القياس الكمي للخلايا التكاثرية والميتة في Enteroids

هذا البروتوكول مفيد لعزلة المعوية في ثقافة بالإضافة إلى التحقيق في انتشار الخلايا والبقاء في المعويات. يمكن للعلماء تطبيق هذه التقنية على الأمعاء الثقافية ودراسة تأثير الأدوية والسيتوكينات الالتهابية على الخلايا الظهارية المعوية في المختبر. الآثار المترتبة على هذه التقنية تمتد إلى العلاج بالماء من مرض التهاب الأمعاء.

نحن تطبيق هذه الطريقة في العثور على بعض السيتوكينات العلاجية. توفر هذه الطريقة رؤى في انتشار الظهارية المعوية والبقاء على قيد الحياة؛ بالإضافة إلى أنه يمكن استخدامها أيضًا في العضيات، المستزرعة حول أنسجة أخرى غير الأمعاء. لعزل السجود المعوية وأداء ثقافة الأمعاء ، استخدم ملقط الأنسجة والعثور على مقص القزحية لتشريح ما يقرب من ثمانية سنتيمترات من الايلوم من فأر من النوع البري عمره ثمانية أسابيع.

استخدام حقنة مع إبرة تغذية gavage لطرد الايلوم مع حوالي 40 ملليلتر من الجليد الباردة Dulbecco الفوسفات المخزنة على المياه المالحة، ثم قطع بالطول مع مقص وفتح الايلوم. قطع الايلوم إلى قطع صغيرة ووضعها في خمسة ملليلتر من الجليد العقيم الباردة DPBS في أنبوب مخروطي 15 ملليلتر. ثم صخرة العينة لمدة خمس دقائق على الجليد.

استخدام وحدة تحكم ماصة لpirate DPBS واستبداله مع 10 ملليلتر من المخزن المؤقت الباردة واحد. بعد هزاز لمدة 30 دقيقة على الجليد، واستخدام وحدة تحكم ماصة لpirate العازلة واحدة واستبدالها مع 10 ملليلتر من العازلة الباردة اثنين. ثم يهز لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق باليد في ما يقرب من 80 يهز في الدقيقة الواحدة.

بعد الاهتزاز، تفقد قطرات لتر صغير عشرين من العازلة اثنين من المحتويات تحت المجهر لضمان وجود سردابات مع الخلايا بانيث الحبيبية. تصفية العازلة اثنين من المحتويات مع مصفاة خلية معقم 70 ميكرون وجمع العازلة المصفاة في أنبوب مخروطي 50 ملليلتر. ماصة 20 ميكرولترات من الترشيح على الشريحة لحساب سردابات.

نقل كمية كافية من المخزن المؤقت المصفاة اثنين من المحتويات لضمان وجود ما يقرب من 500 خفي في البئر. تدور أسفل في 150 مرات G لمدة 10 دقائق في أربع درجات مئوية، ومن ثم الطامح بعناية ونافر. Resuspend السردابات في 50 ميكرولترات من مصفوفة غشاء الطابق السفلي لكل 500 سرداب.

الماصات صعودا وهبوطا مع الحرص على تجنب فقاعات. وضع 50 ميكرولتر قطرة من مصفوفة غشاء الطابق السفلي ومزيج سرداب في وسط بئر واحدة من 24 لوحة جيدا. احتضان لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية لتبليمرة مصفوفة غشاء الطابق السفلي.

بعد 30 دقيقة من البلمرة، قم بإضافة 600 ميكرولترات بعناية من وسائط minigut إلى كل بئر. أعيدوا اللوحة إلى الحاضنة التي تبلغ 37 درجة مئوية، ولاحظوا تحت المجهر كل يوم، وتغيير وسائل الإعلام كل يومين إلى ثلاثة أيام. لتمرير البايويدات، ضع لوحة زراعة الأنسجة على الجليد، وتشعّر الوسائط، وأضف ملليلترًا واحدًا من DPBS الباردة إلى كل بئر.

استخدام نصيحة P1000 إلى ماص صعودا وهبوطا حتى لا تبقى قطع مصفوفة. مرر العينة من خلال حقنة الأنسولين ملليلتر واحدة وننزل إلى أنبوب مخروطي 15 ملليلتر. بعد الغزل لأسفل لمدة خمس دقائق في 150 مرة G وأربع درجات مئوية، واستخدام ماصة لإزالة DPBS.

إعادة تعليق الoidoids في 50 ميكرولترات من مصفوفة غشاء الطابق السفلي في بئر. ضع الطبق في الحاضنة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة للسماح لمصفوفة غشاء الطابق السفلي بالمبلمر. ثم، تراكب كل بئر مع 600 ميكرولترات من وسائل الإعلام ENR والعودة لوحة إلى الحاضنة.

تنمو الـoidoids لمدة خمسة إلى سبعة أيام قبل تمريرها إلى لوحة جديدة 24 بئرًا باستخدام نسبة تقسيم من واحد إلى اثنين. إضافة 600 ميكرولترات من ENR المتوسطة لكل بئر، ومن ثم احتضان المعوي لمدة أربعة إلى خمسة أيام في حاضنة 37 درجة مئوية. إعداد مجموعة التحكم من الoids غير المعالجة والمجموعة التجريبية من الـoidoids المعالجة بخمسة نانوجرامات لكل ملليلتر من interleukin-22.

تحضير على الأقل ثلاثة نسخ متماثلة لكل مجموعة. إضافة 600 ميكرولترات من EdU المتوسطة لكل بئر من البيوoidoids باستثناء بئر واحد لاستخدامها كتحكم سلبي للطرح الخلفية. احتضان لوحة لمدة ساعتين في حاضنة 37 درجة مئوية.

لحصاد البيوويدات من مصفوفة الغشاء الطابق السفلي، استخدم وحدة تحكم ماصة لpirate المتوسطة EdU وغسل مرة واحدة مع DPBS. ثم إضافة ملليلتر واحد من DPBS. استخدام P1000 ماصة تلميح إلى ماص صعودا وهبوطا حتى لا تبقى قطع مصفوفة غشاء الطابق السفلي الصلبة.

نقل العينة إلى أنبوب 15 ملليلتر وتدور في 300 مرة G لمدة خمس دقائق قبل التخلص من افر. إضافة 500 ميكرولترات من إنزيمات تفكك الخلايا واحتضان لمدة 15 دقيقة في 37 درجة مئوية. ثم استخدام P200 ماصة تلميح إلى ماص صعودا وهبوطا وكسر enteroids في خلايا واحدة.

بعد ذلك، أضف ثلاثة ملليلترات من متوسط النسر المعدل في دولبيككو الذي يحتوي على مصل الأبقار الجنيني بنسبة 10٪، والماصات بشكل متكرر مع طرف P1000 ماصة. بعد الطرد المركزي في 300 مرة G لمدة خمس دقائق، وpirating نابيرينت، ونحن تعليق الخلايا في ملليلتر واحد من DPBS. لتنفيذ التثبيت و Permeabilization الخلايا، أولا نقل تعليق الخلية إلى نقطة واحدة أنبوب خمسة ملليلتر، تدور في 300 مرة G لمدة خمس دقائق، والتخلص من supernatant.

نحن نعلق الخلايا في ملليلتر واحد من 4٪ شبهformaldehyde وإصلاح لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد الطرد المركزي في 300 مرة G لمدة خمس دقائق، pirnatate فائقة مع طرف ماصة. اغسل الخلايا مرة واحدة مع DPBS ، وتدور مرة أخرى لإزالة افراط.

Resuspend الخلايا مع ملليلتر واحد من 0.5٪ غير الأيونيك السطحي، واحتضان لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة قبل غسل الخلايا مع DPBS كما كان من قبل. للكشف عن EdU، أضف 100 ميكرولترات من كوكتيل التفاعل إلى كل أنبوب 1.5 ملليلتر. إعادة تعليق الخلايا، وحمايتها من الضوء، احتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

بعد الطرد المركزي في 300 مرة G لمدة خمس دقائق، بلطف الطامح حل رد الفعل مع تلميح ماصة إضافة 0.5٪ غير الأيونية المرنطي السطحي إلى كل أنبوب لغسل مرة واحدة في درجة حرارة الغرفة. بعد الطرد المركزي كما كان من قبل، ونحن تعليق الخلايا في ملليلتر واحد من DPBS. تصفية الخلايا resuspended مع مصفاة 40 ميكرون وجمع الخلايا المصفاة في أنبوب مخروطي 15 ملليلتر.

أداء الحقائق على كشف الجهاز في أقرب وقت ممكن. حدد القناة المناسبة والجهد لتحليل تدفق cytometry. لاستراتيجية الغوات، رسم FSC-A مقابل مؤامرة SSC-A pseudocolor وتوزيع معظم الخلايا إلى النطاق المرئي من خريطة نقطة عن طريق ضبط الجهد.

حدد مجموعة الخلايا كـ R1 وقم باستبعاد حطام الخلية في الزاوية اليسرى السفلية. من مجموعة الخلايا R1، إنشاء مؤامرة FSC-A مقابل FSC-H pseudocolor. تعيين البوابة لتحديد الخلايا الفردية المعينة كـ R2 واستبعاد كتل الخلية.

من مجموعة الخلايا R2، إنشاء كثافة الفلوريسين مقابل مؤامرة رقم الخلية واستخدام السيطرة السلبية لتعيين البوابة. منطقة إشارة الفلورسنت هي منطقة خلية إيجابية عينت R3.Compare نسبة هذه الخلايا الإيجابية EDU بين المجموعات التجريبية والتحكم. تم عزل واكريات معوية صغيرة واستزراعها كـoidoids في مصفوفة غشاء الطابق السفلي.

بدأت المعوية في تشكيل براعم بعد يومين من العزل. في اليوم السادس، كان للـoidoids العديد من البراعم مع الكثير من الحطام في التجويف. كانت الـ "المعويات" جاهزة للمرور في هذه المرحلة.

تم التعامل مع البيوoids مع IL-22 لمدة 3 أيام، وبعد ذلك تم تسمية الحمض النووي الاصطناعية مع EdU باللون الأحمر للإشارة إلى انتشار الخلايا. IL-22 البيوoids المعالجة عرض عدد متزايد من الخلايا الإيجابية EdU. زادت خلايا التكاثر IL-22 من 40.1٪ إلى 83.5٪ كما تم تحليلها بواسطة قياس التدفق.

كما زاد علاج IL-22 موت الخلية في الـoidoids المشار إليها بواسطة مادة يوديد البروديم التي تلطخ باللون الأحمر. زادت IL-22 الخلايا الميتة من 4.9٪ إلى 16.2٪ كما تم تحليلها بواسطة عملية استئصال الخلايا المتدفقة. خلال العزلة سرداب التقدم عادلة تهتز هناك حاجة بعد إضافة العازلة لضمان اهتزاز ما يكفي من سردابات إلى أسفل.

ننصح بفحص المحتويات تحت المجهر. بعد هذا الإجراء، يمكننا أيضا تحديد أنواع الظهارية المختلفة والأمعاء باستخدام محدد هذه الطريقة سوف تساعد الباحثين على التحقيق في التمايز الظهارية المعوية في الاياء. بعد تطورها هذا السؤال يمهد الطريق للباحثين في مجال أمراض الجهاز الهضمي لاستكشاف الأسئلة التنموية أو المرضية في خفض.