A الكمي الفلورية المجهري القائم علي فحص ليبوسوم واحد للكشف عن التجانس التركيبي بين الجسيمات الشحمية الفردية

معظم البحوث مع liposomes تعتمد على تقنيات جريئة في جوهرها على افتراض جميع liposomes لتكون متطابقة. من خلال دراسة الدهنيات واحدة، يمكن ملاحظة تشوهات كبيرة. تسمح لنا تقنية الليبوسومات الوحيدة المعروضة هنا بدراسة مئات الليبوزومات في وقت واحد واكتشاف التشوهات في حجمها وتكوينها.

يمكن بسهولة تعديل هذه الطريقة لدراسة أنظمة أخرى على مستوى واحد من الدهون مثل التفاعلات غشاء البروتين. كل ما تحتاجه هو المركب الذي تدرسه ليتم تصنيفه بفلورسنت. مع هذا الفيديو، ونحن نقدم للباحثين مع أداة على كيفية إجراء دراسات ليبوسومات واحدة.

نأمل أن يكون من الواضح أن من السهل تعديل الفحص لدراسة مجموعة من الموضوعات العلمية الأخرى. للبدء، مزيج من الأسهم الدهون المعدة 138 ميكرولترات من POPC و 120 ميكرولترات من الكوليسترول في قارورة الزجاج الطازج. ثم إضافة 500 ميكروليتر كل من اثنين من الدهون الفلورسنت المسمى و 50 ميكرولترات من DSPE-PEG-البيوتين.

تخفيف غطاء الزجاج قارورة و المفاجئة تجميد القارورة في النيتروجين السائل لمدة دقيقة إلى دقيقتين. Lyophilize خليط الدهون المجمدة بين عشية وضحاها في مجفف تجميد. في الصباح، إضافة ملليلتر واحد من 200 ميلي متر D-السوربيتول العازلة إلى الدهون الجافة.

سخني الخليط إلى 45 درجة مئوية وتعرّضه للتحريك المغناطيسي لمدة ساعة واحدة على الأقل. ثم تجميد تعليق الدهون عن طريق غمس القارورة في النيتروجين السائل والانتظار حتى يتم تجميد التعليق تماما. بعد ذلك، تراجع التعليق المجمد في حمام التدفئة في 55 درجة مئوية حتى يذوب الخليط تماما.

يعرض الخليط لما مجموعه 11 دورة تجميد ذوبان. بعد ذلك، وذلك باستخدام مجموعة صغيرة من البثق، بثق تعليق liposome مرة واحدة من خلال مرشح البولي كربونات 800 نانومتر. مزيج 1، 200 ميكرولترات من BSA و 120 ميكرولترات من البيوتين BSA.

إضافة 300 ميكرولترات من الخليط إلى كل بئر في شريحة ثمانية بئر واحتضان الشريحة لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. إمالة قليلاً الشريحة ومن حافة كل التعرق جيدا المتوسطة. إضافة على الفور 300 ميكرولترات من العازلة HEPES في كل بئر لغسل.

غسل كل بئر ثماني مرات في المجموع. إضافة 250 ميكرولترات من streptavidin واحتضان لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. كرر الغسلات الثمانية كما سبق وصفها.

ضع الشريحة على المجهر وضبط عصا التحكم المجهرية للتركيز على سطح الغرفة. ويمكن بسهولة القيام بذلك باستخدام زيادة إشارة انعكاس الليزر من واجهة العازلة الزجاج كدليل. في أنبوب microcentrifuge، إضافة 10 ميكرولترات من مخزون liposome المخفف التي تحتوي على 20 الدهون الإجمالية ميكرومولار.

نقل 100 ميكرولترات من العازلة من الغرفة إلى أنبوب microcentrifuge، مزيج بشكل صحيح، ونقل 110 ميكرولترات مرة أخرى إلى الغرفة. وضع الغرفة تحت المجهر واستخدام المجهر بدائية الإعدادية قادرة على الكشف عن إشارة من الفلوروفورات liposomes لمراقبة liposomes يجري شل على السطح. إعداد المجهر كما هو موضح في المخطوطة.

لتصوير كل من DOPE ATTO488 و DOPE ATTO655 فلوريد في liposomes، صورة قنوات متعددة. تأكد من أن كل قناة يتم تصويرها بشكل تسلسلي لتجنب الإثارة المتقاطعة. على سبيل المثال، أولاً تأخذ صورة واحدة من قبل مثيرة في 488 نانومتر وقراءة الانبعاثات في 495 إلى 590 نانومتر.

بعد ذلك ، قم بتغيير الإعدادات واتخاذ صورة أخرى عن طريق مثيرة في 633 نانومتر ولكن قراءة الانبعاثات فقط في 660 إلى 710 نانومتر. تحليل. في قائمة الصور، اختر اللون واستخدم وظيفة قناة الدمج لإنشاء مركب للقنوتين. لاحظ ما إذا كانت الليبوسومات المصوّرة في قناتين مختلفتين تعرض توطينًا مشتركًا جيدًا أو ما إذا كان الانجراف المرئي قد حدث أم لا.

للكشف عن الجسيمات، افتح قائمة المكونات الإضافية، اختر ComDet وانقر على اكتشاف الجسيمات. في ComDet، تحقق من صحة الإعدادات ثم اضغط موافق. بعد تشغيل التحليل، نوافذ منبثقة اثنين مع النتائج وعرض ملخص. يحتوي جدول النتائج على نسبة الكثافة بين القناتين.

تصدير نتائج جدول البيانات التي تحتوي على بيانات الترجمة المشتركة. تناسب الرسم البياني نسبة كثافة مع وظيفة الغاوسية واستخراج الانحراف المتوسط والواس. يمكن استخدام الانحراف المعياري و المتوسط لحساب درجة عدم الاتّاج.

إعداد تركيبة الليبوسومات التي تم بثقها عدة مرات من خلال مرشح نانومتر 50. معايرة حجم liposomes من خلال مقارنة شدة الفلوريسنس إلى حجم البيانات من DLS. مع نفس إعدادات المجهر التجريبي كما كان سابقا، صورة lipوزوes المعايرة.

رسم الرسم البياني كثافة الجذر التربيعي من كثافة الفلوريسنس من lipوزوes المعايرة. تناسب الرسم البياني مع توزيع عادي سجل واستخراج متوسط كثافة الفلورس من lipوزوes معايرة الوسط الهندسي. لتحديد العلاقة بين كثافة الجذر التربيعي وحجم الليبوزومات، حساب عامل التصحيح بقسمة متوسط قطر الليبوزوم التي تم الحصول عليها من قياسات تشتت الضوء الديناميكي مع الوسط الهندسي لكثافة الجذر التربيعي.

حساب قيم كثافة الجذر التربيعي للليبوسومات في تجربة عدم الفهم التركيبي وتحويل هذين القطرين عن طريق ضرب مع عامل التصحيح. رسم قيمة نسبة كثافة كدالة القطر للليبوسومات غير التركيبية، وبالتالي تحقيق عدم فهم كدالة حجم الليبوزومات لسكان liposomes تمتد من حوالي 50 نانومتر إلى 800 نانومتر. في هذا البروتوكول ، كان نجاح تثبيت سطح الليبوسومات واضحًا فورًا عند إضافة محلول liposome إلى الغرفة المشار إليها من قبل بقع الكثافة المحدودة.

فمن المستحسن لشل ما يكفي من liposomes لتحقيق كثافة من 300 إلى 400 liposomes في الإطار الواحد. إن انخفاض الكثافة يجعل تحليل البيانات أكثر استهلاكًا للوقت في حين أن الكثافة الأعلى تجعل التمييز بين الدهون الدهنية المفردة أمرًا صعبًا. إذا لم يكن مجال الرؤية بأكمله في التركيز الصحيح، قد تكون لوحة العينة مائلة.

أيضا، إذا كان يبدو liposomes كبيرة وضبابية، وهذا يشير إلى أن العازلة في الغرفة قد تبخرت وسطح جفت. عادة ما تكشف نسبة الكثافة توزيع الغاوسي حول قيمة متوسط نسبة. إذا لوحظت انحرافات قوية عن توزيع الغاوسي، فإنه يشير إلى مشكلة حساسية الكشف مما يشير إلى أنه تم استبعاد مجموعة فرعية من الليبوزومات التي تظهر إشارة أضعف.

بعد تركيب الرسم البياني نسبة كثافة مع وظيفة غاوسية، تم ترجمة درجة من قيمة 0.23 homogeneity 0.23 إلى 32٪ من السكان تختلف بأكثر من 23٪ من متوسط نسبة المولى من الفرقة. وتبين أن القياس الكمي لعدم اليقين التجريبي هو 0.1. فإن المقايسة أبدا الحصول على أفضل من المواد التي تستخدمها عالية الجودة ليبوسومات unilaminar ضرورية.

حتى عند إعداد هذه، لا قطع أي زوايا مثل ترك خارج دورات التجميد ذوبان الجليد. سوف تؤدي الصور السيئة إلى عدم اليقين التجريبي العالي وتجعلك تبالغ في تقدير عدم الاتّهان لذا خذ الوقت للحصول على صور جيدة في التركيز. ما يفعله الفحص بشكل أساسي هو دراسة كثافة سطح علامة الفلورسنت.

إذا كان هذا الملصق الفلورسنت على الدهون متغلغلة، ثم يمكن استخدام هذا الفحص لاختبار ليبوسومات جودة لتسليم المخدرات. وقد تم تطبيق الإعداد لدراسة كيفية ربط الببتيدات إلى الأغشية والشعور الانحناء. وقد أعطى هذا الباحثين رؤى فريدة من نوعها إلى الإشارات الجزيئية التي تحكم كيفية فرز الببتيدات داخل الخلايا.