التحكم في سرعات تدفق السوائل النشطة ثلاثية الابعاد المستندة إلى Microtubule باستخدام درجه الحرارة

وقد استخدمت المادة النشطة في تطبيقات مختلفة مثل الظلال الجزيئية. لتحقيق التطبيق إلى المستوى التالي، نحن بحاجة إلى تطوير القدرة على السيطرة على المسألة النشطة محليا. نحن نقدم طريقة سهلة الاستخدام لا تتطلب تعديل السائل النشط.

ولا الحاجة إلى تعديل المسار البصري للمجهر لتحقيق السيطرة المحلية من السائل النشط. ويمكن تطبيق أسلوبنا على مجموعة واسعة من النظم حيث ردود الفعل الرئيسية طاعة القانون الخاطئ مثل المقايسة مزلقة ميكروتيبول أو النظم القائمة على الإنزيم. الإعداد ينطوي على نظام توزيع المياه.

إذا تسربت، يمكن أن تلحق أضرار المياه المجهر. لذلك، قبل اعتماد بروتوكول لدينا، من المهم التأكد من أن النظام هو تسرب مجانا. بروتوكولنا يتطلب تركيب عينة الزجاج على درجة الحرارة.

بينما تصف المخطوطة الإجراء المتصاعد، إلا أنها تفتقر إلى التفاصيل الميكانيكية مثل تأمين العينة إلى المرحلة. مما يدل على الإجراء ، سيكون تيجان بات ، إدوارد جارفيس ، وميغان فارني. تيجان وإدوارد هما من طلاب الدراسات العليا، وميغان طالبة جامعية من مختبر.

لإعداد السوائل النشطة في أنبوب إبندورف، مزيج 16 نقطة سبعة ميكرولترات من ثمانية ملليغرام لكل ملليلتر ميكروتوبولس مع ست نقاط سبع ميكرولترات من نقطة واحدة ثماني مجموعات المحركات ميكرومولور، ونقطة واحدة ميكرولترات واحدة من 500 ملليمولار DTT في M2B عالية الملح. حزمة microtubules عن طريق إضافة 11 نقطة أربعة ميكرولترات من سبعة في المئة الوزن من قبل غليكول البولي ايثيلين الوزن. ثم تفعيل محركات kinesin بإضافة نقطتين ثماني ميكرولترات من 50 ملليمولار ATP.

الحفاظ على تركيزات ATP بإضافة نقطتين ثماني ميكرولترات من الأسهم بيروفات كيناز / لاكتات dehydrogenase، و 13 نقطة ثلاثة ميكرولترات من 200 ملليمولار فوسفينول بيروفات. تقليل تأثير تبييض الصورة عن طريق إضافة 10 ميكرولترات من 20 ملليمولار ترولوكسي، نقطة واحدة ميكرولتر من ثلاث نقاط خمس ملليغرام لكل ملليلتر كاتالاسي، نقطة واحدة ميكرولترر واحد من 20 ملليلتر الجلوكوز في أوكسيديز، ونقطة واحدة ميكرولترات واحدة من 300 ملليغرام لكل ملليلتر الجلوكوز. تتبع حركة السائل عن طريق إضافة نقطة واحدة ستة ميكرولترات من صفر نقطة صفر اثنين خمسة في المئة حجم من حجم حجم المقتفي.

أضف M2B عالي الملح لتحقيق حجم إجمالي قدره 100 ميكرولترات. بعد ذلك ، شطف شريحة زجاجية مغلفة من البولياكريلاميد وزلة الغطاء مع ماء DI. جففي النظارات بالهواء المضغوط.

ضع النظارات على سطح نظيف ومسطحة. قطع قناة عرض ثلاثة ملليمترات في فيلم الشمع. العرض الإجمالي هو نفس العرض مثل زلة الغطاء الزجاجي في 20 ملليمتر.

أدخل الشمع بين الشريحة وشريحة الغطاء لتشكيل قناة خلية تدفق للسوائل. التمسك الزجاج إلى فيلم الشمع عن طريق وضع مجمع الشمع الزجاجي على لوحة ساخنة 80 درجة مئوية لإذابة الشمع. أثناء الذوبان، اضغط على الغطاء زلة بلطف مع طرف ماصة لتمسك بشكل موحد فيلم الشمع إلى الأسطح الزجاجية.

بعد التصاق، تبريد مجمع الزجاج إلى درجة حرارة الغرفة. قم على الفور بتحميل السوائل النشطة المعدة إلى قناة التدفق مع طرف الماصات بزاوية بعيدة عن فتحة القناة وعلى اتصال بسطح الشريحة الزجاجية. ختم القناة مع الغراء الأشعة فوق البنفسجية.

بعد بناء إعداد التحكم في درجة الحرارة، ضع عينة السوائل النشطة على سطح الياقوت مع جانب الشريحة الذي يتصل بالسطح. تأمين الشريحة الزجاجية مع الشريط الورقي. باستخدام الشريط النحاسي، قم بتوصيل ThermoSensor بسطح زلة الغطاء.

لتركيب الإعداد على مرحلة المجهر، مع الانزلاق زلة الغطاء التي تواجه نحو الأهداف، وتأمين الإعداد مع المشابك الإبرة مرحلة المجهر. بدوره على وحدة تحكم درجة الحرارة ومضخات خزان السمك. اتبع دليل المصنعين لتعيين درجة الحرارة المستهدفة.

تمكين التحكم في درجة الحرارة. وسجل بيانات درجة الحرارة ThermoSensor. صورة العينة مع فاصل زمني ثابت على المجهر الفلورسنت مجهزة مكعب مرشح GFP لرصد جزيئات التتبع اليكسا 488 المسمى في المزيج النشط.

ضبط الفاصل الزمني للسماح للتتبع إزاحة بين الإطارات لتكون ضمن تسعة بكسل. بالنسبة لمتتبعي التصوير الذين يتحركون بسرعة 10 ميكرومتر في الثانية، باستخدام هدف أربع مرات، يوصى بأن يكون الفاصل الزمني من ثانية إلى خمس ثوانٍ. حفظ الصور كملفات TIF، وتسمية الملفات استناداً إلى رقم الإطار، وتخزينها في مجلد منفصل.

لهذا kinesin يحركها microtubule تعتمد على السوائل النشطة ، تم التحكم في درجة الحرارة في 10 ، 20 ، 30 ، و 40 درجة مئوية. وكان التذبذب في درجة الحرارة في حدود نقطة الصفر من نقطة واحدة إلى صفر ثلاث درجات مئوية لمدة أربع ساعات مما يدل على استقرار وموثوقية هذا الإعداد التحكم في درجة الحرارة. تم تصوير أجهزة التتبع كل ثانيتين ، وهو ما سمحت به الصور المتتالية لتتبع مسارات التتبع.

متوسط السرعات التي تقاس من 20 إلى 36 درجة مئوية، ويبدو أن الوقت تقريبا مستقلة في صفر إلى ساعتين. حيث في 10 و 40 درجة مئوية، وسرعات متوسط تتحلل بسرعة الناجمة عن depolymerization microtubule أقل من 16 درجة مئوية ومجموعات kinesin خلل فوق 36 درجة مئوية على التوالي. عندما كانت درجات حرارة النظام تتناوب بين 20 و 30 درجة مئوية كل 30 دقيقة ، لم يتسارع متوسط سرعة السوائل النشطة ويتباطأ فقط وفقًا لذلك ، بل استجاب أيضًا لتغير درجة الحرارة في غضون 10 ثوانٍ.

تبدأ السوائل النشطة في التعطل، عندما تبرد تحت 16 أو تدفأ فوق 36 درجة. حتى عند التلاعب تحكم درجة الحرارة، وضمان درجة الحرارة بين 16 و 36 درجة. القدرة على ضبط السوائل النشطة محليا، يسمح لتوجيه قوة السوائل مثل تسليم البضائع من النقطة ألف إلى النقطة باء أو تطوير جهاز microfluidity التي لا تتطلب صمام المادية.

الأكريلاميد المستخدمة لمعطف الأواني الزجاجية هو سم عصبي يمكن أن تمتص من خلال الجلد. ارتدي معدات الحماية المناسبة مثل القفازات ومعاطف المختبرات ونظارات السلامة لتقليل المخاطر.