياني. العمل مع طيف صورة القناة الحمراء.

أغلق القنوات الأخرى. تعيين منطقة بيضاوية بنفس الحجم في الصورة، بحيث لا تتداخل الإشارات الكاملة مع التقييم. باستخدام الأدوات البيضاوية رسم القطع الناقص على منطقة الكبد أبرز بأكبر قدر ممكن من الدقة.

إذا كانت الإشارة ضعيفة، استخدم صور microspic الخفيفة، زوج الحقل الساطع للصورة الفلورسنت، لتحديد موقع الكبد. انقر على تحليل ، التدبير ، لتحديد قوة الإشارة وحجم المنطقة التي تم تنفيذها. يتم حساب قيمة الكثافة المتكاملة تلقائيًا بواسطة عمود البرامج في المخطط.

مواصلة التحليل من خلال تكرار الخطوات السابقة حتى تقوم بتحليل جميع الصور المفلورة لجميع الأجنة في مجموعة العلاج. حفظ البيانات، ثم قم بتحليل قيم الكثافة المتكاملة. في التجربة، تم التعامل مع الأجنة الحساسة هرمون الاستروجين من خط الحمار الوحشي العلامة الحيوية مع 0.5 وثمانية تركيزات ميكرومول من ألفا وبيتا زيارالينول، أو ZOL، للتخصيب حتى سن خمسة أيام.

لقد قمنا بالتحقيق فيما إذا كانت الإشارات الفلورية تظهر في كبد السمك في نهاية التجربة بسبب المواد ، وما إذا كانت هناك اختلافات في إستروجين المواد. وقد تم تقييم النتائج على أساس الصور الفلورية وقيم الكثافة المتكاملة. في حالة ألفا-زول، في أعلى تركيز اختبار، توفي جميع الأفراد.

حتى في هذه الحالة لا يمكن فحص إشارة الفلورسنت. في تركيزات أقل، يمكن ملاحظة إشارة فلورية قوية في كبد الجنين. مع عدم وجود فرق كبير في قوة إشارة الفلورسنت وحجم المناطق المضيئة.

كما لم يكن هناك فرق كبير بين قيم الكثافة المتكاملة والعلاجات. لم يكن هناك وفيات أثناء العلاج مع بيتا زول. المادة الناجمة عن نشاط transgene في جميع تركيزات العلاج.

ويمكن ملاحظة زيادة كثافة الإشارة الفلورسنت، وحجم المنطقة المضيئة في الصور المفلورة مع زيادة التركيز. من خلال فحص القيم المتكاملة من بيتا - زول ، يمكن أيضا أن يتم اكتشاف هذا التغيير. ويتضاعف متوسط قيمة الكثافة المتكاملة تقريباً بين أدنى وأعلى تركيزات العلاج.

ومع ذلك، في حالة بيتا زول، لم نجد فرقاً كبيراً بين قيم الكثافة المتكاملة للتركيزات الفردية. ومن خلال دراسة قيم الكثافة المتكاملة التي تم الحصول عليها من نفس تركيزات المعالجة للمادتين، يمكن القول إن ألفا - زول أعطت متوسطات كثافة متكاملة أعلى في كل حالة بالنسبة إلى بيتا زول، وهو ما يتسق مع الاختلافات بين قوة الإشارة التي لوحظت في الصور الفلورية. هذا الاختلاف مع كبير في جميع التركيزات.

وقد تم استخدام bioindics لآثار هرمون الاستروجين ينتشر في الدراسات السمية. كما تم إنتاج العديد من الخطوط المعدلة وراثيا التي تظهر آثار هرمون الاستروجين من حمار وحشي، والتي تم استخدام vtg:1mCherry في دراساتنا. الطريقة المذكورة هنا يوضح بروتوكول ممكن لاختبار أجنة هذا الخط، من أجل السماح في الكشف في الجسم الحي من نشاط هرمون الاستروجين في حالة وكلاء نقية.

من المهم أن نذكر أنه في حالة الأجنة ، فإن التعبير عن transgene ، على غرار إنتاج فيتيلوجينين الذاتية ، يظهر تشتتًا كبيرًا ، وينبغي مراعاة الاختلافات في الحساسية الفردية عند تصميم التجارب. جانب مهم في تحديد تركيزات العلاج هو أن خلايا الأجنة، بما في ذلك خلايا الكبد، يمكن أن تتضرر من تركيزات أعلى من المواد شديدة السمية، والتي يمكن أن تؤدي إلى انخفاض في تحريض vitellogenin. ولذلك ينبغي إجراء الاختبارات بتركيزات أقل من L-C 10.

ويمكن تغيير هذا البروتوكول في نقاط عديدة وفقا لنقاط نهاية الاختبار المخطط لها، وللعينات التي سيتم اختبارها. ويمكن الانتهاء من ذلك مع أساليب اختبار أخرى، على سبيل المثال الطرق الجزيئية. وهكذا، نأمل أن استخدام خط vtg:1mCherry سوف تظهر كنموذج لاختبارات استروجين، وربما أيضا قد يكون نموذجا لأساليب الاختبار الموحدة.