القياس الكمي لالتصاق خلايا الورم في أقسام التبريد في العقدة الليمفاوية

أكثر المواقع شيوعاً للانبثاث هي العقد اللمفاوية الأصلية. يمكن استخدام الوماتيكس للكشف عن تقارب لاصق بين الخلايا السرطانية'اللمفية أقسام العقدة في المختبر. إحدى مزايا هذه التقنية هي أن أقسام العقدة الليمفاوية الطازجة توفر تعقيدًا طبيعيًا للأنسجة الأصلية ، والتي لن يكون من الممكن إعادة إنشائها باستخدام البروتينات النقية.

يمكن أن تكون هذه الطريقة مفيدة لدراسات الأورام الجزيئية التي تسعى إلى تحديد الجينات أو العلاجات التي تتداخل مع الالتصاق الخلايا السرطانية في الأعضاء المستهدفة النقيلي، مثل الغدد الليمفاوية. لحصاد الغدد الليمفاوية في غضون ثلاثين دقيقة من التضحية، ضع فأر ويستار البالغ في إعادة شغل الظهر على لوحة تشريح نظيفة في درجة حرارة الغرفة ورش الفراء مع 70٪ من الكحول isopropyl. باستخدام أدوات تعقيم، ورفع جلد البطن وجعل شق الجلد الوسط لفضح الأحشاء البطن.

استخراج الأمعاء حتى تصبح الغدد الليمفاوية الصدرية والبطن مرئية. باستخدام مقص طرف حاد، مكوس بعناية العقد الليمفاوية دون إصابة الشريان الرئيسي المتم العليا الكامنة، ووضع العقدة الليمفاوية في أنبوب 15 مل تحتوي على 5 مل من برنامج تلفزيوني عقيم. عندما تم حصاد جميع الغدد الليمفاوية، ضع عقدة ليمفاوية واحدة لكل وجه cryomold أسفل على قاعدة كل قالب وإضافة فقط ما يكفي من متوسط درجة الحرارة المثلى لقطع لتغطية الأنسجة.

بعد التجمد المفاجئ، استخدم جهاز التبريد للحصول على 5 إلى 8 ميكرومتر سميكة في 22 درجة مئوية وجمع المقاطع على الشرائح المجهر الزجاجي. تعتبر عمليات الخبس ذات الجودة الجيدة من شرائح متتالية من العقدة الليمفاوية نفسها أمرًا حاسمًا لتقليل الاختلافات بين الشرائح ، وتسهيل معدلات التصاق الخلايا المتسقة. بالنسبة لوضع العلامات على الخلايا السرطانية، حصد الخلايا ذات الاهتمام من ثقافة الخلايا التي تم تنظيمها بشكل مناسب وإعادة تعليق الخلايا عند 1 × 10 إلى 6 خلايا لكل تركيز mL ووسيلة خالية من المصل.

نقل 1 مل من الخلايا في أنبوب جديد مخروطي 15 مل وتسمية الخلايا مع 2 ميكروغرام لكل mL DiI (C18) لمدة عشر دقائق في 37 درجة مئوية، مع التحريض لطيف في خمس دقائق لتجنب ترسب الخلايا. في نهاية الحضانة، بيليه الخلايا عن طريق الطرد المركزي وغسل الخلايا المسمى مرتين مع 10 مل من مصل جديد خال من المصل لإزالة أي صبغة زائدة. بعد الغسيل الثاني، إعادة تعليق الخلايا في 1 × 10 إلى 6 خلايا لكل مل من المتوسطة خالية من المصل، وتستكمل مع 0.1٪ تركيز مصل الأبقار.

دعوى من الخلايا السرطانية المسمى على أقسام الأنسجة العقد الليمفاوية المحصودة، غسل بلطف المقاطع مرتين في برنامج تلفزيوني، تليها إعادة الترطيب في برنامج تلفزيوني جديد لمدة خمسة عشر دقيقة في درجة حرارة الغرفة. في نهاية الحضانة، كتلة أي ربط غير محددة مع 2.5٪ البوم الدم البقري لمدة ثلاثين دقيقة في 37 درجة مئوية، قبل استخدام مسحة القطن لتجفيف الشرائح. استخدام قلم مبيد للماء لرسم حاجز حول كل قسم وإضافة 100 ميكرولترات من الخلايا المسمى على كل عقدة اللمفية المحاصرة.

بعد ساعة إلى ساعتين في 37 درجة مئوية في غرفة مرطبة، وإزالة أي خلايا عدم الالتزام مع أربعة يغسل لطيف في برنامج تلفزيوني وإصلاح خلايا الفلورسينس المتمسك المتبقية مع 3.7٪ الفورمالديهايد في برنامج تلفزيوني لمدة خمس عشرة دقيقة في درجة حرارة الغرفة. للحصول على تحديد كمي لمؤشر لاصق، استخدم الهدف 10x على المجهر المفلور للحصول على صور TIFF الفردية من كل قسم في حقول الفلورسنت مشرق وأحمر. ثم، اسم وحفظ الصور بشكل منهجي قبل فتح الصور في فيجي.

بعد وضع الجدول، استخدم أداة المضلع لتحديد المنطقة ذات الأهمية التي سيتم تحديدها كمياً. حدد لتحديد منطقة العقدة الليمفاوية. وسيتم التعبير عن البيانات في ملليمتر مربع.

بعد ذلك، حدد الإضافات، تحليل، عداد الخلية وانقر على الصورة ليتم تحديدها كميا. انقر فوق تهيئة وحدد نوع العداد. ثم، انقر على الخلايا في الصورة.

وسيتم التعبير عن مؤشر الالتصاق العقدة الليمفاوية كرقم الخلايا السرطانية التي تُلتَكِن بها في منطقة العقدة الليمفاوية المغطاة. لتهيئة الصورة التالية، افتح الصورة التالية وكرر القياس الكمي كما هو موضح. كما لوحظ، يتم تقريب مورفولوجيا الخلايا المنضمة في الشكل، وتنتشر الخلايا غير متجانسة في جميع أنحاء العقدة الليمفاوية من الفائدة.

مؤشر الالتصاق العقدة الليمفاوية هو اثنين إلى ثلاثة أضعاف أعلى في خطوط خلايا سرطان الثدي السلبية NDRG4، مقارنة بتلك التي تقاس للخلايا الإيجابية NDRG4 المقابلة. يمكن تكييف هذا الإجراء للمساعدة في معدلات الالتصاق في الأنسجة المستهدفة النقيلي الأخرى، مثل الدماغ أو الرئتين، لتقييم المواقع التفضيلية الثانوية للتصاق الخلايا السرطانية الملقحة. تذكر أن كلا من الأنسجة الطازجة والمجمدة ينبغي النظر في مخاطرة بيولوجية وينبغي التعامل معها باستخدام الاحتياطات المناسبة للسلامة البيولوجية.