تطوير نموذج تجريبي غير باضع بمساعدة الليزر لفقدان الخلايا الانهوفية القرنية

تركز نماذج المرض الحالية لفقدان الخلايا البطانية القرنية على تدمير بطانة الغدد العضلية وعلى الأرجح تمثل المراحل النهائية للمرض عندما يكون زرع القرنية أمرًا حتميًا. ومع ذلك، تتوفر الآن علاجات جديدة باستخدام الخلايا الجذعية أو العلاج الجيني يمكن أن تكون أكثر فائدة للمراحل المبكرة من المرض، والتي تفتقر إلى النماذج. جراحة العين غير الباضعة عن طريق التصوير الضوئي باستخدام ليزر Nd:YAG أصبح إجراء روتيني لأطباء العيون.

بعد الحصول على عيون بورسين مُنْخَب حديثاً من المسلخ المحلي، ضع العينات في أربع درجات مئوية متوسطة كاملة. استخدام مقص لإزالة الأنسجة خارج الخلية ونقع العينين في 5٪ povidone اليود محلول العيون لمدة خمس دقائق. بعد ذلك، ضع العينات المطهرة في برنامج تلفزيوني معقمة في درجة حرارة الغرفة.

باستخدام جهاز التصوير المقطعي البصري للنطاق الطيفي ، افحص العينين للأمراض الرئيسية في الجزء الأمامي مثل تندب القرنية والوذمة والعتامات الأخرى. بعد الفحص، ضع العينين أمام وحدة مصباح زلة مجهزة ليزر Nd:YAG مع طول موجي من 1، 064 نانومتر وقطر بقعة محورية من 10 ميكرومتر في الهواء. حدد التكبير 12X وحرف الإضاءة لتصور طبقات القرنية الفردية.

بعد وضع طاقة النبض والتركيز تشير إلى المعلمات المناسبة للاستئصال الانتقائي للخلايا البطانية القرنية، وتطبيق عدة طلقات ليزر على الأنسجة. ثم تحت المجهر تشريح، وضع القرنية شفافة واضحة على مقربة من limbus وحقن الفيسكويلاستيك لتحقيق الاستقرار في الغرفة الأمامية. ثم استخدام 000 000 000 10000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000

عندما تم جمع كل من القرنيات، إضافة ثلاثة ملليمترات من المتوسط الكامل لكل عينة جيدا واحتضان العينات لمدة تصل إلى ثلاثة أيام في 37 درجة مئوية. في نهاية الحضانة، استبدال المتوسطة في كل بئر مع الميثانول خالية من 4٪ شبهformaldehyde في العازلة سورنسن لاحتضان 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. في نهاية الحضانة، ضع العينات الثابتة في 20٪ سكروز في برنامج تلفزيوني لمدة ساعة واحدة تقريبا حتى تغرق القرنيات.

نقل العينات إلى 30٪ السكروز في برنامج تلفزيوني بين عشية وضحاها قبل تضمين الأنسجة في درجة حرارة القطع المثلى للتخزين في ناقص 80 درجة مئوية. استخدام مجموعة التبريد إلى ناقص 27 درجة مئوية للحصول على 10 ميكرومتر سميكة أجزاء من الأنسجة المجمدة جمع كل قسم على شريحة المجهر في غضون دقيقة واحدة من الحصول عليها. ثم تخزين الشرائح في ناقص 80 درجة مئوية حتى تلطيخ.

للهماتروسيلين ويوسين تلطيخ، والهواء الجاف الأجزاء المجمدة لعدة دقائق لإزالة الرطوبة قبل تلطيخ مع تصفية 0.1٪ الهماوكسيلين ماير لمدة 10 دقائق في أنبوب 50 ملليلتر. في نهاية الحضانة، شطف الشرائح في الماء المقطر مزدوجة لمدة خمس دقائق في cuvette. بعد ذلك، تراجع الشرائح في 0.5٪ eosin 10 مرات، تليها تراجع الشطف في الماء المقطر مزدوجة حتى توقف eosin streaking.

تراجع الشرائح المشطفة 10 مرات في 50٪ الإيثانول و 10 مرات في 70٪ الإيثانول. بعد تراجع الإيثانول 70٪ الماضي، اكويئية الأقسام في 95٪ الإيثانول لمدة 30 ثانية، تليها 60 ثانية في 100٪ الإيثانول قبل عدة تراجعات في إكسيلين. ثم جبل العينات مع الأغطية قبل الحصول على الصور على المجهر الخفيف.

يجب تقييم صورتين ضوئيتين وصورة مجهرية خفيفة بشكل مستقل على أنه لا ضرر أو ضرر كبير أو كمية صحيحة من الضرر. وبناء على هذه التقييمات، يمكن بعد ذلك حساب خريطة حرارية لتحديد الكوكبة الصحيحة من معلمات الليزر للاستئصال الانتقائي للخلايا البطانية القرنية مع الحد الأدنى من الضرر الذي يلحق بالأنسجة المحيطة. وقد حدد التحليل السابق أن النقطة المحورية بالليزر يجب أن تكون على الأقل 0.15 ملليمتر وراء الدوس القرنية لأدنى طاقة نبض اختبارها.

بالنسبة لطاقات النبض أعلى من 2.9 ملليجول، فإن أطول مسافة بؤرية تم اختبارها لا تزال قريبة جدًا من بطانة الغدد. يمكن اختبار مختلف العوامل cytoprotective بينما عينات ختان في الثقافة. إذا ثبت نجاحها، يمكن إضافتها إلى محلول الري للعلاج.