التحكم في سرعات تدفق السوائل النشطة ثلاثية الابعاد المستندة إلى Microtubule باستخدام درجه الحرارة
November 26th, 2019
الهدف من هذا البروتوكول هو استخدام درجه الحرارة للسيطرة علي سرعات تدفق السوائل النشطة ثلاثية الابعاد. ميزه هذا الأسلوب لا يسمح فقط لتنظيم سرعات التدفق في الموقع ولكن أيضا تمكن التحكم الديناميكي ، مثل بشكل دوري ضبط سرعات التدفق صعودا وهبوطا.
وقد استخدمت المادة النشطة في تطبيقات مختلفة مثل الظلال الجزيئية. لتحقيق التطبيق إلى المستوى التالي، نحن بحاجة إلى تطوير القدرة على السيطرة على المسألة النشطة محليا. نحن نقدم طريقة سهلة الاستخدام لا تتطلب تعديل السائل النشط.
ولا الحاجة إلى تعديل المسار البصري للمجهر لتحقيق السيطرة المحلية من السائل النشط. ويمكن تطبيق أسلوبنا على مجموعة واسعة من النظم حيث ردود الفعل الرئيسية طاعة القانون الخاطئ مثل المقايسة مزلقة ميكروتيبول أو النظم القائمة على الإنزيم. الإعداد ينطوي على نظام توزيع المياه.
إذا تسربت، يمكن أن تلحق أضرار المياه المجهر. لذلك، قبل اعتماد بروتوكول لدينا، من المهم التأكد من أن النظام هو تسرب مجانا. بروتوكولنا يتطلب تركيب عينة الزجاج على درجة الحرارة.
بينما تصف المخطوطة الإجراء المتصاعد، إلا أنها تفتقر إلى التفاصيل الميكانيكية مثل تأمين العينة إلى المرحلة. مما يدل على الإجراء ، سيكون تيجان بات ، إدوارد جارفيس ، وميغان فارني. تيجان وإدوارد هما من طلاب الدراسات العليا، وميغان طالبة جامعية من مختبر.
لإعداد السوائل النشطة في أنبوب إبندورف، مزيج 16 نقطة سبعة ميكرولترات من ثمانية ملليغرام لكل ملليلتر ميكروتوبولس مع ست نقاط سبع ميكرولترات من نقطة واحدة ثماني مجموعات المحركات ميكرومولور، ونقطة واحدة ميكرولترات واحدة من 500 ملليمولار DTT في M2B عالية الملح. حزمة microtubules عن طريق إضافة 11 نقطة أربعة ميكرولترات من سبعة في المئة الوزن من قبل غليكول البولي ايثيلين الوزن. ثم تفعيل محركات kinesin بإضافة نقطتين ثماني ميكرولترات من 50 ملليمولار ATP.
الحفاظ على تركيزات ATP بإضافة نقطتين ثماني ميكرولترات من الأسهم بيروفات كيناز / لاكتات dehydrogenase، و 13 نقطة ثلاثة ميكرولترات من 200 ملليمولار فوسفينول بيروفات. تقليل تأثير تبييض الصورة عن طريق إضافة 10 ميكرولترات من 20 ملليمولار ترولوكسي، نقطة واحدة ميكرولتر من ثلاث نقاط خمس ملليغرام لكل ملليلتر كاتالاسي، نقطة واحدة ميكرولترر واحد من 20 ملليلتر الجلوكوز في أوكسيديز، ونقطة واحدة ميكرولترات واحدة من 300 ملليغرام لكل ملليلتر الجلوكوز. تتبع حركة السائل عن طريق إضافة نقطة واحدة ستة ميكرولترات من صفر نقطة صفر اثنين خمسة في المئة حجم من حجم حجم المقتفي.
أضف M2B عالي الملح لتحقيق حجم إجمالي قدره 100 ميكرولترات. بعد ذلك ، شطف شريحة زجاجية مغلفة من البولياكريلاميد وزلة الغطاء مع ماء DI. جففي النظارات بالهواء المضغوط.
ضع النظارات على سطح نظيف ومسطحة. قطع قناة عرض ثلاثة ملليمترات في فيلم الشمع. العرض الإجمالي هو نفس العرض مثل زلة الغطاء الزجاجي في 20 ملليمتر.
أدخل الشمع بين الشريحة وشريحة الغطاء لتشكيل قناة خلية تدفق للسوائل. التمسك الزجاج إلى فيلم الشمع عن طريق وضع مجمع الشمع الزجاجي على لوحة ساخنة 80 درجة مئوية لإذابة الشمع. أثناء الذوبان، اضغط على الغطاء زلة بلطف مع طرف ماصة لتمسك بشكل موحد فيلم الشمع إلى الأسطح الزجاجية.
بعد التصاق، تبريد مجمع الزجاج إلى درجة حرارة الغرفة. قم على الفور بتحميل السوائل النشطة المعدة إلى قناة التدفق مع طرف الماصات بزاوية بعيدة عن فتحة القناة وعلى اتصال بسطح الشريحة الزجاجية. ختم القناة مع الغراء الأشعة فوق البنفسجية.
بعد بناء إعداد التحكم في درجة الحرارة، ضع عينة السوائل النشطة على سطح الياقوت مع جانب الشريحة الذي يتصل بالسطح. تأمين الشريحة الزجاجية مع الشريط الورقي. باستخدام الشريط النحاسي، قم بتوصيل ThermoSensor بسطح زلة الغطاء.
لتركيب الإعداد على مرحلة المجهر، مع الانزلاق زلة الغطاء التي تواجه نحو الأهداف، وتأمين الإعداد مع المشابك الإبرة مرحلة المجهر. بدوره على وحدة تحكم درجة الحرارة ومضخات خزان السمك. اتبع دليل المصنعين لتعيين درجة الحرارة المستهدفة.
تمكين التحكم في درجة الحرارة. وسجل بيانات درجة الحرارة ThermoSensor. صورة العينة مع فاصل زمني ثابت على المجهر الفلورسنت مجهزة مكعب مرشح GFP لرصد جزيئات التتبع اليكسا 488 المسمى في المزيج النشط.
ضبط الفاصل الزمني للسماح للتتبع إزاحة بين الإطارات لتكون ضمن تسعة بكسل. بالنسبة لمتتبعي التصوير الذين يتحركون بسرعة 10 ميكرومتر في الثانية، باستخدام هدف أربع مرات، يوصى بأن يكون الفاصل الزمني من ثانية إلى خمس ثوانٍ. حفظ الصور كملفات TIF، وتسمية الملفات استناداً إلى رقم الإطار، وتخزينها في مجلد منفصل.
لهذا kinesin يحركها microtubule تعتمد على السوائل النشطة ، تم التحكم في درجة الحرارة في 10 ، 20 ، 30 ، و 40 درجة مئوية. وكان التذبذب في درجة الحرارة في حدود نقطة الصفر من نقطة واحدة إلى صفر ثلاث درجات مئوية لمدة أربع ساعات مما يدل على استقرار وموثوقية هذا الإعداد التحكم في درجة الحرارة. تم تصوير أجهزة التتبع كل ثانيتين ، وهو ما سمحت به الصور المتتالية لتتبع مسارات التتبع.
متوسط السرعات التي تقاس من 20 إلى 36 درجة مئوية، ويبدو أن الوقت تقريبا مستقلة في صفر إلى ساعتين. حيث في 10 و 40 درجة مئوية، وسرعات متوسط تتحلل بسرعة الناجمة عن depolymerization microtubule أقل من 16 درجة مئوية ومجموعات kinesin خلل فوق 36 درجة مئوية على التوالي. عندما كانت درجات حرارة النظام تتناوب بين 20 و 30 درجة مئوية كل 30 دقيقة ، لم يتسارع متوسط سرعة السوائل النشطة ويتباطأ فقط وفقًا لذلك ، بل استجاب أيضًا لتغير درجة الحرارة في غضون 10 ثوانٍ.
تبدأ السوائل النشطة في التعطل، عندما تبرد تحت 16 أو تدفأ فوق 36 درجة. حتى عند التلاعب تحكم درجة الحرارة، وضمان درجة الحرارة بين 16 و 36 درجة. القدرة على ضبط السوائل النشطة محليا، يسمح لتوجيه قوة السوائل مثل تسليم البضائع من النقطة ألف إلى النقطة باء أو تطوير جهاز microfluidity التي لا تتطلب صمام المادية.
الأكريلاميد المستخدمة لمعطف الأواني الزجاجية هو سم عصبي يمكن أن تمتص من خلال الجلد. ارتدي معدات الحماية المناسبة مثل القفازات ومعاطف المختبرات ونظارات السلامة لتقليل المخاطر.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
نظرة عامة
يُظهر هذا البروتوكول طريقة للتحكم في سرعات تدفق الموائع النشطة ثلاثية الأبعاد باستخدام درجة الحرارة. يسمح هذا النهج بتنظيم وضبط سرعات التدفق في الموقع.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- المادة النشطة
- ديناميات الموائع
- تقنيات الفحص المجهري
الخلفية
- تمتلك المادة النشطة تطبيقات في مختلف المجالات، بما في ذلك الظلال الجزيئية.
- التحكم المحلي في الموائع النشطة ضروري لتطوير هذه التطبيقات.
- لا تتطلب هذه الطريقة تعديلات على المادة النشطة.
- كما تتجنب تغييرات في المسار البصري للمنظار.
هدف الدراسة
- تطوير طريقة بسيطة للتحكم المحلي في الموائع النشطة.
- تحسين قابلية استخدام المادة النشطة في التطبيقات العلمية.
- توفير نهج متعدد الاستخدامات يمكن تطبيقه على أنظمة مختلفة.
الطرق المستخدمة
- تنفيذ نظام تداول الماء.
- تلاعب في درجة الحرارة للتحكم في سرعات التدفق.
- تطبيق الأسلوب على الأنظمة التي تتبع القانون الخاطئ.
- استخدامه في اختبارات انزلاق الأنابيب الدقيقة والأنظمة المستندة إلى الإنزيمات.
النتائج الرئيسية
- تنظيم ناجح لسرعة التدفق في الموقع.
- تحكم ديناميكي في سرعات التدفق تحقق من خلال تعديلات درجة الحرارة.
- طريقة قابلة للتطبيق على مجموعة واسعة من أنظمة المادة النشطة.
- لا حاجة لإجراء تعديلات على المادة النشطة أو إعداد المنظار.
الاستنتاجات
- يقدم البروتوكول نهجًا مباشرًا للتحكم في الموائع النشطة.
- يعزز التطبيقات المحتملة للمادة النشطة في البحث.
- قد تؤدي هذه الطريقة إلى تطورات في مختلف المجالات العلمية.
الأسئلة المتداولة
Executive Industry Relevance
Temperature-dependent control of microtubule-based active fluids enables tunable flow rates without physical valves, supporting dynamic microfluidic device design. This approach enhances predictive confidence in active matter systems by leveraging Arrhenius kinetics for reproducible speed modulation. The method reduces experimental variability and supports scalable assay development for target validation and phenotypic screening workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of motor protein function under controlled thermal conditions to validate kinesin-microtubule interactions as therapeutic targets.
- Operational Value: Provides a tunable, reagent-free system for assessing target engagement and pathway modulation in real time.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by correlating temperature-dependent flow changes with motor protein activity, informing lead identification decisions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, temperature-dependent flow speed readouts (4–8 µm/s) suitable for high-content screening of compound libraries.
- Operational Value: Enables assay standardization through precise thermal control, improving reproducibility across replicates and laboratories.
- Scalability: Supports microfluidic integration for parallel compound testing without valve-based flow regulation, reducing device complexity.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Maintains physiological relevance by operating within 16–36°C range, aligning with mammalian thermal stability for target proteins.
- Preclinical Modeling: Facilitates disease-relevant system evaluation by simulating thermal stress conditions on cytoskeletal dynamics.
- Risk-Adjusted Advancement: Allows dynamic perturbation studies to assess compound effects on motor protein function under varying thermal profiles.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by providing a tunable biophysical readout that complements biochemical and imaging-based assays for target validation and lead optimization.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of motor protein inhibitors or activators through real-time flow speed modulation.
- Screening: Delivers quantitative, temperature-dependent outputs that enable dose-response analysis and hit confirmation in active matter-based assays.
- Analytics: Provides continuous, trackable tracer displacement data enabling statistical comparison of conditions and compound effects.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by modeling thermal sensitivity of cytoskeletal systems relevant to neurodegenerative and cancer targets.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for active matter characterization across multiple projects, reducing redevelopment costs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target validation confidence through direct, real-time measurement of motor protein-driven dynamics.
- Operational Value: Enhances reproducibility via precise thermal control, minimizing batch-to-batch variability in active fluid preparations.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making by enabling rapid, reversible perturbation of target systems without sample remake.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by quantifying target engagement under physiologically relevant thermal fluctuations.
Implementation Considerations
- Requires expertise in active matter preparation, microscopy, and thermal control systems.
- Needs a stable temperature stage with water circulation and leak-proof sealing to prevent microscope damage.
- Demands standardization of sample loading and sealing protocols across users for consistent results.
- Requires adaptation considerations for different tracer particles or surface coatings when scaling to other active matter systems.
- Limited by the 16–36°C operational window due to microtubule depolymerization and motor protein denaturation outside this range.
